表面等离子体共振（SPR）是一种无需标记、可实时检测生物分子相互作用的方法。本文描述了一项膜蛋白与受体相互作用实验的实验方案，并讨论了该技术的优缺点。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用在大多数（即使不是全部）生理过程中都至关重要，理解这些相互作用的本质是生物学研究的核心步骤之一。表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一种高灵敏度的检测技术，可用于实时、无标记地研究生物分子间的相互作用。在典型的SPR实验中，其中一个组分（通常为一种蛋白质，称为“配体”）被固定在传感器芯片表面，而另一个组分（“分析物”）则游离于溶液中，并被注入流经该表面。分析物与配体之间的结合与解离过程被实时监测，并以传感图（sensogram）的形式绘制成曲线，从中可获取达到平衡前及平衡状态下的相关数据。由于SPR技术无需标记、样品消耗量少，并能提供平衡前的动力学数据，因此在研究蛋白质相互作用动态过程时，常成为首选方法。然而需要注意的是，由于该方法具有很高的灵敏度，所获得的数据必须经过仔细分析，并需结合其他生物化学方法加以验证。
表面等离子共振（SPR）特别适用于研究膜蛋白，因为它消耗的纯化材料量少，并且与脂质和去垢剂相容。本方案描述了一项SPR实验，用于表征膜蛋白（ABC转运蛋白）与可溶性蛋白（该转运蛋白对应的底物结合蛋白）之间相互作用的动力学特性。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）；蛋白质复合物的形成与解离，是多种生物过程中的关键事件例如复制、转录、翻译、信号传导、细胞间通讯）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的半定量研究通常通过下拉实验（pull-down）或免疫共沉淀实验（immuno-precipitation）进行。然而，由于这些（及类似）技术本身包含洗涤步骤，其可检测的亲和力范围受限（通常仅限于低微摩尔及更高亲和力），因而无法识别那些虽为瞬时或低亲和力、却常具有重要生物学意义的相互作用。此外，此类“终点法”技术的时间分辨率极低，通常比反应实际速率慢数个数量级。表面等离子共振（SPR）技术因其更高的灵敏度和优异的时间分辨率，能够克服上述局限性。1,2表面等离子体共振（SPR）是一种无标记检测方法，因此只要能够检测到质量变化，即可用于测量分子间相互作用。除了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）外，该技术还被广泛用于表征蛋白质-配体、蛋白质-药物（或小分子）、蛋白质-DNA以及蛋白质-RNA相互作用。 3-5结果被实时记录并绘制成图，从而能够快速调整实验条件并灵活设计实验方案。
基于表面等离子共振（SPR）技术的仪器所依据的物理原理是利用光学系统检测传感器表面因质量变化引起的折射率改变2。其中一个相互作用的分子（以下简称配体）被固定在聚合物基质芯片上，另一个分子（以下简称分析物）则流经该表面。分析物与配体的结合会改变芯片表面的质量，这种质....
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方案
1. 蛋白质样品与缓冲液的制备
- 样品制备：纯化目标蛋白，并通过在实验前将蛋白上样至凝胶过滤柱或进行超速离心（通常在100,000 × g下离心10分钟即可）以确保去除所有聚集体。
注意：尽管高纯度的蛋白质样品是理想选择，但并非必需。表面等离子共振（SPR）技术已成功应用于纯度不够理想的情况，甚至可直接使用总提取物。8,9. - 缓冲液制备：
- 准备实验缓冲液（称为“运行缓冲液”或 RB）。对于本方案中描述的实验，使用 50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl 和 0.05% (w/v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltoside)。需注意，缓冲液成分的选择可根据所研究的体系进行相应调整。
- 使用 0.22 µm 滤膜过滤所有缓冲液和蛋白质样品。务必提前确认滤膜适用于蛋白质。通常情况下，近期上市的 SPR 平台均配备在线脱气装置；若无此装置，则在使用前对缓冲液进行脱气处理。
- 过夜透析或用RB稀释样品，以避免缓冲液不匹配。当使用高黏度化学试剂时，尤其建议进行透析（或其他缓冲液置换方法）。例如，蔗糖、甘油、DMSO）。在将RB瓶连接至泵入口之前，先另取10 ml RB置于单独的离心管中。
- 将浓缩的配体储备液用RB缓冲液稀释至终浓度约为20 µg/ml。作为经验法则，为实现稳定的配体固定化，应采用....
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结果
在本文所述系统中，使用 NiNTA 芯片固定带有 His 标签的膜转运蛋白 6,7由于是同源二聚体，每个转运蛋白均带有双重标签，从而增强其与NiNTA芯片的结合。在镍离子负载后，将配体A（目标转运蛋白）固定于Fc=2通道，直至约3,500 RU（程序循环2， 图2A 黑色标签）。随后，在相同的流速和进样时长下，将配体B（对照配体）注入Fc=1，初始结合水平仅达到约3,000 RU。为确保两个流通池中固定化的蛋白量相近，继续采用较短时间进样方式向Fc=1加载配体B，并密切监测固定化过程，直至达到3,500 RU。图中“阶梯”状曲线表示每次进样后Fc=1上质量逐步增加的情况图2A 灰色标签）。在线监测 Fc=2-1 有助于控制配体的均等加载。 图 2B 演示 Fc=2-1 相减方法， 即，通过从 Fc=1 中 RU 值的逐步增加量中减去 Fc=2 中的最大 RU 值。重要的是，应调整配体注射的持续时间，以实现待研究配体与对照配体的等量负载。相反，在注射分析物时，所有使用浓度的注射持续时间必须保持一致。.......
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讨论
表面等离子体共振（SPR）是一种研究分子相互作用的高度敏感方法，通常是唯一能够实时监测瞬时（但重要）相互作用的技术。本文所展示的瞬时相互作用即为一例，该相互作用无法通过其他任何方法（如pull-down实验、脂质体沉降实验6）检测到。此外，尽管其他方法仅限于平衡状态的测量（无论是定量还是定性），SPR却是少数能够同时测量平衡前动力学的实验技术之一。
其高灵敏度同时也是其需要注意的局限性。假阳性传感图谱很容易被记录下来。因此，建议在进行 SPR 测量之前，先使用其他方法验证相互作用的存在。事先了解系统的特性（如对 KD 的粗略评估、稳定结合与瞬时相互作用的区别）对于设计 SPR 实验以及评估所获得数据的功能相关性非常有帮助。在开始 SPR 测量前需要特别注意的一个问题是蛋白质样品的质量。SPR 对聚集物高度敏感，因此必须从配体和分析物的制备物中去除聚集物（尽可能通过凝胶过滤层析或超速离心法）。另一个噪声和假信号的来源可能是运行缓冲液（RB）与分析物缓冲液之间的不匹配。这一问题可通过将分析物对运行缓冲液进行.......
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披露
所有作者声明均无竞争性经济利益。
致谢
Lewinson 实验室的研究工作得到了以色列科学学院、Rappaport 生物医学研究所、MerieuX 研究基金会以及 Marie Curie 职业回归资助（OL）的资助。EV 获得了 Fine 奖学金和以色列理工学院医学院的资助。NLL 得到了以色列科学学院资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| NTA传感器芯片 | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 软件 | GE Healthcare | ||
| 氯化镍 | Sigma | N6136 | |
| 二水合钨酸钠 | Sigma | T2629 | |
| 氯化钠 | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma 碱 | Sigma | T1503 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA） | Sigma | E5134 | |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷（DDM） | Affymetrix | D310 | |
| 十二烷基硫酸钠溶液 | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 盐酸 | GADOT | 7647-01-0 | |
| 尼龙（NY）膜过滤器 | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC 转运蛋白 | Lewinson 实验室 | ||
| RbsBC ABC 转运蛋白 | Lewinson 实验室 | ||
| ModA 底物结合蛋白 | Lewinson 实验室 |
参考文献
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. ....
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重印与许可
