全血细胞毒性检测（WCA）是一种将高通量细胞定位技术与荧光显微镜和自动图像处理相结合而开发的细胞毒性检测方法。本文描述了如何在人全血中实时分析经抗CD20抗体处理的淋巴瘤细胞，以提供定量的细胞毒性分析结果。
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本文内容
摘要
摘要
本研究开发了一种基于活细胞的全血细胞毒性检测法（WCA），结合高通量细胞定位技术，可获取整体细胞毒性的动态时间信息。首先将靶向的肿瘤细胞群体预编程并固定为阵列格式，并用绿色荧光细胞质染料进行标记。细胞阵列形成后，加入抗体药物与人全血的混合物。随后加入碘化丙啶（PI）以评估细胞死亡情况。通过自动成像系统对细胞阵列进行分析。其中，细胞质荧光染料标记靶向肿瘤细胞群体，而PI标记死亡的肿瘤细胞群体。因此，通过计算存活靶细胞与死亡靶细胞的数量比例，即可量化靶癌细胞的杀伤百分比。该方法使研究人员能够获得具有时间依赖性和剂量依赖性的细胞毒性信息。值得注意的是，该方法无需使用任何有害的放射性化学物质。本文所展示的WCA已用于淋巴瘤、白血病及实体瘤细胞系的检测。因此，WCA使研究人员能够在高度贴近生理的ex vivo条件下评估药物疗效。
引言
近年来，制药行业的进步使得人们对肿瘤细胞抗体的特异性鉴定及个体化癌症治疗产生了日益浓厚的兴趣；然而，这一过程仍面临诸多障碍。在临床前研究中具有抗癌活性的药物中，仅有5%在II-III期试验中显示出足够疗效后获得批准。1,2。临床前策略（两者均 体外 和 体内在许多实例中已表明，由于人与实验动物的血液成分不同，抗肿瘤药物在两者体内的表现存在差异，因此将实验动物作为模型的效果并不理想3-5.
为满足抗肿瘤药物筛选平台的需求，并在耗资巨大的动物实验和临床试验之前提供一个评估节点，本文提出了一种人全血细胞毒性检测法（WCA），用于在更贴近生理的生物环境中评价抗肿瘤药物的疗效。该全血细胞毒性检测法可用于评估人全血中单个细胞对抗体及其他候选药物的反应。
WCA 通过将高通量细胞定位技术与高通量、高内涵成像技术相结合而开发而成6。利用自动化成像系统，可高度精确地测定活细胞和死细胞的数量。由于靶细胞被固定在同一焦平面上，WCA 能够在无需去除红细胞的情况下，实时提供定量的细胞毒性分析结果。此外，该自动成像系统具备多项优势，例如仅对达到特定标准（如：荧光标记的细胞及细胞形态）的靶细胞进行门控和处理。同时，该系统每天可处理多达 144 块培养板。因此，这种成像能力和通量使得高内涵与高通量实验能够同时进行。通过将 WCA 与自动化成像系统结合，可在更接近生理条件的环境中实现高通量的定量细胞毒性分析。
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方案
1. 靶细胞制备
- 维持靶细胞（例如. 在生长培养基（RPMI 1640 培养基，含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、4 nM L-谷氨酰胺和 500 IU/mL 青霉素/链霉素）中，于 37 ℃ 培养 Raji 淋巴瘤细胞oC，置于5% CO₂环境中2 培养箱
- 将样品在15 ml离心管中离心，以沉淀目标细胞。离心时间因细胞类型而异；Raji细胞在468 × g下离心3 min。
- 首先吸除上清液表面形成的任何气泡，并完全移除上清液。
- 向离心管中加入10 ml PBS，通过反复吹打溶液数次重悬细胞，以分散细胞团块。
- 将样品在468 × g下离心3分钟。
- 吸除上清液表面形成的任何气泡，并完全移除上清液。
2. 细胞微阵列的制备
- 获取细胞贴壁96孔板试剂盒或单细胞阵列8孔腔室载玻片（参见材料/试剂表）。
- 向试剂盒中的DNA试剂加入1.2 μl 激活剂。盖紧瓶盖，倒置并轻轻振荡以混匀溶液。
- 室温下静置反应20分钟。
- 将混合后的溶液加入目标细胞沉淀（位于15 ml离心管中）。
- 加入绿色荧光细胞质染料，终浓度为500 nM。
- 将目标细胞与混合溶液及染料在室温下置于旋转摇床上孵育30分钟。
- 用5 ml PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于10 ml培养基中。
- 取步骤2.7中的溶液100 µl加入每个孔中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，确保每孔细胞数量在5×104至1×106个之间。
- 室温孵育10-15分钟后，用200-300 µl培养基轻轻洗涤样本两次，以去除未结合的细胞。
注意：每次洗涤后，每孔中约残留5-10 µl培养基。
3. 全血细胞毒性检测
- 向每个样品孔中加入 180 μl 人全血。
- 取浓度为 5 mg/ml 的抗 CD20 抗体溶液，进行系列稀释，配制成 50、20、10、5、2、1、0.5 μg/ml 的抗 CD20 抗体溶液（使用 1.5 ml 离心管）。向每个样品孔中分别加入 20 µl 各浓度的抗 CD20 抗体，每组设三个复孔。
- 向每孔中加入碘化丙啶，使其终浓度为 500 nM。
- 将培养板置于 37°C、5% CO2 条件下孵育 16 小时。
- 使用自动成像系统（放大倍数 8X）对载玻片或 96 孔板中的细胞进行成像。
- 使用自动成像系统的细胞计数程序对结果进行定量。
注意：自动成像系统的软件提供简单的逐步操作指引用于细胞计数。该软件的使用方案可在供应商网站获取。 - 在软件主页面选择[查看结果]。
- 选择[保存的样品文件]。
- 首先设定 FITC 平均荧光强度 >50 的门控，然后设定 TxRed 平均荧光强度 >20 的门控。
- 选择[板图概览]。
- 选择[导出表格]。
注意：程序的靶细胞杀伤百分比计算公式如下：
% 靶细胞杀伤率 =（同时呈绿色和红色染色的细胞数 / 呈绿色染色的细胞总数）×100%
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结果
选择抗 CD20 抗体和淋巴瘤细胞（Raji 细胞和 MC/CAR 细胞）作为模型系统，以演示全血细胞毒性试验（WCA）7,8。Raji 细胞在细胞表面具有高拷贝数的 CD20，而 MC/CAR 细胞在其膜上具有低拷贝数的 CD20。首先用绿色荧光胞质染料将靶细胞染成绿色，并将其排列在 96 孔板中。每孔固定 10,000 - 50,000 个靶淋巴瘤细胞。向每孔加入 180 µl 新鲜采集的人类全血。然后将抗 CD20 抗体以梯度浓度加入 96 孔板的各孔中。在 37°C 下孵育 16 小时后，通过自动成像仪分析绿色荧光细胞和红色荧光细胞的数量，对细胞数量进行定量评估。由于靶淋巴瘤细胞均排列在同一焦平面上，即使不移除孔中的血细胞，也可直接检测每个细胞的荧光信号。
如图1所示，对靶向的Raji淋巴瘤细胞（包括活细胞和死细胞）进行了检测。图1中的绿色点表示存在的靶细胞数量。图1中的死细胞（红色点）通过红色荧光强度进行定量分析，因为这些细胞被PI染色呈红色荧光。抗...
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讨论
WCA 是一种具有单细胞分辨率的关键 体外 抗癌药物筛选工具12-16，通常在 CDC 和 ADCC 等传统靶标筛选实验9-11之后、临床前动物实验之前使用。目前，CDC 或 ADCC 等主要靶标筛选实验均在简化的培养基或缓冲体系中进行。然而，在这些简化缓冲体系中显示有效性的候选药物，在更复杂的全血体系中并不总是有效。因此，WCA 可以弥合传统靶标筛选与昂贵的动物研究之间的差距，减少假阳性结果，从而避免动物实验或人类临床试验中可预防的失败。WCA 将有利于从事临床前研究的研究人员，在人全血环境中检测药物疗效。使用流式细胞术计数死细胞和活细胞时，需要完全裂解红细胞以检测靶细胞。WCA 技术相较于流式细胞术的优势在于，无需裂解红细胞即可识别靶细胞。在血液样本中完全裂解所有红细胞较为困难，且在裂解过程中靶细胞也可能部分被裂解。
如果能够利用从个体患者获取的活体原代细胞构建筛选面板，则将带来更加令人振奋的机遇，从而为个性化癌症治疗、评估特定肿瘤内部的细胞异质性以及鉴定对特定药物治疗具有耐药性的细胞铺平道路。将医疗体系转向“以患者...
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
感谢美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所IMAT项目对本工作的资助 [R33 CA174616-01A1]。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞黏附96孔板试剂盒 | Adheren | AP9601 | |
| 悬浮单细胞阵列8孔腔室载玻片 | Adheren | SS0801 | |
| 贴壁单细胞阵列8孔腔室载玻片 | Adheren | SS0802 | |
| 淋巴瘤细胞系 CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji 细胞 |
| 淋巴瘤细胞系 CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | Life Technologies | 11875-119 | |
| 胎牛血清 | Thermo | SH30070.01HI | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15070063 | |
| 胞质染料 | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan（生物类似药） | Eureka Therapeutics | ||
| 人全血 | Allcells | WB001 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170-10MG | |
| 自动成像系统 | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| 细胞计数程序 | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
参考文献
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重印与许可
