注意力集转移任务：小鼠认知灵活性的一种测量方法

摘要

本实验方案旨在通过执行注意力集转移任务（AST）等行为学检测，评估小鼠前额叶皮层介导的认知灵活性。

摘要

认知功能障碍，特别是前额叶皮层（PFC）神经环路功能异常，是多种神经精神疾病和神经发育障碍的核心特征，包括抑郁症、创伤后应激障碍、精神分裂症和自闭症谱系障碍。认知功能缺陷也是最难有效治疗的症状维度 ，因为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂和三环类抗抑郁药仅能产生有限的疗效。功能性神经影像学研究和人类脑组织尸检分析均表明，PFC是这些疾病患者中主要的调控异常脑区。然而，用于评估小鼠模型中此类缺陷的临床前行为检测方法尚未得到充分利用，而这些小鼠模型在遗传上易于操控，可为探索新的治疗途径提供基础。本文描述了一种行为检测方法——注意力集转移任务（AST）——在小鼠中的适应性应用，用于评估由前额叶皮层介导的认知缺陷。AST过程中行为所依赖的神经环路在人类、非人灵长类动物和啮齿类动物中高度保守，具有良好的表面效度、构念效度和预测效度。

引言

注意力集转移任务（AST）是十多年前开发的一种用于评估大鼠注意力和认知灵活性的方法^1,2。AST 借鉴了剑桥神经心理测试自动化电池（CANTAB）中的维度内/维度外成分，后者用于识别人类及非人灵长类动物的认知功能障碍^3,4。尽管学习简单规则的能力保持完整，但在规则发生变化时调整反应的能力受损，这一现象见于多种神经精神疾病患者（例如，精神分裂症、强迫症、抑郁症）、神经退行性疾病患者（例如，帕金森病）以及前额叶皮层受损的患者⁵。更广泛地说，这些患者被认为存在认知灵活性缺陷。在非人灵长类动物和啮齿类动物中，当前额叶皮层被人为造成损伤时，也表现出类似的缺陷^1,6-8。这些缺陷表明存在认知僵化状态，即注意力集转移能力受损。

当受试者学会将一组规则应用于复杂刺激以区分相关线索与无关线索时，便形成了注意定势。例如，在AST中，动物将学会关注并响应相关线索（即， 挖掘培养基）并忽略无关线索（即， 气味），通过将食物奖励与介质配对实现。随后的任务中，尽管挖掘介质和气味的类型会发生变化，但介质与奖励之间的配对关系保持不变，从而强化这一关联。这种被强化的规则形成了一种认知定势。AST 实验方案中的两个阶段用于测量该认知定势的若干方面 认知灵活性：逆转与跨维度转换。在逆转阶段，先前维度中的阴性刺激（本例中为介质）变为阳性刺激，这要求动物忽略前一阶段的阳性刺激。例如，如果在前一阶段，触感粗糙的挖掘介质为阳性刺激，纸张为阴性刺激，那么现在情况相反。这一过程考验动物的认知灵活性，即其必须保持注意力定势（即， 中相关维度发生改变时，对刺激与奖励配对在该维度内的规则进行调整。在跨维度转移阶段，原本无关的维度（本例中为气味）变为相关维度，此时对注意集的形成构成挑战。在任一阶段中，若个体仍持续依据先前习得的规则做出选择，表现出perseverative反应，则反映其认知灵活性存在缺陷。

在非人类灵长类动物和啮齿类动物中进行的损毁研究显示，前额叶皮层的特定区域与执行AST各个阶段的能力相关^1,9。前额叶皮层（PFC）的一个亚区——眶额皮层（OFC）的损毁已被证明会导致在AST上反转学习能力的缺陷⁸。此外，内侧前额叶皮层（MPFC）的损毁会导致执行跨维度转换时出现特定困难。

尽管已有大量研究在大鼠和非人灵长类动物中使用AST，但相对较少的研究将AST作为小鼠认知功能的评估指标。鉴于小鼠遗传操作的便利性，以及在研究多种疾病时对前额叶皮层功能进行测量的迫切需求，将这一行为学测量方法在小鼠中进行改编和验证，对于与前额叶皮层功能障碍相关疾病的研究具有重要意义。本文详述的方案是对Birrell和Brown¹所建立方法的改进，优化了其在小鼠中的应用，并整合了此前已报道的多种针对小鼠的特异性调整措施^2,6,10-13。

方案

注意：本研究使用的动物为 4 至 6 月龄的雄性 C57Bl/6J 小鼠，以获得最佳实验结果。小鼠维持在反转光照周期下饲养，以便在活跃期（黑暗期）方便地进行实验测试。若行为学实验在与饲养区域不同的房间进行，小鼠在转运至实验房间后需至少适应 1 小时。行为学测试在红光条件下进行，以尽可能减少对小鼠正常活动节律的干扰，同时仍为实验人员提供足够的照明以目视监控实验过程。

注意：本文所述实验操作的所有方面均遵循《实验动物护理与使用指南》第8版（NRC）的规定，并已获得圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 实验设置

1. 将陶瓷烤碗（无孔；深度1.5英寸，直径2.5英寸）内装入挖掘介质至内缘（距底部约1英寸）；将滤纸圆片对半剪开，并粘贴于烤碗内壁后侧（图1A）
2. 将微甜的干早餐谷物（作为食物奖励）——如蜂蜜坚果味或糖衣类——掰成约20 mg的小块，用于适应、训练和测试阶段。
3. 制备注意力集转移任务（AST）实验箱（图1B）：每只小鼠在独立的实验箱中进行适应、训练和测试；建议至少制作8个实验箱。
   1. 构建一个12英寸×8英寸×7英寸的AST实验箱；箱壁和起始门采用不透明白色亚克力材料，便于用70%乙醇清洁。采用可拆卸的活板门式起始门，将实验箱分隔为等候区（5英寸×8英寸）和测试区（7英寸×8英寸）。
   2. 在测试区中部安装一个5英寸×7英寸的透明可拆卸隔板，将测试区均分为两侧；在隔板底部钻三个直径¼英寸的孔洞，间距1英寸，距隔板前缘1英寸，以便小鼠嗅探交流（图1C）。

2. 实验步骤概述（图2）

1. 在进行AST之前，将家鼠单独饲养，并使其适应反向光照周期至少一周。
2. 在独立的测试箱中对每只动物进行适应、训练和测试。每个测试箱固定分配给一只小鼠，并在完成最后一天测试后用70%乙醇清洁，以减少测试过程中的应激反应，使测试箱的气味接近“家笼”或“自身”气味。
3. 在测试前2天对测试杯进行加香处理，以便让气味充分消散；小鼠不会在气味过强的杯子中挖掘。使用带有25 G 针头的注射器，向滤纸顶部加入约0.1 ml的精油。

3. 处理（第1-8天）

1. 从食物限制的第一天起，提前8天开始抓握小鼠。这将减少在测试期间因抓握带来的应激反应。
2. 每天抓握时称重并记录小鼠的体重。每只小鼠每天抓握2-3分钟 。
3. 如果有多位实验人员参与同一批小鼠的测试，应确保每位实验人员均参与抓握过程，以增加小鼠对实验人员的熟悉度，从而减少训练或测试日的应激和焦虑。
4. 在整个测试期间持续进行抓握操作并记录体重。

4. 食物限制（第9-12天）

1. 从适应期开始前4天起，将小鼠置于限制性饮食条件下，使其体重维持在自由进食小鼠体重的80-85%。 每只小鼠每天给予1克食物。若体重低于规定范围，则每天给予2克，直至体重恢复至正常范围。
2. 在每个家庭笼具的前方放置2个烤盅，以便小鼠适应测试用的容器。这些位置与训练小鼠挖掘以获取食物奖励时所使用的位置相同。
3. 每天向每个小烤碗中加入2克食物和1份食物奖励（每份为半片麦片），持续4天。
4. 若行为实验需在与小鼠饲养房间不同的房间进行，从食物限制第1天开始，将小鼠转运至测试房间至少1小时 每天返回饲养室前，使其适应测试室环境。
5. 在食物限制的最后一天、适应性训练开始之前，更换动物笼具中的垫料。为减少训练和测试期间动物经历的压力或焦虑，此后将不再更换垫料，直至测试完全结束（除非绝对必要）。
6. 在测试结束前持续对小鼠进行食物限制。在第13至17天，给予小鼠食物 之后 基于所消耗食物奖励量的估计进行适应、训练或测试（通常 <1克食物颗粒

5. 驯化（第13-14天）

1. 在开始训练前2天，于暗周期期间在红光下进行适应性训练。
2. 在实验箱内铺撒少量来自动物饲养笼的脏垫料，通过引入熟悉的“饲养笼”或“自身”气味，降低小鼠在新环境中产生的应激反应（同一只小鼠在整个训练和测试期间均使用同一个实验箱）。
3. 在实验箱的等待区域放置一个装有水的洁净小烧杯；小鼠在无法获得饮水的情况下通常不会进食。
4. 将之前用于食物限制的两个小烧杯放置在测试区域，每个烧杯中放入一份食物奖励（约20 mg的谷物碎片）。
5. 将小鼠放入等待区域；移除起始门，允许小鼠自由探索实验箱1小时。
6. 持续向空的小烧杯中添加食物奖励（约20 mg的谷物碎片），以鼓励小鼠频繁探索测试区域及烧杯。
7. 确保在整个适应期间小鼠能够看到实验操作人员，以避免在正式测试时实验人员的出现成为额外的应激因素。

6. 训练（第15天）

1. 将小鼠放置在等待区域。
2. 将空的小陶瓷杯（每个内含一份食物奖励，约 20 mg 谷物碎片）放入测试区域，并升起起始门。允许小鼠在 3 min 内取回两份食物奖励。重复此步骤数次。
3. 在后续试验中逐步向容器中添加木屑/小鼠笼垫料。每次试验中，允许小鼠用 3 min 从每个容器中取回食物奖励后再结束试验。一旦小鼠从每个容器中成功取回食物奖励，即可进行下一次试验。如果食物奖励被部分覆盖后小鼠未尝试挖掘，可给予提示（例如，在食物奖励所在区域撒少量谷物粉末，或在木屑表面食物位置处压出凹痕，或暴露部分食物奖励）。
4. 每次试验后继续添加木屑/垫料，直至食物奖励完全被覆盖，且小鼠能够稳定表现出在装满的容器中挖掘以找到食物奖励的能力。
5. 如果小鼠在训练开始后 2 hr 内未能稳定表现出在装满的容器中找到食物奖励的能力，则继续进行第二天的训练。保持小鼠处于食物限制状态，并于次日重复该训练程序。
6. 如果小鼠连续两天均未尝试挖掘以获取食物奖励，则将其排除在后续实验之外，并在实验记录中标注为“未能挖掘”。

7. 检测（第16-17天）：

1. 第一天，进行简单辨别（SD）、复合辨别（CD）、反转（R1）和内维度转移（IDS）测试。
2. 第二天，进行内维度转移2（IDS2）、内维度转移3（IDS3）、反转2（R2；可选）和外维度转移（EDS）测试。
3. 按照表1所示配对介质与气味。
4. 在测试当天抓取小鼠时，给予其一次食物奖励，以避免因饥饿导致测试过程中注意力不足。自此直至测试日结束，除正确选择后的奖励外，不再提供任何食物。
5. 测试开始时，使用镊子（以限制不同容器间气味的扩散），将一块食物奖励放入指示正确选择的容器中。食物奖励应被介质完全覆盖（见图3）。为避免食物奖励产生气味线索，在每个阶段开始时，向所有容器表面撒上谷物粉尘。
6. 将小鼠放入起始区，并关闭起始门。将两个容器放置在测试腔体的两侧。当移除起始门并启动计时器时，试验开始。每只小鼠每次试验有3分钟 的时间做出选择。记录每次试验的选择结果（正确或错误）以及小鼠做出选择所用的时间。
   注意：所谓“选择”，是指小鼠尝试在任一容器中挖掘的行为。只有当小鼠已拨开介质，并将鼻子深入所形成的空隙中以寻找食物奖励，或已拨开足够多的介质使食物奖励暴露时，才记录为一次有效选择。若小鼠在3分钟内未做出选择，则记为无选择（错误）。
7. 一旦小鼠对任一容器做出选择，立即将未被选择的容器从测试腔体中移除。如果选择正确，在将小鼠放回等待区前，允许其吃完食物奖励；如果选择错误，在将小鼠放回等待区前，允许其探索该容器，以确认其中无食物奖励。
8. 每次试验结束后，将小鼠放回等待区，并重新安装起始门。
9. 确保小鼠连续完成8次正确试验，方可进入AST的下一阶段。若小鼠在50次试验内未能连续获得8次正确选择，则判定该阶段失败，无法继续完成后续测试。连续6次无选择（3分钟 内未做选择）视为未能参与测试，禁止进入下一阶段。

结果

该测试中典型的因变量是每个阶段达到标准所需的试验次数（或连续8次正确选择）。图4A展示了使用AST时，未经处理的C57BL/6J小鼠在每个阶段达到标准所需的平均试验次数。随着小鼠对相关线索维度（气味或介质）形成注意力集，其表现将有所提升，表现为在连续的维度内转换阶段中达到标准所需的试验次数减少；而反转阶段和维度间转换阶段则需要更多的试验次数才能达到标准。重要的是，应平衡起始于两个相关维度（即介质或气味）的动物数量，因为我们观察到在简单辨别阶段存在一些差异：当气味为相关线索时，达到标准所需的试验次数更多（图4B）。如果在SD阶段达到标准所需的试验次数在两个相关线索维度之间存在显著差异（即当介质为相关线索时表现更优，如图4B所示），则可在后续阶段将每只小鼠的表现数据标准化为其在简单辨别阶段的表现。如图4C所示，该标准化步骤可降低与学习初始相关线索相关的变异性，并增强后续IDS阶段表现提升的可视化效果。尽管每组约20只小鼠的样本量已足以在无需标准化的情况下分析原始数据。重要...

讨论

前额叶皮层（PFC）介导的认知灵活性缺陷是多种神经及神经精神疾病相关的重要功能障碍，可显著影响患者的预后及生活质量。优化AST在小鼠中的应用，对于研究与前额皮质介导的认知功能障碍相关疾病的遗传基础至关重要。我们发现，上述方法能够可靠地测量特定的认知缺陷——即认知灵活性，并且其结果与在大鼠及非人灵长类动物中使用该任务所获得的结果高度接近。本方法是在系统综述既往大鼠和小鼠实验方案的基础上，结合本机构专家的建议与指导而形成的。

先前在小鼠中使用类似任务的研究已证明此类行为测量具有可塑性，但存在若干局限性^2,6,11。Colacicco et al. 将每天测试的辨别任务数量限制为2项，使整个测试过程分布在四天内完成¹¹，其中包括在连续测试日重复先前已学会的刺激对。尽管该方法有效，但本研究旨在缩短测试周期并提高效率。本文所述方案将测试时间限制在两天内，并取消了对先前已学会刺激对的重复测试。以往研究指出，小鼠需要经过过度训练才能形成注意集（attentional set），且仅在较短的“可测试窗口期”内维持费力的反应行为。本方案同样包含在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
测试室			实验室自制，具体规格见实验方案
3 盎司烤碗	BIA Cordon Bleu	900002S12	在 amazon.com 购买
精油：	Fronteir Natural Products Co-Op		在 http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo 购买
丁香花蕾		191114
红百里香		191140
柠檬		190810
肉桂叶		191111
迷迭香		191133
爪哇香茅		191112
荷荷巴油香草精		191231
茴香籽		191102
姜		191121
肉豆蔻		191161
滤纸，直径 9.0 cm	VWR International	28310-048	在 https://us.vwr.com/ 购买
挖掘介质
拉菲亚纤维	Ashland 8 盎司拉菲亚纤维		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1/2" 至 1" 的条状
绿色毛毡	Creatology 基础毛毡 森林绿/深绿色 36 英寸 × 36 英寸		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1 cm × 1 cm 的方块
棕色泡沫板	Creatology Fun Foam 18 × 12 英寸片材（浅棕色/米色）		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1/2 cm × 2 cm 的矩形
皱纹纸（黄色）	Celebrate It 皱纹纸 4 盎司黄色加大装		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1/2" 至 1" 的条状
丝带（绿松石色）	Celebrate It 宽幅丝带 4 英寸 × 10 码 100% 聚酯纤维		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1 cm × 1 cm 的方块
金属光泽	Celebrate It 金属光泽金色皱纹纸 2 盎司		在 http://www.michaels.com/ 剪成 1/2" 至 1" 的条状
活动眼珠，4 mm		ME4144	在 http://factorydirectcraft.com/index.php 购买
黑色亮片，3 mm		8780BK
粉色绒球，1/4 英寸		1018221
扭扭棒，红色		108430
垫料/木屑			来自实验室内部动物资源
计时器	Control Company	5000	在 http://www.control3.com/5000p.htm 购买
微甜干性早餐麦圈	HEB		实验方案中使用的是蜂蜜坚果烤燕麦片，建议使用任何微甜涂层的早餐麦圈