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方法文章

电穿孔鸡胚脊髓中差异基因表达的RNA-Seq分析

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DOI：

10.3791/51951

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2014年11月1日

 , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Universidade de São Paulo

本文内容

摘要

本视频展示了在转染后对分离的鸡胚脊髓样本进行全转录组分析的基本步骤 在卵内 电穿孔

摘要

在胚 鸡胚神经管电穿孔是一种快速且经济的方法，可用于鉴定基因在神经发育过程中的功能。在此类实验操作后对差异表达转录本进行全基因组分析，有望揭示转染构建体所引发的下游效应的近乎完整图景。本文描述了一种简便的方法，用于比较转染胚胎脊髓样本的转录组，涵盖从电穿孔到差异表达转录本鉴定的全部步骤。第一阶段包括电穿孔操作指南，以及在无RNase环境中从HH23期胚胎中分离转染脊髓半侧组织并提取适用于转录组测序的高质量RNA样本的详细步骤。第二阶段为生物信息学分析，提供了在Galaxy公共服务器上对RNA-Seq数据集进行过滤与比较的一般性指南，使小至中等规模实验无需依赖本地计算资源。代表性结果表明，所采用的解剖方法能够获得高质量的RNA样本，且两个对照样本的转录组基本一致，这是在实验样本中准确检测差异表达基因的重要前提。此外，本文还提供了一个实例，通过与对照样本比较，可直观验证DNA构建体的实验性过表达。该方法的应用有望成为推动揭示参与脊髓早期发育的神经因子功能新发现的有力工具。 关键词：鸡胚，神经管，电穿孔，脊髓，转录组，RNA-Seq，差异表达，Galaxy服务器，HH23期，RNA提取

引言

活体生物的遗传学研究常以鸡胚作为模型，因为 在卵内 电穿孔是一种快速且经济的方法，可用于部分转染胚胎结构 体内 带有DNA构建体1-5包含一个转录本的双顺反子表达载体，该转录本编码荧光报告基因和目的基因，例如 pCIG6 或 pMES7可在对胚胎进行下游分析前，通过体视显微镜快速验证目标区域的转染质量。

随着DNA测序技术的最新进展，现在可以通过RNA-Seq技术从RNA样本中获得数字形式的全转录组表达谱8,9因此，无需采用耗时的方法仅能平行分析少数基因产物，例如 原位 杂交、免疫组织化学和qPCR，以及用于高通量测序的cDNA文库制备，可提供全转录组的信息。观察实验处理对每个基因表达水平的影响，可深入揭示所用载体导致改变的信号通路。若已有该实验生物的基因组组装序列，则分析尤为便捷，因此鸡胚再次成为合适的模型。

如果用户能够使用可靠的基因组测序中心，主要问题则在于获得高质量的RNA样本。本研究展示了一种从转染后的神经管中提取适用于RNA-Seq的RNA样本的方法，以及对所得数据集进行in silico分析的后续步骤。在HH12-13期进行电穿孔转染，随后孵育48小时，在无RNase的条件下分离转染的躯干部脊髓半侧组织，立即裂解，并通过超低温冷冻防止降解，直至进行RNA纯化和文库构建。

Galaxy 公共服务器10提供免费资源，用于分析高通量测序数据。注册用户可获得足够的存储空间，足以满足小型实验的需求，从而无需本地计算基础设施。RNA-Seq 数据分析包括过滤、比对以及基因表达的定量/比较。尽管已有 RNA-Seq 数据分析的一般性指南，但过滤参数在很大程度上取决于测序质量，应在对原始数据进行质量控制分析后确定。

本方案描述了从体内转染的鸡胚脊髓中获取和比较RNA-Seq图谱的步骤。in vivo转染空载体的两个独立对照样本数据集的比较结果表明，该方法具有可重复性，能够用于鉴定实验样本中差异表达的转录本。因此，应用该方法有望在单次实验后显著增加发现数量，从而为后续研究提供大量数据。

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方案

1. 在 HH12-13 期鸡胚的神经管中电穿孔导入目的载体 在胚

使用荧光报告基因，最好将其置于双顺反子转录本中，或通过插入的病毒2a肽与目标蛋白融合表达11，以快速鉴定转染水平满意的个体。注意：此阶段的典型孵育时间约为37.8 °C下48小时。

  1. 使用连接18 G × 1 1/2针头的注射器移除3 ml蛋清后，在蛋壳上开一个小窗口。为增强胚胎的可视性，将印度墨水用无菌林格液按1:50稀释后，注入胚胎下方1-4。
  2. 用无菌林格液覆盖胚胎后，通过神经管后端注入含有2.5 µg/µl DNA的10 mM Tris-HCl（pH 8.2）和0.1%食用染料（F, D & C）溶液，直至溶液充满后脑区域。进行电穿孔时，将直径为0.5 mm的铂电极沿胚胎侧壁区域放置，电极间距为4 mm1，施加5次脉冲，每次50 msec，电压20 V，脉冲间隔100 msec4。
  3. 电穿孔后，将操作后的胚胎继续孵育48小时，直至达到HH23期，并在荧光体视显微镜下鉴定侧壁区域转染效率较高的个体。
    注意：电穿孔后的孵育时间取决于实验目的。电穿孔导入的质粒在2小时后即可产生显著的表达水平2。因此，若研究目标为早期表达基因，可缩短电穿孔后的孵育时间。

2. 收集转染成功的胚胎并分离电穿孔的脊髓半侧

注意：此操作对每10个胚胎需要2-3小时，每个胚胎可获得1-2 µg总RNA。神经管的解剖需要精细的操作，建议在用于实验样本前进行若干次练习。

  1. 使用RNase去污染溶液处理金属解剖工具，或在150 °C下烘烤4小时12，并配制DEPC处理的PBS。仅使用全新且经认证的无RNase塑料器皿。
    注意：胚胎取出后，在解剖过程中应遵循标准操作，防止RNase污染。
  2. 使用精细解剖剪和带筛孔的收集勺收获胚胎。将胚胎保存在100 mm培养皿中的冷DEPC处理PBS中。
  3. 用一对精细镊子切除整个侧腹部区域（位于前肢芽后缘与后肢芽前缘之间），并将该组织转移至另一含有冷DEPC处理PBS的新培养皿中。
  4. 使用两根精细玻璃针，在胚胎每个背外侧（神经管与轴旁中胚层之间）的不同三个位置进行穿刺。
  5. 将两根玻璃针插入中央穿刺孔，然后沿神经管的头尾轴缓慢移动其中一根针，使其远离。对首次操作未覆盖的穿刺点重复此步骤。用精细镊子移除已分离的轴旁中胚层。
  6. 将胚胎侧放，将镊子尖端插入神经管与脊索之间，沿头尾轴向相反方向滑动，以分离这两个结构。
    注意：此操作同时应去除仍附着在神经管上的大部分中胚层组织。
  7. 如有必要，在用另一对镊子轻轻固定神经管的同时，用镊子夹取并移除仍附着的较大块中胚层组织。完成后，使用无RNase的玻璃巴斯德移液管连接手动移液泵，轻柔地将神经管转移至另一盛有冷DEPC处理PBS的培养皿中，并置于冰上保存，直至所有神经管解剖完毕。
  8. 将神经管分为两半。操作时，将闭合镊子的尖端插入管腔内，通过向外移动镊子打开顶板。随后，用镊子尖端剪开底板，将两半分离。
  9. 在荧光解剖显微镜下区分经电转染与未经电转染的半侧神经管，并转移至装有冰冷DEPC处理PBS的1.5 ml离心管中。如有必要，轻轻弹击微量离心管，使附着在管壁的组织脱落，并促进神经管沉降。
  10. 以100 × g离心3秒，然后使用1 ml微量移液器极其缓慢地吸除尽可能多的PBS。操作时应透过光源观察微量管，确认是否有胚胎组织被吸入移液尖；若发生此情况，应缓慢释放液体并重复离心。
  11. 每半侧神经管加入70 µl用于RNA提取的裂解液，轻弹管壁混匀内容物。室温孵育5分钟，剧烈涡旋振荡。重复此孵育和涡旋步骤两次。随后将样品储存于-80 °C。
  12. 每个样本至少收集八个半侧神经管，以确保下一步所需的足够产量。若需多次电转染/解剖操作才能获得足够数量的神经管，可合并较小的样本。为每种实验条件保留足够数量的样本，用于设置重复或三复孔实验。

3. 纯化RNA并制备Illumina测序文库

  1. 从 -80 °C 保存条件下取出样品，置于冰上 15–30 分钟。随后在室温继续解冻至完全。
  2. 充分涡旋振荡，室温静置 5 分钟。再次涡旋振荡后，在 15,000 × g 离心 1 分钟，以沉淀不溶性物质。
  3. 将上清液转移至新管中，并根据总 RNA 提取试剂盒说明书进行 RNA 提取。洗脱时使用推荐的最小体积，以提高浓度。
    注意：建议在纯化后进行 DNase 处理，以避免 RNA-Seq 数据集中出现基因组 DNA 序列的潜在污染。
  4. 轻弹管壁混匀内容物，取 5 µl 用于质量控制分析。剩余样品储存于 -80 °C，待文库构建时使用；这些样品应仅解冻一次，以防止 RNA 降解。
  5. 使用 RNA 6000 Nano 试剂盒在 Bioanalyzer 仪器上检测纯化后的 RNA；RIN 值必须至少高于 7 方可继续后续实验。
  6. 使用与 Illumina 兼容的 RNA-Seq 文库构建试剂盒制备文库，并在 HiSeq 仪器的一个泳道中多重混合最多 4 个文库，生成 100 bp 的单端读长。如有可能，应将所有样品纳入同一次测序运行，以尽量减少潜在的技术偏差。
    注意：每份样品可获得高达 5000 万条读长，足以覆盖大多数基因13。

4. 在 Galaxy 公共服务器中比较 RNA-Seq 数据集10。

注意：服务器存储空间有限，比较多个样本的实验可能需要删除过滤步骤中生成的中间文件。

  1. 在 Galaxy 公共服务器（https://usegalaxy.org）中创建用户账户，并通过 FTP 上传 fastq 格式的 Illumina 数据集。
  2. 在 NGS:QC and manipulation 菜单下使用 FastqGroomer14 工具准备已上传的文件；如果质量值已采用 Phred+33（Sanger）编码，则可跳过此步骤，只需在每个数据集的 Attributes 中将文件类型更改为 fastqsanger。
  3. 在 NGS:QC and manipulation 菜单下使用 FastQC 工具分析每个数据集的整体质量。
    注意：应特别关注每碱基序列质量与每碱基序列组成的结果图，这些信息将为读段末端修剪参数的设定提供参考。
  4. 在 NGS:QC and manipulation 菜单下使用 FASTQ Quality Trimmer14 工具对读段进行修剪，以去除 3’ 端低质量数据。设置该工具仅处理质量分数低于 20 的 3’ 端。
  5. 在 NGS:QC and manipulation 菜单下使用 Clip 工具（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）从读段中去除接头序列。设置该工具丢弃剩余长度少于 45 bp 的读段，输入所用接头的序列，并选择输出包含已剪切和未剪切的序列。此外，由于大多数低质量碱基已在上一步中被去除，因此可选择不丢弃含有未知碱基的序列。
  6. 在 NGS:QC and manipulation 菜单下使用 Trim sequences 工具（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/），修剪读段的起始碱基以消除 FastQC 检测到的 5’ 端序列偏差（通常为 10 个碱基）。
    注意：此时建议再次运行 FastQC，并与之前的分析结果进行比较，以判断数据集质量是否有所改善。
  7. 从 Illumina iGenomes（http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn）下载并解压最新版本的鸡基因组组装文件，使用“Get Data”菜单下的“Upload File”工具将全基因组 fasta 格式文件和基因注释 gtf 格式文件上传至 Galaxy 历史记录中。
  8. 在 NGS: RNA Analysis 菜单下使用比对工具 TopHat215 将每个样本的读段比对至鸡基因组。选择使用历史记录中的基因组（选择在步骤 4.7中上传的 fasta 文件）。
  9. 在 NGS: RNA Analysis 菜单下使用 Cufflinks16 为每个样本构建预测转录组。选择使用参考注释作为引导（选择在步骤 4.7中上传的 gtf 文件），并启用 Perform Bias Correction（来自历史记录，选择步骤 4.7中的 fasta 文件）和 Use multi-read correct 选项。
  10. 在 NGS: RNA Analysis 菜单下使用 Cuffmerge16 合并所有样本的预测转录组。选择使用参考注释（来自步骤 4.7的 gtf 文件）和序列数据（来自历史记录，选择步骤 4.7 中的 fasta 文件）。
  11. 在 NGS: RNA Analysis 菜单下使用 Cuffdiff16 比较由 TopHat2 为每个样本生成的 BAM 文件。在 Transcripts 字段中选择由 Cuffmerge 生成的合并转录组，并启用 Perform Bias Correction（来自历史记录，选择步骤 4.7中的 fasta 文件）和 Use multi-read correct 选项。
  12. 在 Filter and Sort 菜单下使用 Sort 工具，按第 13 列（q 值）数值升序排列差异表达检测结果表。
    注意：在不同实验条件下表现出显著差异表达的基因/转录本将具有最低的 q 值。
  13. 为通过覆盖度图直观检查结果，首先在 BEDTools 菜单下使用 Create a BedGraph of genome coverage17 工具将 BAM 文件转换为 bedGraph 格式。关闭无覆盖区域的报告，选择将剪接条目视为独立区间处理，并按一个归一化测序深度的因子对覆盖度进行缩放，以便比较所有数据集。
  14. 在 Convert Formats 菜单下使用 Wig/BedGraph-to-bigWig 工具（http://www.genome.ucsc.edu/）将生成的 bedGraph 文件转换为 bigWig 格式。将 bigWig 文件作为自定义轨道上传至 UCSC 基因组浏览器（http://www.genome.ucsc.edu/）的 galGal4 组装版本，并搜索目标基因以可视化各数据集中的覆盖情况。

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结果

为验证所述方法，使用空载体 pMES7 转染胚胎，制备了两个对照样品，并使用含有插入片段 SCRT2-ZNF 的相同载体转染胚胎，制备了一个实验样品，该插入片段编码鸡 SCRT2 的锌指结构域18。每个样品从 8 至 12 个胚胎组成的混合样本中提取，获得总量为 11–22 µg 的总 RNA。在使用 Bioanalyzer 仪器进行的质量检测中，所有三个样品的 RNA 完整性数（RIN）值均达到最优的 10（图 1），表明本方案可获得高质量的 RNA。

测序后，经过所述过滤流程，比对率从83%提高至91%（数据未显示）。与预期一致，将两个对照样本的转录组进行全局比较时，散点图中未显示明显差异（图2），且皮尔逊相关系数为0.99。此外，沿包含SCRT2序列片段的基因座区域展示所有三个数据集的覆盖度时，实验样本中比对到该区域的读段数量明显增加（图3），表明过表达成功，并且对照样本与实验样本之间的差异可通过本文所述方法检测到。

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讨论

本文提供了分析鸡脊髓电穿孔后效应的指导方案。尽管DNA载体的电穿孔通常用于过表达目的基因，但也可利用编码显性负性突变体、嵌合蛋白或siRNA前体的构建体来实现基因功能的敲低19-21。事实上，对基因获得功能和缺失功能两种条件下转录组谱的比较分析，可能揭示在不同条件下呈相反差异表达的基因，从而有助于发现更为特异的生物学效应。

对于RNA提取后的任何方法而言，RNA-Seq文库的构建都需要一定最低量的起始材料。根据本方案，8个胚胎应足以获得约10 µg的总RNA。若起始样本个体数较少，但通过使用可将最终洗脱体积浓缩至更小体积的RNA提取系统，可能仍能保证足够的工作浓度。

在对重要样本进行操作之前，应先多次练习将神经管与所有中胚层组织完全分离，因为这是一个精细的步骤，需要一定的熟练度。为避免在解剖过程中发生过度的RNA降解，还应尽量在约1至2小时内完成所有神经管的全部操作。同样，通过练习可有效缩短解剖时间。一个重要的观察发现是：中胚层组织之间的连接比中胚层与神经管之间的连接更为紧密，因此，通过牵拉中胚层结构（特...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

CYIY 受 FAPESP（2012/14421-5）资助，FMV 受 FAPESP 奖学金（2009/53695-0）资助。我们感谢加州大学戴维斯分校 DNA 技术核心实验室为本研究中使用的 RNA-Seq 文库制备和测序提供的支持，感谢 Galaxy 团队提供了出色且免费的高通量测序数据分析工具平台，并感谢 Marianne Bronner 博士允许我们在她的实验室空间内进行拍摄。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
印度墨水任意供应商
18G × 1 1/2 针头BD305196
3 ml 注射器BD309657
TrisMP Biomedicals819620
F D & C 蓝 1Spectra Colors Corporation5.FC.0010P0用于可视化 DNA 注射的食用染料
林格氏溶液（1 L）
     - 7.2 g NaClSigma-AldrichS-9888
     - 0.37 g KClSigma-AldrichP-4504
     - 0.225 g CaCl2•2H2OFisher Scientific10043-52-4
     - 0.217 g Na2HPO4•7H2OSigma-AldrichS-9390
     - 0.02 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
     - 用 ddH2O 定容至 800 ml 并调节 pH 至 7.4
     - 用 ddH2O 定容至 1 L
     - 过滤并高压灭菌
PBS（磷酸盐缓冲液）（1 L）
     - 8 g NaClSigma-AldrichS-9888
     - 0.2 g KClSigma-AldrichP-4504
     - 1.15 g Na2HPO4•7H2OSigma-AldrichS-9390
     - 0.2 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
     - 用 ddH2O 定容至 800 ml 并调节 pH 至 7.2
     - 用 ddH2O 定容至 1 L 并过滤
     - 1 ml DEPC（焦碳酸二乙酯）Sigma-AldrichD-5758
     - 剧烈振荡，室温下静置过夜
     - 高压灭菌
筛勺任意供应商
无菌 60 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿Corning Life Sciences351007
RNaseZap RNase 去污染溶液Life TechnologiesAM9780
精细手术剪任意供应商
直头精细镊子任意供应商
由 1.1 × 75 mm 玻璃毛细管拉制的玻璃针Kimble Chase40A502
9 英寸玻璃巴斯德移液管任意供应商
手动移液泵任意供应商
透明 1.5 ml 微量离心聚丙烯管Corning Life SciencesMCT-150-C
微量离心机任意供应商
用于 RNA 稳定的 RNAlater 溶液Life TechnologiesAM7020
RNAqueous 总 RNA 提取试剂盒Life TechnologiesAM1912
分子生物学级乙醇任意供应商
RNA 6000 Nano 试剂盒Agilent Technologies5067-1511
2100 电泳生物分析仪Agilent TechnologiesG2939AA
Truseq RNA 样本制备试剂盒 v2IlluminaRS-122-2001/RS-122-2002

参考文献

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