电穿孔鸡胚脊髓中差异基因表达的RNA-Seq分析

摘要

本视频展示了在转染后对分离的鸡胚脊髓样本进行全转录组分析的基本步骤 在卵内 电穿孔

摘要

在胚 鸡胚神经管电穿孔是一种快速且经济的方法，可用于鉴定基因在神经发育过程中的功能。在此类实验操作后对差异表达转录本进行全基因组分析，有望揭示转染构建体所引发的下游效应的近乎完整图景。本文描述了一种简便的方法，用于比较转染胚胎脊髓样本的转录组，涵盖从电穿孔到差异表达转录本鉴定的全部步骤。第一阶段包括电穿孔操作指南，以及在无RNase环境中从HH23期胚胎中分离转染脊髓半侧组织并提取适用于转录组测序的高质量RNA样本的详细步骤。第二阶段为生物信息学分析，提供了在Galaxy公共服务器上对RNA-Seq数据集进行过滤与比较的一般性指南，使小至中等规模实验无需依赖本地计算资源。代表性结果表明，所采用的解剖方法能够获得高质量的RNA样本，且两个对照样本的转录组基本一致，这是在实验样本中准确检测差异表达基因的重要前提。此外，本文还提供了一个实例，通过与对照样本比较，可直观验证DNA构建体的实验性过表达。该方法的应用有望成为推动揭示参与脊髓早期发育的神经因子功能新发现的有力工具。 关键词：鸡胚，神经管，电穿孔，脊髓，转录组，RNA-Seq，差异表达，Galaxy服务器，HH23期，RNA提取

引言

活体生物的遗传学研究常以鸡胚作为模型，因为 在卵内 电穿孔是一种快速且经济的方法，可用于部分转染胚胎结构 体内 带有DNA构建体^1-5包含一个转录本的双顺反子表达载体，该转录本编码荧光报告基因和目的基因，例如 pCIG⁶ 或 pMES⁷可在对胚胎进行下游分析前，通过体视显微镜快速验证目标区域的转染质量。

随着DNA测序技术的最新进展，现在可以通过RNA-Seq技术从RNA样本中获得数字形式的全转录组表达谱^8,9因此，无需采用耗时的方法仅能平行分析少数基因产物，例如 原位 杂交、免疫组织化学和qPCR，以及用于高通量测序的cDNA文库制备，可提供全转录组的信息。观察实验处理对每个基因表达水平的影响，可深入揭示所用载体导致改变的信号通路。若已有该实验生物的基因组组装序列，则分析尤为便捷，因此鸡胚再次成为合适的模型。

如果用户能够使用可靠的基因组测序中心，主要问题则在于获得高质量的RNA样本。本研究展示了一种从转染后的神经管中提取适用于RNA-Seq的RNA样本的方法，以及对所得数据集进行in silico分析的后续步骤。在HH12-13期进行电穿孔转染，随后孵育48小时，在无RNase的条件下分离转染的躯干部脊髓半侧组织，立即裂解，并通过超低温冷冻防止降解，直至进行R....

方案

1. 在 HH12-13 期鸡胚的神经管中电穿孔导入目的载体 在胚

使用荧光报告基因，最好将其置于双顺反子转录本中，或通过插入的病毒2a肽与目标蛋白融合表达¹¹，以快速鉴定转染水平满意的个体。注意：此阶段的典型孵育时间约为37.8 °C下48小时。

1. 使用连接18 G × 1 1/2针头的注射器移除3 ml蛋清后，在蛋壳上开一个小窗口。为增强胚胎的可视性，将印度墨水用无菌林格液按1:50稀释后，注入胚胎下方^1-4。
2. 用无菌林格液覆盖胚胎后，通过神经管后端注入含有2.5 µg/µl DNA的10 mM Tris-HCl（pH 8.2）和0.1%食用染料（F, D & C）溶液，直至溶液充满后脑区域。进行电穿孔时，将直径为0.5 mm的铂电极沿胚胎侧壁区域放置，电极间距为4 mm¹，施加5次脉冲，每次50 msec，电压20 V，脉冲间隔100 msec⁴。
3. 电穿孔后，将操作后的胚胎继续孵育48小时，直至达到HH23期，并在荧光体视显微镜下鉴定侧壁区域转染效率较高的个体。
   注意：电穿孔后的孵育时间取决于实验目的。电穿孔导入的质粒在2小时后即可产生显著的表达水平²。因此，若研究目标为早期表达基因，可缩短电穿孔后的孵育时间。

结果

为验证所述方法，使用空载体 pMES⁷ 转染胚胎，制备了两个对照样品，并使用含有插入片段 SCRT2-ZNF 的相同载体转染胚胎，制备了一个实验样品，该插入片段编码鸡 SCRT2 的锌指结构域¹⁸。每个样品从 8 至 12 个胚胎组成的混合样本中提取，获得总量为 11–22 µg 的总 RNA。在使用 Bioanalyzer 仪器进行的质量检测中，所有三个样品的 RNA 完整性数（RIN）值均达到最优的 10（图 1），表明本方案可获得高质量的 RNA。

测序后，经过所述过滤流程，比对率从83%提高至91%（数据未显示）。与预期一致，将两个对照样本的转录组进行全局比较时，散点图中未显示明显差异（图2），且皮尔逊相关系数为0.99。此外，沿包含SCRT2序列片段的基因座区域展示所有三个数据集的覆盖度时，实验样本中比对到该区域的读段数量明显增加（图3），表明过表达成功，并且对照样本与实验样本之间的差异可通过本文所述方法检测到。

讨论

本文提供了分析鸡脊髓电穿孔后效应的指导方案。尽管DNA载体的电穿孔通常用于过表达目的基因，但也可利用编码显性负性突变体、嵌合蛋白或siRNA前体的构建体来实现基因功能的敲低^19-21。事实上，对基因获得功能和缺失功能两种条件下转录组谱的比较分析，可能揭示在不同条件下呈相反差异表达的基因，从而有助于发现更为特异的生物学效应。

对于RNA提取后的任何方法而言，RNA-Seq文库的构建都需要一定最低量的起始材料。根据本方案，8个胚胎应足以获得约10 µg的总RNA。若起始样本个体数较少，但通过使用可将最终洗脱体积浓缩至更小体积的RNA提取系统，可能仍能保证足够的工作浓度。

在对重要样本进行操作之前，应先多次练习将神经管与所有中胚层组织完全分离，因为这是一个精细的步骤，需要一定的熟练度。为避免在解剖过程中发生过度的RNA降解，还应尽量在约1至2小时内完成所有神经管的全部操作。同样，通过练习可有效缩短解剖时间。一个重要的观察发现是：中胚层组织之间的连接比中胚层与神经管之间的连接更为紧密，因此，通过牵拉中胚层结构（特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
印度墨水	任意供应商
18G × 1 1/2 针头	BD	305196
3 ml 注射器	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C 蓝 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	用于可视化 DNA 注射的食用染料
林格氏溶液（1 L）
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- 用 ddH2O 定容至 800 ml 并调节 pH 至 7.4
- 用 ddH2O 定容至 1 L
- 过滤并高压灭菌
PBS（磷酸盐缓冲液）（1 L）
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- 用 ddH2O 定容至 800 ml 并调节 pH 至 7.2
- 用 ddH2O 定容至 1 L 并过滤
- 1 ml DEPC（焦碳酸二乙酯）	Sigma-Aldrich	D-5758
- 剧烈振荡，室温下静置过夜
- 高压灭菌
筛勺	任意供应商
无菌 60 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase 去污染溶液	Life Technologies	AM9780
精细手术剪	任意供应商
直头精细镊子	任意供应商
由 1.1 × 75 mm 玻璃毛细管拉制的玻璃针	Kimble Chase	40A502
9 英寸玻璃巴斯德移液管	任意供应商
手动移液泵	任意供应商
透明 1.5 ml 微量离心聚丙烯管	Corning Life Sciences	MCT-150-C
微量离心机	任意供应商
用于 RNA 稳定的 RNAlater 溶液	Life Technologies	AM7020
RNAqueous 总 RNA 提取试剂盒	Life Technologies	AM1912
分子生物学级乙醇	任意供应商
RNA 6000 Nano 试剂盒	Agilent Technologies	5067-1511
2100 电泳生物分析仪	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA 样本制备试剂盒 v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002