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方法文章

通过Homalodisca vitripennis细胞培养传播Homalodisca coagulata virus-01

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DOI：

10.3791/51953

⸱

2014年9月25日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于扩增的实验方案 Homalodisca vitripennis 细胞和HoCV-1 体外每隔24小时从HoCV-1阳性培养物中移除培养基并提取RNA，持续168小时。细胞存活率通过台盼蓝染色法进行定量。感染后提取完整病毒颗粒。采用qRT-PCR对提取的RNA进行定量。

摘要

玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis是一种在美国西南部广泛分布的高迁移性、多食性昆虫。这些昆虫是主要的传播媒介 Xylella fastidiosa （X. fastidiosa）， 一种局限于木质部的细菌，是葡萄皮尔氏病（Pierce's disease, PD）的致病因子。皮尔氏病具有显著的经济危害性；因此， H. vitripennis 已成为病原体管理策略的靶点。一种被鉴定为 dicistrovirus 的病毒 Homalodisca coagulata 病毒-01 (HoCV-01) 已被发现与死亡率升高相关 H. vitripennis 种群。由于HoCV-01的复制需要宿主细胞，细胞培养为靶向复制提供了均一的环境，这在生物杀虫剂生产中具有重要的物流和经济价值。在本研究中，建立了一种用于大规模扩增HoCV-01的系统 H. vitripennis 通过组织培养技术建立了细胞培养方法，提供了病毒复制机制。HoCV-01从全虫体中提取，并用于接种培养细胞 H. vitripennis 在不同时间点收集细胞。每24小时更换一次培养基，持续168小时，提取RNA并进行qRT-PCR分析。使用台盼蓝染色细胞，并通过光学显微镜计数，以定量细胞存活率。在感染后96小时内提取完整病毒颗粒，该时间点确定为细胞培养完全崩解之前。此外，对细胞进行荧光染色，并利用共聚焦显微镜观察，以研究病毒对F-肌动蛋白附着及细胞核完整性的活动影响。本研究的结论是 H. vitripennis 细胞能够被培养并用于大规模生产HoCV-01，达到适宜水平以实现生物杀虫剂的制备。

引言

玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis Germar 1821）已被确认为北美葡萄皮尔斯病（Pierce’s disease of grapevine, PD）病原体Xylella fastidiosa （X. fastidiosa）的主要传播媒介1。昆虫种群管理已迅速成为加州及美国南部地区葡萄栽培业应对这一毁灭性问题的研究重点。一种属于Dicistroviridae科的正义单链RNA病毒——Homalodisca coagulata virus-01 （HoCV-01），已在野外H. vitripennis种群中被发现，并被证实可提高该昆虫种群的死亡率2-4，同时降低其对杀虫剂的抗性。

在实验室条件下，有效饲养感染的H. vitripennis至成虫阶段的方法开发一直较为困难，因为H. vitripennis在不同发育阶段具有特定的营养需求，需依赖多种寄主植物5-8。在美国，饲养活体H. vitripennis需要特定的设施；因此，细胞培养是一种更经济且可行的替代方案，对于HoCV-01的检测与复制也日益重要2,9。尽管已有建立H. vitripennis细胞培养体系的基本方法描述，但这些方法尚未被用于病毒等生物防治制剂的商业化生产2。

以下操作步骤的总体目标是制备高浓度的HoCV-01，以适合作为生物防治剂使用。病毒的复制需要活细胞，因此成功培养并优化H. vitripennis细胞系对于实现病毒的高效生产至关重要。

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方案

1. 细胞培养

注意：实验所用的玻璃木虱（Homalodisca vitripennis）细胞系由美国农业部农业研究局（美国佛罗里达州皮尔斯堡）Wayne Hunter 博士实验室建立，用于启动一个包含多种细胞阶段（包括初始成纤维细胞和单层细胞）的实验室细胞库。

  1. 在温度为20–24 °C、保持无菌的实验室环境中进行以下操作，操作空间高度为25 cm2 培养瓶
  2. 在25 cm²培养瓶中培养并维持细胞培养物2 使用H2G+叶蝉培养基（一种改良的WH2蜜蜂培养基）的组织培养瓶10 (表1).
  3. 在24 °C、相对湿度约53%的条件下培养细胞培养瓶。
  4. 使用倒置显微镜在100倍总放大倍数（TM）下监测培养物生长情况， 例如， 检查是否存在异常的细胞生长，监测潜在污染物，并观察培养表面的生长进展情况。
  5. 每7至10天进行一次完全换液（每瓶约4 ml培养基），操作时避免扰动培养表面。
  6. 当培养表面细胞生长（融合度）达到约80%时，使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代。每个培养瓶中加入约2–3 ml胰蛋白酶，酶作用时间宜短（5–10分钟），以实现细胞完全解离。
  7. 向培养瓶中加入等量的新鲜培养基（约 2 - 3 ml），以终止酶活性，然后将全部溶液转移至锥形离心管中进行离心。
  8. 在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 6 分钟，收集细胞沉淀。
  9. 移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，向每根试管中加入约 8 ml 新鲜培养基。用移液器轻轻重悬细胞。
  10. 以1:2的比例分种培养物至25 cm培养瓶中2 培养瓶（每瓶约4 ml细胞悬液），并将新传代的培养物静置48小时，以使悬浮细胞牢固贴附于培养瓶表面。
    注意：在具有1 cm²生长表面积的48孔无菌组织培养板中培养细胞2 也可以采用这种方式，并以与培养瓶相同的方式进行维持，仅需将培养基体积减少至约250 μl。

2. 全病毒提取

  1. 匀浆化病毒阳性个体的整个身体 H. vitripennis 在 pH 约为 7.2 的磷酸盐缓冲液中，加入 0.02% 三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠（DETCA），通过涡旋振荡，每次约 10 秒，直至组织中不再有明显的大块团状物。通过超速离心提取病毒，条件为 4 °C 下 124,500 × g 离心 4 小时，或 4 °C 下 22,000 × g 离心 16 小时。若顶部出现沉淀物，用无菌棉签将其去除。11.
  2. 弃去上清液。
  3. 收集沉淀，并用5 ml含0.4%脱氧胆酸钠和4%聚乙二醇十六醚（Brij 52）的10 mM磷酸盐缓冲液（不含DETCA），pH约7.2，溶解。
    1. 为了充分混匀沉淀，将沉淀从管壁上取下，必要时研磨至完全溶解于溶液中。
    2. 根据需要，以约 5 ml 为增量加入更多 10 mM 磷酸盐缓冲液，以帮助沉淀溶解，并将溶液合并至 2 支离心管中11.
  4. 300 × g 离心 15 分钟11.
  5. 移除上清液，并将溶液通过 0.45 μm 滤膜，收集滤液至大收集管中11.
  6. 将滤液转移至截留分子量（MWCO）为3.5 kD的透析膜中，必要时使用少量含10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）且不含DETCA的溶液11.
  7. 将透析膜放入盛有去离子水的大烧杯中2O，4 °C 下孵育。更换 ddH2每小时震荡一次，持续5至6小时，直至膜上形成白色沉淀11.
  8. 从膜内收集纯化的病毒，并将100%病毒溶液进行10倍梯度稀释：取10 μl溶液加入90 μl ddH₂O中2随后，将10 μl该稀释液加入另一份90 μl的ddH₂O中。2O，直至达到1:100,000的稀释度。
  9. 将病毒溶液于 -80 °C 保存。

3. 病毒复制

  1. 在48孔培养板中接种细胞，所有孔继续培养至细胞生长达到80%融合度（若细胞以平均速度生长，约在传代后72小时）。
  2. 待细胞生长至汇合时，用梯度稀释的病毒接种每行细胞。 即， 一排1:10稀释液，一排1:100稀释液 等等。，除最上一排外。将最上一排作为对照，并加入 10 μl ddH₂O2O 作为体积对照加入每个孔中。
    1. 为建立用于与实验细胞计数进行比较的起始细胞浓度基线，在对培养物中任何孔进行初次病毒接种之前，先对每行的第一个孔进行消化并计数。
  3. 病毒接种后每24小时观察一次培养板，注意培养基颜色变化（提示pH改变）以及细胞形态的任何变化。
  4. 在每个时间点，使用倒置显微镜以100倍透射光模式拍摄检测板的一列图像。
  5. 在每个24小时时间点成像后，从柱中移除全部培养基，短期储存于-20 °C用于RNA提取和病毒定量，或长期储存于-80 °C。
  6. 按照之前步骤中所述去除培养基后，从孔板中分离细胞 1.6 – 1.9，仅使用约 250 μl 的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 及约 250 μl 新鲜培养基终止酶活性，并用约 250 μl 新鲜培养基重悬细胞沉淀。
  7. 向每管含有细胞的溶液中加入10 μl 0.4%台盼蓝染液，用于在为期一周的实验期间每个24小时时间点细胞解离后的细胞计数。染色后静置10分钟，再进行细胞计数。
    1. 染色后1小时内进行细胞计数，否则活细胞也会开始摄取染料，与死细胞一样。
  8. 使用移液器缓慢向标准血细胞计数板的两侧各加入10 μl染色后的细胞悬液。让溶液通过毛细作用自然吸入，以避免产生气泡。
  9. 在血细胞计数板两侧计数活细胞（未染色细胞）的数量（相当于血细胞计数板中16个方格中的4个方格的计数）。对已移除的列中每个孔的细胞进行计数。
  10. 取每列细胞计数的平均值，使用以下公式计算总细胞数：（平均细胞数 / 4）× 稀释倍数 = 细胞数量 × 104 毫升。这是培养物中的细胞密度或活细胞数量。

4. 从细胞培养物中提取病毒

  1. 按照之前步骤 1.6 – 1.8 所述方法，从培养瓶中收集经处理的 H. vitripennis 细胞，仅使用约 250 μl 的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 及新鲜培养基以终止酶活性。
  2. 弃去上清液。
  3. 按照之前步骤 2.3 – 2.8 所述方案，从培养细胞中提取病毒。

5. RNA 提取

  1. 根据制造商提供的针对液体样本的硫氰酸胍-酚-氯仿提取法操作说明，从每次为期一周的病毒试验中采集的培养基样本中提取RNA。
  2. 将提取的样本储存在-80 °C条件下。

6. 逆转录 PCR

  1. 使用来自全虫H. vitripennis的病毒分离物，采用引物对HoCV RT-PCR引物1（正向5′-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3′，反向5′-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3′）进行常规PCR，建立用于RT-PCR的病毒标准品。
  2. 将PCR产物在含有0.1%溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，以120 V电压电泳60分钟。
  3. 从凝胶中切下目标条带，并按照试剂盒制造商的说明使用凝胶回收试剂盒进行纯化。
  4. 合并所有切下并经凝胶纯化的产物，进一步通过基础乙醇沉淀法进行纯化。用约30 μl Tris EDTA（TE）溶液洗脱沉淀产物，以提高样品总体浓度。
  5. 使用分光光度计在260/230 nm波长下测定混合样品中cDNA的含量。
  6. 对纯化后的样品进行10倍系列稀释，浓度范围从57 ng/μl至57 ag/μl（10-18）。系列稀释操作参照2.8步骤所述方法，根据浓度需求进行相应调整。
  7. 使用具有可靠低丰度转录本定量能力的qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR，以确定该系列稀释样品的检测限。
    注意：病毒浓度低于5 × 10-3 拷贝时无法检测到。
  8. 按照先前步骤5.1所述方法提取实验样品的RNA，并使用分光光度计进行定量。
  9. 使用无核酸酶水将所有提取的样品归一化至5 ng/μl。
  10. 对所有样品进行qRT-PCR检测，每个样品设两个重复，反应体系为25 μl，使用一步法qRT-PCR试剂盒，具备检测低拷贝数的能力，反应程序如下：50 °C孵育10分钟；95 °C预变性5分钟；进行30个循环（95 °C变性10秒，60 °C退火延伸30秒）；熔解曲线分析从50 °C升至99 °C，每步5秒。
    1. 配制主混合液，使每个反应体系包含12.5 μl的1×主混合液、1.0 μl（0.3 μM）正向引物、1.0 μl（0.3 μM）反向引物、0.25 μl逆转录酶，以及根据标准化结果确定的可变量的模板。
    2. 用无RNase水补足总反应体积至25 μl。
    3. 每次PCR运行中均需包含五个标准品浓度，其拷贝数分别为：5 × 10-10、5 × 10-8、5 × 10-6、5 × 10-4 和 5 × 10-2。将每次运行的阈值设定在略低于10×-2.5荧光强度处，以减少每次运行初期数据采集时的背景噪声。

7. 共聚焦显微镜

  1. 在十二孔板的每个孔中放入直径为 18 mm 的玻璃盖玻片，培养Homalodisca vitripennis细胞。
  2. 当细胞形成单层后，每隔 24 小时接种一列，持续四天。确保每列包含一个对照孔、一个低病毒稀释度（1:10）孔和一个高病毒稀释度（1:100,000）孔。使用步骤2.8中获得的病毒溶液。
  3. 第五天时移除所有培养基，并用 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
  4. 用预冷的 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定细胞 30 分钟。
  5. 向细胞中加入 500 μl 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以低速在摇床上洗涤 10 分钟。重复此洗涤步骤共三次。
  6. 向细胞中加入 500 μl 的 0.1% Triton X-100 以通透细胞膜。室温下静置 10 分钟。
  7. 再次按照步骤 7.5 中所述方法洗涤细胞。
  8. 向细胞中加入 500 μl 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的溶液，在室温下封闭细胞。静置 2 小时后移除。
  9. 将储备的罗丹明红标记鬼笔环肽（RCP）用含 5% BSA 的 1× PBS 按 1:250 稀释，每孔加入 250 μl 稀释液以染色 F-肌动蛋白。
  10. 用铝箔包裹培养板，防止染料褪色，并在 4 °C 下避光孵育过夜。
  11. 孵育 12 小时后移除 RCP，替换为 250 μl 用含 5% BSA 的 1× PBS 稀释的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（250 μg/ml），用于细胞核染色。
  12. 将含 DAPI 的细胞在室温下孵育 1 小时。
  13. 按照步骤 7.5 中所述方法用 1× PBS 洗涤细胞三次。
  14. 小心地从孔中取出盖玻片，并使用含抗荧光淬灭剂的封片剂将其封固于显微镜载玻片上。
  15. 将载玻片置于避光盒中干燥，直至在共聚焦显微镜下观察。应尽快观察制备好的载玻片，因为染料可能迅速褪色。
  16. 使用配备有 63X（油镜）平场复消色差物镜的共聚焦系统对染色细胞进行成像。
    1. 设置激光波长：罗丹明红标记鬼笔环肽的激发波长为 543 ± 10 nm，发射波长为 575 ± 10 nm；DAPI 的激发波长为 369 ± 10 nm，发射波长为 450 ± 30 nm。
    2. 所有图像均使用相同的探测器增益和偏移设置获取。
    3. 使用适当的图像处理与分类软件处理图像，并将目标图像导入图像管理软件中。

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结果

在原代培养物及后续传代中，无论小规格还是大规格的培养瓶，均在传代后48小时内观察到细胞贴壁和生长。在此期间也观察到了成纤维细胞的生长和发育。若新接种的培养瓶在48小时之前受到扰动，则细胞贴壁情况明显减少，导致细胞生长缓慢，有时甚至完全不贴壁或不生长。传代后约一周，细胞融合度达到约80%，并在10至14天内形成单层细胞（图1）。本研究开始时建立的原代培养细胞，已连续传代30次以上，未出现任何形态学退化或整体细胞活力下降的现象。

从培养瓶传代至培养板后48小时内可观察到细胞贴壁和生长。由于培养板的生长表面积较小，单层细胞形成所需时间更短，约为5-6天。在光学显微镜下以100倍放大拍摄的感染培养物显示细胞形态完整性下降。感染后48小时，细胞表面出现看似较大空洞的区域。在不同培养瓶中，细胞在接种未稀释的HoCV-01后约72-96小时发生收缩并从培养表面脱落（图2）。

对照组和实验组样本的平均活细胞数经计算后绘制成图，以显示不同病毒载量下随时间变化的活细胞数量差异（<...

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讨论

随着外来农业有害物种入侵问题日益引起关注，人们对于开发新型防控方法以应对新兴害虫和病原体的需求不断增长。疾病预防与管理的重点之一是病原体传播媒介的控制，这也是本研究的主要目标。在农业生产中，利用生物农药控制病原体传播媒介时，经济因素在决策过程中起着至关重要的作用，因为该类农药的实际应用需要在大面积范围内使用大量制剂，同时必须保持低成本12。利用细胞培养技术进行研发的实践已越来越普遍，因此本研究的影响具有重要意义。确定经济可行的综合害虫管理（IPM）策略，是保障全球农业持续成功生产的关键，本研究的发现有助于推进IPM策略的改进，并减少葡萄藤皮尔当病（PD）的发生。

初级 H. vitripennis 细胞培养物传代并维持超过一年，未见明显的形态学退化。传代次数可能对实验结果产生显著影响。 体外 通过改变细胞代谢和生长特性在哺乳动物细胞中进行的研究13. 随着细胞复制 体内 和 体外 每经过一轮细胞复制，端粒就会缩短，最终达到一个临界限度，此时端粒过短，将引发细胞衰老

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢德克萨斯州皮尔斯病研究与教育计划项目以及美国农业部动植物卫生检验局（USDA-APHIS）为本项目提供的资金支持。我们还要感谢位于泰勒市的德克萨斯大学健康科学中心的Hema Kothari在共聚焦显微镜技术方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Corning 细胞培养瓶Sigma AldrichCLS430168表面积 25 cm2，斜颈，带塞盖
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71Olympus倒置显微镜及相机
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma AldrichT40490.25%，无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养，每升 Hanks′ 平衡盐溶液含 2.5 g 猪胰蛋白酶和 0.2 g EDTA • 4Na，含酚红
Greiner CELLSTAR 多孔培养板Sigma AldrichM893748 孔（带盖，TC 处理）
DETCASigma Aldrich228680三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠
Corning 瓶顶真空过滤系统Sigma AldrichCLS431206醋酸纤维素膜，孔径 0.45 μm，膜面积 54.5 cm2，过滤容量 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831聚乙二醇十六醚
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP5244以 100 mM 接收，用无菌水稀释至 10 mM
TRIzol LSLife Technologies10296-028
琼脂糖Sigma AldrichA5304用于电泳
溴化乙锭Sigma AldrichE7637BioReagent，用于分子生物学，粉末
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR 试剂盒Qiagen204243
4% 多聚甲醛Sigma AldrichP6148试剂级，结晶状
PBSSigma AldrichP5368磷酸盐缓冲盐水
Triton X-100Sigma AldrichX100
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma AldrichA2153
罗丹明红标记鬼笔环肽Life TechnologiesR415罗丹明鬼笔环肽是一种高亲和力 F-肌动蛋白探针，与红色-橙色荧光染料四甲基罗丹明偶联
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36934
LSM510 Meta 共聚焦系统Carl Zeiss
LSM Zen 2007 软件Carl Zeiss
Grace’s 昆虫培养基（添加型，1x）Sigma AldrichG8142H2G+ 叶蝉培养基组分
L-组氨酸一水合物Sigma AldrichH8125H2G+ 叶蝉培养基组分
Medium 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ 叶蝉培养基组分
Medium 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ 叶蝉培养基组分
Hank’s 平衡盐溶液 (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ 叶蝉培养基组分
L-谷氨酰胺 (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ 叶蝉培养基组分
MEM 氨基酸混合液 (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ 叶蝉培养基组分
1 M MgCl 溶液Sigma AldrichM8266H2G+ 叶蝉培养基组分
青霉素-链霉素（含谷氨酰胺）Sigma AldrichG6784H2G+ 叶蝉培养基组分
制霉菌素Sigma AldrichN6261H2G+ 叶蝉培养基组分
庆大霉素Sigma Aldrich46305H2G+ 叶蝉培养基组分
葡萄糖Sigma AldrichD9434H2G+ 叶蝉培养基组分
胎牛血清Sigma AldrichF2442H2G+ 叶蝉培养基组分

参考文献

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