自体血栓栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血性脑卒中模型

摘要

本文中，我们展示了一种在成年大鼠中使用同源血凝块（富含纤维蛋白）制备栓塞性大脑中动脉闭塞的标准方法。该模型能高度模拟人类缺血性脑卒中，适用于缺血性脑卒中溶栓治疗的临床前研究。

摘要

临床上，使用重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）进行溶栓治疗仍是急性缺血性脑卒中最有效的治疗方法。然而，tPA的应用受限于其较窄的治疗时间窗以及出血性转化风险的增加。迫切需要建立合适的脑卒中模型，以研究新的溶栓药物和缺血性脑卒中的治疗策略。目前，已在大鼠和小鼠中开发出两种主要的缺血性脑卒中模型：线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）模型和栓塞型MCAO模型。尽管线栓法MCAO模型已广泛应用于机制驱动型脑卒中研究，但这些线栓模型无法模拟临床实际情况，不适用于溶栓治疗的研究。在这些模型中，栓塞型MCAO模型更接近人类缺血性脑卒中的病理过程，适用于溶栓治疗的临床前研究。该栓塞模型最早由Overgaard 等¹于1992年在大鼠中建立，并由Zhang 等于1997年进一步完善²。尽管栓塞型MCAO模型日益受到关注，但许多实验室在技术上仍面临挑战。为了满足溶栓研究日益增长的需求，本文介绍一种高度可重复的大鼠栓塞型MCAO模型，该模型可在大脑中动脉供血区域内产生可预测的梗死体积。简言之，将改良的PE-50导管从颈外动脉（ECA）轻柔地插入至颈内动脉（ICA）管腔，直至导管尖端到达大脑中动脉（MCA）起始处；通过导管将单个同源血凝块置于MCA起始部位。为确认MCA阻塞是否成功，需监测局部脑血流量，并评估神经功能缺损程度和梗死体积。本文所介绍的技术将有助于研究人员克服建立该模型过程中的技术难题，推动脑卒中研究的发展。

引言

脑卒中是美国第三大死因，但针对急性脑卒中的治疗选择仍然有限。目前，静脉输注重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）以溶解血栓是治疗急性缺血性脑卒中最有效的疗法。然而，tPA的应用受限于其较窄的治疗时间窗以及增加的脑出血风险。因此，迫切需要建立一种适用于溶栓研究的脑卒中模型。

大脑中动脉（MCA）是人类脑卒中最常发生闭塞的动脉。针对该动脉，研究人员已建立了多种缺血性脑卒中的动物模型。目前，通过闭塞MCA已发展出两种主要的啮齿类动物局灶性脑缺血模型：线栓MCAO模型和栓塞MCAO模型。尽管通过血管内线栓技术建立的MCAO模型已广泛应用于机制驱动型脑卒中研究，但这些线栓模型并不能很好地模拟人类脑卒中，因为高达80%的人类脑卒中是由血栓形成或栓塞引起的。相比之下，使用血凝块建立的栓塞性脑卒中模型更接近人类脑卒中的实际情况，被认为适用于溶栓治疗的研究。该栓塞性模型最早由 Overgaard et al.¹于1992年在大鼠中建立，并由Zhang et al.于1997年²及Dinapoli et al.于2006年³进一步完善。尽管栓塞性MCAO模型日益受到关注，但许多实验室在技术操作上仍面临挑战。

本文介绍了一种在成年大鼠中使用同源血凝块制备栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）的标准方法，该方法可在大脑中动脉供血区域形成可预测的梗死灶。本文所展示的技术将有助于研究人员克服建立该脑卒中研究模型时遇到的技术难题。

方案

伦理声明：本方案使用雄性成年Sprague-Dawley大鼠（体重330-380 g）。本方案已获得路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的规定。

1. 改良型PE-50导管的制备

1. 用手将一根30 cm长的PE-50管置于燃气火焰上方，逐渐软化管子，然后轻轻拉伸。
2. 使用数字卡尺在拉伸后的管子上选择一点（图1），做好标记，并将改造后的PE-50管切割成一段25 cm长的部分，末端保留1 cm长的尖端（外径：0.30–0.34 mm）。

2. 同源血栓的制备

1. 在采血前，通过面罩使用异氟烷（诱导浓度5%，维持浓度2-3%）与70% N₂O 和30% O₂混合气体对大鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认麻醉效果。
2. 采用已发表的方法⁴ 对供体大鼠实施股动脉插管，将股动脉血液直接注入一段20 cm长的PE-50导管中。将导管置于室温下2小时以使血液凝固，随后在4 °C条件下保存22小时。注意：插管操作需按照3.1步骤所述的无菌技术进行。供体大鼠在操作后恢复，可用于后续取样。
3. 将PE-50导管切成50 mm长的片段，并用生理盐水冲洗，将血凝块冲出至含有生理盐水的无菌培养皿中。
4. 将50 mm长的血凝块转移至一段60 mm长的PE-10导管中，并将PE-10导管两端分别连接一段20 cm长的PE-50导管，后者连接装有生理盐水的1 ml注射器，并配有23 G针头（图2）。
5. 通过在两个注射器之间持续交替推动，使血凝块来回移动5分钟，以去除血凝块中的血细胞，并最大限度减少血管外凝血块的脆性，同时不破坏纤维蛋白核心结构。
6. 将血凝块切成40 mm长的片段，并在无菌条件下将其转移至经改造的PE-50导管中，操作方法如步骤1.2所述。注意：所有PE导管均经环氧乙烷灭菌。

3. 栓塞性大脑中动脉闭塞（图3A,B）

1. 将所有手术器械通过高压灭菌（至少121 °C、15 PSI，持续15分钟）进行灭菌。使用70%乙醇对手术台及相关手术设备进行消毒。
2. 按照步骤2.1所述方法用异氟烷麻醉大鼠。通过捏压双侧后肢脚趾测试麻醉深度，若观察到任何运动反应（如肢体回缩），表明动物尚未达到足够的麻醉深度，不可进行手术。在双眼上涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。使用电动剃毛器剃除颈部腹侧和头部区域的毛发，暴露皮肤。
3. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上。插入直肠探头，并使用恒温控制仪将体温维持在36.5–37.5 °C之间。
4. 先用10%聚维酮碘对剃毛后的皮肤及周围毛发进行消毒，再用70%乙醇脱碘。
5. 在解剖显微镜下于颈部做一条长约2 cm的正中切口。使用牵开器暴露手术视野，仔细分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和蝶腭动脉（PPA），使其脱离周围神经和筋膜（图3A）。注意：若无助手协助准备动物，术前应更换无菌手套。
6. 将颈总动脉（CCA）从周围神经中游离（避免损伤迷走神经），并在动脉下方穿入一根无菌5-0丝线。打一个滑结（#1），用小止血钳夹住丝线并向躯干方向拉紧。
7. 游离颈外动脉（ECA）及其两个分支：枕动脉（OA）和甲状腺上动脉（STA）。使用兽用高频电刀凝闭这两个分支。在ECA下方穿入两根无菌6-0丝线。
8. 将置于动脉下方的两根丝线分开，一根朝向头部（远端），另一根朝向躯干。在靠近头部的一侧打一个紧结（#2），用小止血钳夹住丝线并向头部方向拉紧。另一根丝线打一个松结（#3），留待后续使用。
9. 将颈内动脉（ICA）和蝶腭动脉（PPA）从周围神经中分离（避免损伤迷走神经）。用6-0丝线结扎PPA（#4）。在ICA周围用6-0丝线打一个滑结（#5）。也可选择使用微血管夹夹闭ICA。
10. 使用Vannas型弹簧剪在ECA上两个结扎线（紧结#2与松结#3）之间剪出一个小孔（半切口）。将含有血栓的改良PE-50导管插入切口，并推进至颈总动脉分叉处。适度收紧松结（#3），使其刚好固定导管并保持其在血管内的可移动性。
11. 在小孔处切断ECA，游离远端残端，并将其置于ECA与ICA分叉下方，以便改良导管顺利进入ICA。打开ICA，轻柔地将导管从ECA管腔推进至ICA，直至导管尖端到达大脑中动脉起始部（距分叉约17 mm）。注意：在将导管插入ECA前，需先用70%乙醇擦拭导管外表面，再用无菌生理盐水冲洗。
12. 使用100 μl Hamilton注射器，在10秒内通过改良PE-50导管注入血栓及10 μl生理盐水（图3B）。
13. 5分钟后将导管从ECA撤出。结扎ECA，恢复CCA血流。缝合颈部切口。

4. 监测局部脑血流量（rCBF）

1. 在大脑中动脉（MCA）阻塞前，于头皮正中做一条长1.2 cm的切口，暴露颅骨。使用牙科刮匙和无菌棉签清除颅骨表面的组织。注意：手术前，暴露的头皮区域及周围毛发需先用10%聚维酮碘消毒，再用70%乙醇处理。
2. 使用直径0.7 mm的球形不锈钢钻头，在冠状缝后方2 mm、外侧5 mm处钻一个直径1.5 mm的骨孔（图4）。
   注意：保持硬脑膜完整。
3. 将探头置于硬脑膜表面上方0.5 mm处。在栓塞后0（基线）、5、15、30、60、90和120分钟监测相对脑血流量（rCBF），并在静脉注射tPA后继续于5、15、30、45和60分钟进行监测。完成最后一次rCBF测量后，缝合头皮切口。注意：在颈部切口前，我们测量MCA阻塞前的rCBF作为基线；MCA阻塞后，在缝合关闭颈部切口后测量rCBF。因此，颈部切口始终保持无菌状态。

5. 术后护理

1. 皮下注射 2.5 ml 生理盐水以防止脱水，并在手术后立即皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），根据需要每 6–12 小时重复一次以缓解疼痛。
2. 停止异氟烷麻醉。将大鼠置于 37 °C 的兽用复苏舱内（保持动物温暖）并持续观察。大鼠通常在 10 分钟内恢复意识。随后将动物放入灭菌笼中，在笼内培养皿中放置一些湿润的食物，并将笼子送回动物灭菌室。
3. 脑卒中后 24 小时，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）处死大鼠。

6. 神经功能缺损评分

1. 在栓塞前及栓塞后2小时进行Bederson评分。采用先前描述的0-3级评分标准⁵：0分，提起大鼠尾部时，动物双侧前肢均伸向地面，无其他神经功能缺损（运动正常）；1分，提起大鼠尾部时，对侧前肢屈曲；2分，对侧向推力的抵抗能力下降（伴前肢屈曲），但无环行运动；3分，具有2分表现并出现环行运动。
   注意：栓塞后2小时Bederson评分为0分（无神经功能缺损）的大鼠应排除在进一步研究之外。

结果

采用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑缺血诱导期间的相对脑血流量（rCBF）^6,7。包括本实验室在内的许多实验室均使用rCBF来鉴定大脑中动脉（MCA）成功阻塞的动物模型，但不同实验室之间基线阈值存在差异，这与测量部位有关。LDF探头的位置置于前囟后方2 mm、外侧5 mm处，如先前所述⁶。在血栓注射后0、5、15、30、60、90和120分钟时监测rCBF。根据该数据，仅将rCBF较基线下降>70%的动物视为MCA成功栓塞性阻塞（图5）。在血栓注射后2小时，通过注射泵静脉给予标准剂量的组织型纤溶酶原激活剂（tPA，10 mg/kg）^7,8，其中10%作为推注剂量，90%在30分钟内持续输注^7,8。我们观察到，在tPA治疗开始后30分钟内，rCBF水平逐渐回升至基线值的>70%（图5）。

栓塞后24小时，处死动物并通过心脏灌注200 ml PBS以清除血管内血液。既往研究^2,3,7,8及我们的数据...

讨论

本研究中，我们展示了一种在大鼠中实施栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中模型的标准方法，该方法通过富含纤维蛋白的血栓阻塞大脑中动脉（MCA）的起始段。该模型的主要优势在于：使用富含纤维蛋白的血栓阻塞MCA主干，与人类的血栓栓塞性卒中相似；栓塞性卒中模型适用于开展溶栓治疗的临床前研究；此外，该模型可在MCA供血区域内形成可重复且可预测的梗死体积。

在进行栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型操作时，血栓的引入、稳定性和定位较难控制，这会导致梗死体积和受累脑区出现变异^2,3。既往研究表明，只有当阻塞血栓位于大脑中动脉主干时，才能在MCA供血区域获得可重复的缺血性病灶^2,3。为了精确地将血栓定位并建立可重复的栓塞性卒中模型，本研究展示了如何制备改良的PE-50导管，如何将该导管尖端送入大脑中动脉起始部，以及如何将富含纤维蛋白的血栓注入大脑中动脉。与既往报道一致²，在所有接受生理盐水治疗的大鼠中（n = 9），注射的血栓在栓塞后24小时均可清晰观察到位于大脑中动脉起始部；而在所有接受tPA治疗的大鼠中（n = 12），血栓则基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA）	化学试剂	基因泰克
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	化学试剂	西格玛	T8877
麻醉蒸发器	设备	索玛科技	Drager Vapor 19.1
可充电高速微型钻机	设备	精细科学工具公司	18000-17
弯头剪刀	设备	精细科学工具公司	14117-14
杜蒙特镊子（医用 #7）	设备	精细科学工具公司	11270-20
杜蒙特镊子（医用 #5）	设备	精细科学工具公司	11251-35
万纳斯式弹簧剪刀	设备	精细科学工具公司	15000-03
兽用复苏舱	设备	佩科服务公司	V1200
Genie Plus 注射泵	设备	肯特科学公司
大鼠脑切片模具	设备	肯特科学公司	RBMA-310C
数字卡尺	设备	世界精密仪器公司	501601
解剖显微镜	设备	世界精密仪器公司	PZMTIII-BS-LWD
哈密尔顿注射器	设备	哈密尔顿	型号 710
恒温毯控制单元	设备	哈佛仪器公司
电动剪毛器	设备	布雷恩特里科学公司	CLP-9931
兽用高频电刀	设备	MACAN 制造公司	MV-9
血流仪	设备	Adinstruments 公司
PowerLab 4/30	设备	Adinstruments 公司
LabChart 7.2	软件	Adinstruments 公司
1 ml 注射器	耗材	贝克顿·迪金森公司	309659
23 G 针头	耗材	贝克顿·迪金森公司	305143
30 G 针头	耗材	贝克顿·迪金森公司	305106
PE-50 导管	耗材	贝克顿·迪金森公司	427517
PE-10 导管	耗材	贝克顿·迪金森公司	427400
6-0 丝线缝合线	耗材	哈佛仪器公司	723287
5-0 丝线缝合线	耗材	哈佛仪器公司	517607