配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。
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摘要
摘要
成对记录技术涉及对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，不仅能够直接表征单个神经元之间的突触连接电生理特性，还可以对突触前或突触后神经元进行药理学操控。在海马脑片培养体系中进行该操作时，两个神经元之间形成突触连接的概率显著提高。该制备方法易于鉴定细胞类型，且神经元能够保持其形态以及与天然脑组织相似的突触功能特性。成对全细胞记录的一大优势在于，它能提供关于突触传递与突触可塑性特性的高度精确信息，而这些信息是其他采用细胞外轴突刺激的粗略技术所无法获得的。成对全细胞记录常被认为操作难度过高。尽管该技术确实存在挑战性，但任何接受过全细胞膜片钳训练的研究人员，只要遵循特定的硬件和方法学要求，均可成功实施该技术。获得突触连接的成对记录的成功率，与健康的脑片培养状态以及稳定的微操作系统的支持密切相关，后者可实现突触前和突触后全细胞记录的独立获取。虽然在脑片培养的海马组织中，CA3-CA3锥体细胞配对应用最为广泛，但该技术在CA3-CA1细胞对中也已成功实现，并可推广至同一脑片制备中任何存在突触连接的神经元组合。在本文中，我们将详细阐述在具备电生理设备的任何实验室中建立该技术所需的方法与条件。
引言
谷氨酸受体介导中枢神经系统突触处大部分的兴奋性突触传递。定位于突触后膜树突棘头部的两种主要离子型谷氨酸受体为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体。在静息膜电位下，AMPA受体在突触传递过程中承载大部分突触后电流。在海马中，NMDA受体在触发突触后膜AMPA受体数量变化方面起关键作用：它作为“共激活检测器”1，启动突触强度的改变1，参与被认为在亚细胞水平上支撑学习与记忆的突触机制。当突触后神经元去极化与突触前递质释放同时发生时，钙离子通过NMDA受体进入细胞，从而启动AMPA受体的插入或移除2。这些受体动态变化构成了突触可塑性的基础：突触强度的增强称为长时程增强2,3（LTP），而突触强度的减弱称为长时程抑制4（LTD）。因此，AMPA受体的移动被认为负责突触可塑性的表达，而NMDA受体则被认为控制其诱导过程。
确定突触传递和可塑性背后的精确机制需要研究少量突触，理想情况下是单个突触。尽管某些突触非常适合在此水平上进行研究，例如， 耳蜗核的卡尔西突触（Calyx of Held）5，但对于大多数突触群体而言，由于突触连接体积微小且分布弥散，实现单突触水平的研究极为困难。目前已发展出两种主要的电生理学技术用于检测单个突触连接：第一种是最小刺激法，即假定通过细胞....
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方案
动物伦理声明：
本手稿中描述的实验方案遵循奥克兰大学和斯坦福大学制定的动物护理指南。对出生7天的大鼠幼崽实施快速断头处死，随后立即按照下述方法进行海马体解剖。
1. 海马组织切片培养
- 准备
- 配制解剖用培养基（仅用于脑组织解剖）。将200 ml最低必需培养基、2 ml青霉素-链霉素溶液（每种10,000单位，溶于0.85% NaCl）、5 ml HEPES缓冲液、2 ml 1 M Tris储备液（pH 7.2）混合，用0.22 μm滤膜过滤除菌。在冰冻的解剖培养基中进行海马组织解剖。
- 冷却解剖液。在开始解剖前约1小时，将解剖液放入冷冻室，直至液体变得很冷。注意不要形成大的冰晶。使用前置于冰上保存。
- 配制培养基（用于除海马体解剖以外的所有操作）。将100 ml含Hank's盐、含L-谷氨酰胺的最低必需培养基（1x浓度，液体）、2 ml青霉素-链霉素溶液（液体，每种10,000单位，溶于0.85% NaCl）、2.5 ml HEPES 1 M缓冲液、50 ml Hank's平衡盐溶液、50 ml马血清（定义型，热灭活）混合，用0.22 μm滤膜过滤除菌。
- 准备培养皿。每个35 mm培养皿中加入1 ml培养基，并向每个培养皿中放入一个膜插件。将最多七个上述培养皿放入一个150 mm的培养皿（以下简称“板”）中。将该板....
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结果
通过记录电极向突触前神经元施加去极化电流脉冲（通常为20-50 pA，持续20毫秒）使其产生动作电位，从而观察突触连接的存在。随后检查突触后电流轨迹，寻找在突触前动作电位峰值之后较短（<5毫秒）且潜伏期一致的时间点是否出现单突触兴奋性突触后电流（EPSC）（图3A）。在大多数实验中，需要测试多个突触后神经元才能获得具有突触连接的一对细胞。总体而言，约有1/3的突触前CA3细胞通过活性突触连接单突触地与突触后CA3细胞相耦合（图3A），而大约20%的CA3神经元之间通过全沉默突触连接相连6,8。
在配对记录中，基础AMPA受体介导的电流幅度在不同试验之间存在变异性，且在不同的独立配对记录之间也存在差异（图3B）6,8。平均AMPA受体兴奋性突触后电流（EPSC）幅度范围从<10 pA到>800 pA，这种差异可能源于不同配对记录之间功能性突触数量的不同。此外，不同配对记录之间的突触传递失败率也表现出显著差异6,7.......
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讨论
本文介绍了在海马脑片器官型培养中建立成功的成对全细胞记录所需的技术要求。成对记录也可在多种其他制备样本中进行，包括急性脑片和离体细胞培养系统26,27。尽管本文重点在于诱导较长时间的突触可塑性（即长时程增强LTP和长时程抑制LTD），但需要强调的是，在器官型培养、急性脑片以及离体细胞制备中进行的成对全细胞记录，已为研究量子化大小、短时程可塑性、突触前功能以及LTP和LTD提供了重要的科学见解2,4,8,26,27。
器官型脑片系统的主要优势在于神经元之间具有更高的连接性。在急性脑片制备过程中，由于轴突连接被切断，导致突触连接性较低。根据我们的经验，在急性脑片中，仅有约5%的成对记录能够获得突触连接的CA3神经元，即95%的成对记录未发现连接。另一种替代方法是使用原代离体海马神经元培养，其突触连接性显著更高26然而，离体培养的分离制备物存在神经元身份鉴定困难，以及其特性是否与天然组织中成熟突触相似的问题。使用海马区脑片器官型培养可在一定程度上缓解这些担忧，因为神经元亚型易于识别，且细胞能够维持与天然脑组织相似的形态和连.......
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披露
作者无任何利益冲突可披露
致谢
我们感谢蒙哥马利实验室和麦迪逊实验室成员提供的有益讨论。本研究得到了以下机构的资助：NFNZ、AMRF、马斯登基金、HRC 和 NIH。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基 | 稳定型电动显微操作器 | ||
| 青霉素-链霉素溶液 | 浅层组织浴槽 | ||
| HEPES缓冲液 | DIC相机 | ||
| 1 M Tris储备液 | 放大器 | ||
| Hank’s平衡盐溶液 | 计算机 | ||
| 马血清 | 防振台 | ||
| 塑料涂层微型刮勺 | 直立显微镜 | ||
| 软毛画笔 | 数据采集与分析软件 | ||
| 手动组织切片机 | 电极拉制仪 | ||
| #2滤纸 | 法拉第笼 | ||
| #5镊子 | |||
| 膜插件 | |||
| CO2培养箱 | |||
| 解剖罩 | |||
| II级生物安全柜 |
参考文献
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T.
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