三维胶原基质中细胞迁移的分析

摘要

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。

摘要

迁移能力是多种细胞类型的特征，并在多个生理过程中发挥关键作用，包括 胚胎发育、伤口愈合以及免疫应答。然而，细胞迁移也是癌症中的关键机制，使癌细胞能够从原发肿瘤脱离，进而启动转移性扩散。近年来，已开发出多种细胞迁移检测方法，用于分析不同类型细胞的迁移行为。由于细胞在二维（2D）与三维（3D）环境中的运动行为存在显著差异，因此可认为，对嵌入于3D环境中的细胞迁移进行分析，将获得更具意义的细胞迁移数据。本研究所述的3D胶原基质迁移检测法的优势在于，细胞被嵌入由胶原纤维构成的生理型3D网络中，而胶原纤维是细胞外基质的主要成分。通过延时视频显微镜技术可实时测量细胞迁移，从而确定多种迁移参数，并分析这些参数在促迁移因子或抑制剂作用下的变化。该技术可用于分析多种细胞类型，包括淋巴细胞/白细胞、干细胞和肿瘤细胞。同样，也可将细胞簇或类球体嵌入胶原基质中，同时分析单个细胞从细胞簇/类球体迁移至胶原晶格的过程。我们总结认为，3D胶原基质迁移检测法是一种多功能的方法，可用于在类似生理的3D环境中分析细胞迁移。

引言

与细胞融合（综述见 ^1,2）类似，细胞迁移是另一种参与多种生理过程的生物学现象，包括胚胎发育、伤口愈合和免疫反应（综述见 ³）。然而，迁移能力也是肿瘤细胞发生转移的前提条件（综述见 ^3,4）。

细胞迁移是一个复杂且尚未完全阐明的过程，由多种配体（例如，细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、细胞外基质成分）与受体（例如，受体酪氨酸激酶、趋化因子受体、整合素）相互作用所启动的多条信号转导通路共同调控⁵，最终导致肌动蛋白细胞骨架的重组，同时伴随黏着斑复合物的解聚与再组装以及整合素介导的信号传导⁶。

为了分析细胞迁移，有多种方法 体外 和 体内 细胞迁移实验在过去几十年中不断发展，包括Boyden小室/Transwell实验⁷划痕实验/伤口愈合实验^8-10三维（3D）胶原基质迁移实验¹¹ 以及活体成像/显微镜技术（综述见 ¹²）。每种细胞迁移实验方法都有其优缺点， 例如，涉及成本、设备需求、操作难易度或所获数据的可靠性。

Boyden小室/Transwe....

方案

1. 迁移室的制备

1. 制备石蜡/凡士林（1:1）混合物并加热至完全融化。使用毛笔涂抹2-3次 在载玻片中央按比例涂布一层石蜡/凡士林（1:1）混合物 图示 1B-1D.
   注意：我们使用的是普通载玻片（76 × 26 × 1.0–1.5 mm（宽×长×高））
2. 迅速将熔化的石蜡/凡士林混合物涂抹于载玻片上，以免在绘制过程中凝固。确保石蜡/凡士林层的长度约为2-2.5 cm，宽度为0.3-0.5 cm，厚度约为0.1-0.15 cm。
3. 加入盖玻片，并用两到三层石蜡/凡士林混合物密封图1E，图1F）。进行常规细胞迁移实验时，使用4-8个迁移小室。将迁移小室垂直放置于支架中。

2. 胶原悬浮细胞混合物的制备

1. 收获（例如，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化并计数目标细胞。将细胞重悬于含胎牛血清（FCS）、抗生素及推荐添加剂的完全培养基中。准备4-8 1.5 ml 离心管和含有 4-6 x 10⁶ 细胞的 20 µl 细胞悬液⁴ 细胞（细胞总数取决于待分析的细胞类型），用完全培养基补至50 µl。
   注意：其他化合物（例如生长因子、趋化因子、抑制剂 等等。将适量的细胞悬液加入上述溶液中。使用适当....

结果

结合延时录像显微镜和计算机辅助细胞追踪技术的三维胶原基质迁移实验可用于测定多种细胞迁移参数，包括基于细胞群体的参数（例如，平均运动活性）和基于单个细胞的参数（例如，主动运动时间、速度、迁移距离）。图2展示了所获得的细胞追踪数据集、数据处理及数据呈现的示例。细胞追踪数据文件类似于一个表格（图2A），每一列代表一个被追踪的细胞，每次细胞迁移实验共追踪30个细胞。每一行记录了细胞在两个时间点之间是否发生移动的信息。“数值”之和表示细胞在两个时间点之间移动的距离（单位为“像素”），即该细胞的总迁移距离。该数值需乘以校正因子，将“像素”转换为“µm”。为减少假阳性细胞数量，将迁移距离小于25 µm的细胞定义为非移动细胞。每个细胞的速度（µm/min）通过将“总迁移距离”除以“观察期总时间（min）”计算得出。

为了表征细胞的运动行为，通常使用两个参数：运动活性（图 2D）表示所分析细胞群体的平均运动活性（或迁移速率），而主动运动时间（图2C.......

讨论

迁移能力是肿瘤细胞的显著特征之一⁴。若肿瘤细胞无法从原发灶脱离并穿过周围结缔组织迁移，则无法形成继发性病灶，而继发性病灶几乎是所有癌症患者死亡的主要原因。正因如此，目前许多研究聚焦于癌细胞的迁移过程。这些研究的目标是鉴定能够有效阻断肿瘤细胞迁移的新型靶分子和靶通路，从而抑制或延缓转移灶的形成。此类研究的一个实例是β-受体阻滞剂，已有研究表明其可在体外和体内抑制乳腺癌细胞的转移扩散in vitro 和 in vivo³⁶，并且与三阴性乳腺癌患者无复发生存期的改善相关³⁷。我们近期的研究表明，由人乳腺上皮细胞系与人乳腺癌细胞系自发融合形成的杂交细胞（而非亲本细胞）在趋化因子CCL21刺激下表现出增强的迁移活性²⁶。CCL21已被证实与包括乳腺癌在内的多种癌症类型的淋巴结转移形成相关³⁸，提示细胞融合可能是肿瘤（杂交）细胞获得转移特性的机制之一^39,40。

三维胶原基质迁移实验相较于Boyden小室/Transwell实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica DM IL 倒置显微镜	Leica, Wetzlar, Germany
显微镜载物台加热器	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 视频摄像机	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q 视频服务器	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 计算机	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
多摄像头视频监控软件（Security Spy）	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
石蜡	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
凡士林	本地药店
Purecol（液态胶原蛋白）	Nutacon BV, Leimuiden, 荷兰		含有 2.9 - 3.3 mg/ml 牛胶原蛋白（95% I 型胶原蛋白，5% IV 型胶原蛋白）
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% 碳酸氢钠溶液	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	先溶于 CHCl3；使用前用 DMSO 重悬