“anastasis”一词指的是濒死细胞在细胞自杀过程的晚期逆转该过程，自我修复并最终存活下来的现象。本文中，我们展示了检测和追踪经历anastasis细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
Anastasis（希腊语意为“起死回生”）指的是濒死细胞的恢复过程。在这些细胞恢复之前，它们已经经历了凋亡的重要检查点，包括线粒体断裂、线粒体细胞色素c释放到细胞质中、caspase的激活、染色质浓缩、DNA损伤、细胞核断裂、质膜出泡、细胞皱缩、磷脂酰丝氨酸在细胞表面的暴露以及凋亡小体的形成。当凋亡刺激在细胞死亡前被移除时，anastasis便可能发生，从而使濒死细胞逆转凋亡过程，甚至可能逆转其他死亡机制。因此，anastasis似乎涉及生理性的修复过程，但也可能不恰当地维持受损细胞的存活。目前anastasis的功能与机制仍不明确，部分原因在于缺乏有效的工具来检测那些看似健康但已恢复细胞的既往凋亡事件。开发用于检测anastasis的策略将有助于研究其生理机制、疾病病理中“不死细胞”可能带来的风险，以及调控anastasis的潜在治疗手段。本文中，我们描述了利用活细胞显微镜和哺乳动物caspase生物传感器 来识别和追踪哺乳动物细胞中anastasis的有效策略。
引言
凋亡（希腊语意为“走向死亡”）通常被认为是一个单向过程，最终导致细胞自杀1-7。通过基因手段破坏促死亡基因，可使本应死亡的额外细胞在整体动物中存活下来，包括那些已启动凋亡通路的细胞8,9。类似地，通过基因操作 可使 健康哺乳动物细胞人工展示“吃我”信号，或使其失去与细胞外基质的黏附性，从而分别逃避免疫细胞的全细胞吞噬或细胞间吞噬（entosis）导致的死亡10,11。然而 ，我们及其他研究者已证明，在不进行基因操作的情况下，正常的健康哺乳动物细胞及细胞系也能从凋亡的早期阶段恢复12-15。利用单细胞追踪技术，我们进一步证实了细胞可在凋亡晚期阶段恢复12,13，此时细胞已通过通常被认为是“不可逆点”的关键检查点2-6。这些晚期凋亡的检查点 包括线粒体释放细胞色素 c、caspase 的激活、细胞核碎裂以及凋亡小体的形成。我们采用了一个希腊复合词“anastasis”（意为“重获生命”），用来描述细胞在濒临死亡时发生的凋亡逆转现象2-6。
除非通过活细胞成像观察整个凋亡-恢复过程，否则很难区分经历了逆转凋亡（anastasis）的细胞与从未经历凋亡事件的细胞。数十年的研究表明，细胞凋亡过程中典型的形态学特征是由进化上保守的生化和分子事件所驱动的16-19
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方案
1. 活细胞成像用细胞的制备
- 为便于检测形态学变化，应选择贴壁生长的细胞，例如 HeLa（人宫颈癌）细胞，这类细胞在基质上呈扁平状，更有利于观察细胞膜及细胞内细胞器的改变。
注意：在多种哺乳动物细胞中均观察到凋亡逆转现象12,13，包括原代小鼠肝细胞、原代小鼠巨噬细胞、原代大鼠心肌细胞，以及多种细胞系，如人胚胎肾 HEK-293T 细胞、非洲绿猴肾上皮 COS-7 细胞、小鼠心肌 HL-1 细胞、小鼠 NIH 3T3 成纤维细胞、雪貂（Mustela putoris furo）脑 CRL1656 细胞、人皮肤癌 A375 细胞、人睾丸癌 CRL1973 细胞、人小细胞肺癌 H446 细胞、人肝癌 HepG2 细胞、人乳腺癌 MCF7 细胞、人前列腺癌 PC3 细胞和人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞。 - 使用无水乙醇预清洗玻璃底细胞培养皿中的玻璃盖玻片，以实现清洁与灭菌。
注意 1：建议使用玻璃底培养皿进行高质量微分干涉差（DIC）显微镜观察，以及高倍率共聚焦或落射荧光显微镜观察（见讨论部分）。
注意 2：在高倍放大（40X、60/63X 或 100X 物镜，数值孔径 1.3 或 1.4）条件下，使用底部玻璃更薄的细胞培养皿（厚度 0.085–0.16 mm）可提供更长的工作距离，有利于成像（见方案 3）。 - 根据细胞类型的不同，玻璃底培养皿在接种细胞前可能需要预先包被多聚赖氨酸（0.1 ....
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结果
为了研究细胞凋亡的逆转，首先将组织培养细胞暴露于一种死亡刺激以诱导凋亡。当细胞表现出凋亡的典型特征后，更换新鲜的培养基以清除刺激物，随后继续培养濒死细胞以观察其恢复情况（图1A）。此处所关注的关键问题是：单个濒死的培养细胞在凋亡进程中推进到何种程度后，仍可能发生凋亡逆转（anastasis）。通过以下所述方法，利用生物标志物对细胞命运进行连续监测，可明确回答这一问题。
我们首先介绍利用延时活细胞显微成像技术检测组织培养细胞中凋亡逆转的策略，该技术可用于追踪和记录单个细胞在受到凋亡刺激之前、期间及之后的反应。12,13健康的贴壁细胞在其附着的基质上伸展图1Bi)12,13，治疗前显示出线粒体呈纤维状，细胞核呈圆形图1Ci, Di, Ei, 菲, Gi)12,13在细胞培养基中加入3.8.......
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讨论
anastasis 指的是已激活细胞死亡通路的细胞随后逆转死亡过程并存活的现象。在此，我们证明了活细胞成像可用于确认同一个体细胞确实能够在晚期逆转凋亡性细胞死亡过程，并继续存活和增殖。我们的实验方案描述了多种经过优化的细胞类型特异性处理条件，以诱导凋亡，并使大量细胞发生可被多种生物标志物验证的凋亡逆转过程。在技术方面，由于玻璃底培养皿中细胞与物镜之间的薄层玻璃具有高度透光性，允许在高倍率下进行高质量的共聚焦或落射荧光显微观察，提供较长的工作距离，因此我们采用玻璃底培养皿培养用于成像的细胞12,13，便于观察经典的凋亡现象，包括线粒体断裂、细胞色素c释放以及细胞核浓缩和碎裂。此外，玻璃不会扭曲光的偏振状态，因而能够实现高质量的微分干涉差（DIC）显微观察，用于监测凋亡过程中的膜出泡、细胞皱缩及凋亡小体形成。相较于相差显微镜，DIC 显微镜在观察这些凋亡形态学特征方面具有优势，因为 DIC 能增强未染色且透明细胞样本的对比度，从而更清晰地识别细胞形态变化。如果无法获得 DIC 或相差显微镜，可使用 CellTracker 染色细胞质，以在共聚焦或落射荧光显微镜下勾勒活细胞形态，进而监测细胞形态变化。<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢拉尔夫·博尔曼牧师博士和詹姆斯·沃伊尔茨牧师博士建议使用“anastasis”一词来描述细胞凋亡的逆转过程；感谢道格拉斯·R·格林提供了稳定表达细胞色素c-GFP的HeLa细胞；感谢查尔斯·M·鲁丁和埃里克·E·加德纳提供了H446细胞；感谢希瑟·兰姆在视频动画绘制方面的协助；感谢杨怡慧对本手稿提出的宝贵讨论意见。本研究得到了西尔·爱德华·尤德纪念奖学金（H.L.T.）、史哲尔·斯泽托博士纪念奖学金（H.L.T.）、富布赖特基金项目007-2009（H.L.T.）、生命科学研究基金会博士后奖学金（H.L.T.）、美国国立卫生研究院基金项目NS037402（J.M.H.）和NS083373（J.M.H.），以及香港大学教育资助委员会AoE/B-07/99项目（M.C.F.）的资助。汤浩岚是生命科学研究基金会Shurl和Kay Curci基金会的博士后研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LSM780 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | ||
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| 透明 CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 独立培养基 | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| 荧光标记的膜联蛋白 V | Biovision | K201 |
参考文献
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of c....
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重印与许可
