用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

摘要

鸡胚视网膜细胞培养是研究光感受器生物学的重要工具。我们开发了一种基于高效基因转导技术的方法 ex ovo 在培养前对视网膜进行质粒电穿孔转染。该技术显著提高了现有方案的转染效率，使该系统的遗传操作成为可能。

摘要

源自鸡胚视网膜的富集视锥光感受器的培养体系已成为全球研究视网膜神经元（尤其是光感受器）生物学的研究人员不可或缺的工具。该系统的应用不仅限于基础研究，还可轻松适应高通量技术，用于药物开发。然而，在这些培养体系中对视网膜光感受器进行遗传操作一直极具挑战性，这严重限制了该系统的应用价值。我们近期开发并验证了一种ex ovo质粒电穿孔技术，与目前其他可用方案相比，该技术可将此类培养中视网膜细胞的转染效率提高五倍¹。该方法在鸡胚发育第27期摘除眼球，去除视网膜色素上皮（RPE），将视网膜杯置于含有质粒的溶液中，并使用简易自制电极进行电穿孔。随后将视网膜组织解离并按标准流程进行培养。该技术可用于基因过表达研究，也可用于基因表达的下调，例如通过质粒介导的RNA干扰（RNAi）技术，通常可在25%的光感受器细胞群体中实现转基因表达。本出版物采用视频形式，将使该技术更易于被相关领域研究人员获取，从而推动在原代视网膜培养体系中开展基因功能研究。我们还对本实验流程中关键步骤进行了详细说明，以确保实验成功及结果可重复。

引言

利用鸡胚视网膜的离体细胞培养已被广泛用于研究感光细胞生物学的多个方面，包括其存活^2-9、分化^10-12、神经突生长¹³等。该培养体系由 Ruben Adler 及其合作者于20世纪80年代建立，并由其团队及其他研究组进一步优化^14-20，其优势源于鸡作为动物模型的内在特性²¹。鸡眼即使在胚胎期也具有较大的体积，可为培养提供充足的组织材料。此外，当使用胚胎第5至6天（ED 5 - 6）的视网膜进行培养时，其祖细胞中有55 - 80%会分化为感光细胞^{14,15,18,22,23}；而该动物视网膜中约86%的感光细胞为视锥细胞²⁴，因此这类培养体系特别适用于针对视锥细胞的研究。

我们近期开发并表征了一种简单的方法，可实现这些培养物中细胞的高效质粒转染，从而通过促进基因错表达研究，拓宽了该体系的应用范围¹。该技术的开发源于科学文献中缺乏能够提供可接受转染效率、以用于在细胞自主性层面研究基因功能的方法。部分原因在于原代神经元培养物 notoriously 难以转染^25,26。此前可用于此目的的一些最常用技术包括化学转染方法，如脂质体转染或磷酸钙介导转染，其转染效率仅为3–5%左右，且可能产生显著的细胞毒性^27–32。尽管使用带有酶报告系统的质粒可通过信号放大来克服转染效率低的问题，但这类方法无法区分细胞特异性的效应，其结果基于少数细胞群体，可能无法代表整体情况。另一种在鸡胚中广泛使用的方法——RCAS病毒感染——仅适用于增殖细胞，因此不适用于本原代视网膜培养体系³³。

在本实验方案中，于第27发育阶段（胚胎第5天，ED 5）摘除鸡胚眼球，去除视网膜色素上皮（RPE），将视网膜杯状结构置于含有质粒溶液的电穿孔 chamber 中，使用自制电极进行电穿孔处理，随后采用标准技术进行视网膜细胞的解离与培养²¹。经过对该流程的优化，我们能够持续获得约22%的总体细胞转染效率，光感受器细胞群体中的转染效率可达25%，同时不影响细胞培养物的存活与分化特性¹。本文提供了该操作的详细步骤，以确保该技术的成功实施与可重复性。

方案

本研究中描述的所有操作均按照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会推荐的指南进行。

1. 提前准备：仪器、试剂和培养皿的准备

1. 卵的准备：将受精的白来航鸡卵置于37.5 °C、相对湿度60%的条件下，在卵孵化箱中孵育5天。
   注意：使用具有摇动功能的孵化箱可能有助于标准化和同步胚胎发育，但摇动对于本实验方案的结果并非必需。
2. 质粒准备：
   1. 根据需要设计用于基因过表达或下调的质粒构建体（例如通过RNAi技术^1,34）。在构建体中尽可能包含报告基因（如EGFP、RFP或LacZ）。
      注意：某些常用启动子（如CMV）可能随时间发生沉默。CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子）是一种极佳的替代选择，可实现目的基因的高效长期表达^35-37。
   2. 将质粒溶解于无菌PBS中，配制成浓度为1.5 µg/µl的溶液。可选： 可提前配制质粒溶液并冻存，待使用时取出。  
      注意：提高质粒浓度并不会显著提升转染效率，而降低质粒浓度则会降低转染效率¹。
3. 电极制备：
   1. 阳极使用带粗金尖的电极（参见特定材料/设备表）。用70%乙醇擦拭清洁。
      注意：建议对金尖电极进行绝缘处理，仅暴露约0.5 mm，以尽量减少电流泄漏。绝缘材料信息见特定材料表。
   2. 用2.5 mm见方的盒式灯丝（通常用于微电极拉制仪）、宽4.5 mm制作阴极。借助镊子将方盒展开并拉直成一条长丝。然后在解剖显微镜下，以直尺为引导，将灯丝弯成一个“U”形，底部长3 mm，一侧高2 mm，另一侧为灯丝剩余长度（图1，C - D）。用镊子夹住电极，浸入96%乙醇中，火焰灭菌。然后用小鳄鱼夹将导线连接至电极较长的一臂。
4. 电穿孔腔室的搭建：
   1. 通过剪下无菌1.5 ml微量离心管的管盖，并将其平整面朝下用胶带固定于100 mm培养皿上，制备电穿孔腔室（图1E）。
      注意：其他形式的、大小相似的孔状容器也可使用；但微量离心管管盖易于获取且可高压灭菌。腔室必须足够大以容纳鸡眼和阴极电极，但不宜过大，以免浪费质粒溶液。

2. Ex ovo 电穿孔操作步骤

1. 仪器准备：
   1. 将显微解剖工具（2 把用于打开蛋壳和挖出胚胎的大弯 Moloney 镊子，2 把用于去除视网膜色素上皮（RPE）的细尖弯 Dumont 镊子，1 把用于去除晶状体和玻璃体的 Bonn 有齿镊子）的尖端浸入 96% 乙醇中消毒，然后进行火焰灼烧灭菌。使用浸有 70% 乙醇的擦拭巾清洁解剖显微镜。将一瓶无钙镁 Hank's 平衡盐溶液（CMF-HBSS）置于 37 °C 水浴中预热。用预热的 CMF-HBSS 将 100 mm 无菌培养皿填充至 3/4 满。
   2. 将电穿孔腔置于另一台洁净的解剖显微镜下，并加入 120 µl 质粒溶液。将电极连接至电穿孔仪，确保自制电极连接负极，金尖电极连接正极。
2. 胚胎收集：
   1. 用浸有 70% 乙醇的擦拭巾擦拭蛋壳表面以清洁鸡蛋。在后续操作中始终保持无菌操作，避免将污染物带入培养体系。使用大弯 Moloney 镊子轻轻敲击蛋的圆端（气室上方），在蛋壳上小心开孔，然后夹住并移除蛋壳碎片。
   2. 用另一把镊子去除膜结构，并小心地将胚胎挖出（注意不要损伤胚胎），放入盛有 CMF-HBSS 的培养皿中。
      注意：根据 2.4.4 步骤中指定的数量，收集足够数量的视杯用于电穿孔。
   3. 关键步骤：根据 Hamburger 和 Hamilton³⁸ 标准对胚胎进行分期。
      注意：为获得最佳效率，胚胎应处于第 27 期（图 2A）。
   4. 使用 Moloney 镊子通过断头法处死胚胎。
3. 获取视杯：
   1. 使用细尖 Dumont 镊子小心摘除眼球，并转移至新的 CMF-HBSS 培养皿中。
   2. 从每只眼球的后部（靠近视神经头处）开始，使用两把细尖 Dumont 镊子，将每把镊子的一个尖端插入神经视网膜与 RPE 之间，小心剥离 RPE，注意不要损伤神经视网膜（图 2B）。
      注意：溶液中缺乏 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 有助于 RPE 更容易与神经视网膜分离。
4. 电穿孔：
   1. 设置电穿孔仪参数，输出 5 次方波脉冲，每次 15 伏特，持续 50 毫秒，间隔 950 毫秒。将“U”形负极电极放入电穿孔腔（装有 120 µl 含质粒溶液的微量离心管盖）中。
   2. 使用弯头 Dumont 镊子将一个视杯转移至电穿孔腔（通过舀取方式，不要按压），将其置于“U”形电极内，使视网膜后部朝向电极底部，晶状体朝上（图 2D）。
   3. 将阳极放置在眼球前部、靠近晶状体的位置，并使用电穿孔仪脚踏开关施加电脉冲。
   4. 将完成电穿孔的视杯转移至盛有 CMF-HBSS 的新培养皿中，并对剩余的每个视杯重复电穿孔操作。
      注意：使用同一份质粒溶液最多可对 6 个视杯进行电穿孔，而转染效率无明显下降。
   5. 用 Bonn 有齿镊子夹住每个电穿孔后视杯的 晶状体 和玻璃体，同时用弯头 Dumont 镊子背面固定眼球，轻轻通过瞳孔开口将其拉出。
   6. 按照标准流程进行电穿孔后视网膜细胞的解离与培养。
      注意：有关鸡胚视网膜细胞解离与培养的详细方案，请参见 Vergara 和 Canto-Soler, 2012, 补充文件 4²¹。在本方案中，细胞以低密度接种于多聚鸟氨酸包被的 6 孔板或 35 mm 培养皿中（每 35 mm 直径孔或皿接种 6 × 10⁵ 个细胞）。培养基为含青霉素/谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FCS）和 100 µg/ml 亚油酸-BSA 的 Medium 199。培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中维持。采用此方法，通常每个第 27 期电穿孔眼球可获得 5–6 × 10⁶ 个细胞。
      注意：理想情况下，从胚胎收集到细胞接种之间的时间不应超过 3 小时 ，以确保良好的细胞存活率并最小化应激反应。通常在培养 4 天后进行观察和进一步分析，因为此时细胞已实现良好的形态学和分子水平分化，且存活率仍然较高。

结果

本文介绍了一种将质粒转染至去核鸡视网膜杯中，随后进行解离细胞培养的简单方案。转染通过电穿孔实现，使用易于自制的定制电极（图1 - 2）。本方案所述参数已优化，可实现20%至27%之间的转染效率（平均为22%）（图3D）。请注意，由于上述原因，这些结果是在培养4天后进行定量的。在此背景下，转染效率是指在总细胞群体中表达外源基因的细胞所占的百分比。若仅考虑感光细胞群体，转染效率可提高至平均25%（图3D）。这一特性非常重要，因为此类培养体系主要用于感光细胞的研究。

使用该技术进行电穿孔的细胞培养物在微分干涉差（DIC）照明下的形态、细胞存活特性以及分子标志物（如视宁蛋白（光感受器的常用标志物）和Pax6¹）的表达方面，与其未经电穿孔的对照组细胞无法区分。

讨论

该实验方案成功最关键的一步是选择合适发育阶段的胚胎。在以往的文献中，此类培养所用的胚胎发育阶段通常以孵化天数或胚胎天数（ED）来界定，因此通常认为使用ED 5至ED 6的胚胎可获得相当的结果。然而我们发现，在27期（ED 5）时，转染效率约为总细胞群体的22%，如上所述；若使用28期胚胎（ED 5.5），效率则下降至16%；在29期时（ED 6）进一步降至12%¹。其他关键步骤包括在整个过程中维持无菌条件；掌握必要的手工操作技巧，以避免在解剖和电穿孔过程中损伤视网膜；以及避免从胚胎采集到细胞铺板之间出现过长时间间隔。

为确保较高的转染效率，另一个重要的考虑因素是含有质粒的溶液浓度：推荐的1.5 µg/µl是我们测试中不会导致效率下降的最低浓度。考虑到视杯是浸泡在该溶液中的，这一浓度意味着需要使用较大量的质粒材料。使用能够容纳眼球的最小规格容器（例如微量离心管管盖）可减轻这一问题。此外，多个眼球可使用同一份溶液进行电穿孔；我们发现，在同一份质粒溶液中连续对多达6个视杯进行电穿孔时，转染效率并未下降，可能还可处理更多样本，但此后效率的变化尚无法确认。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 电穿孔仪	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode，L形，5 mm金尖电极	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 型号 512	用作阳极的金尖电极
聚酰亚胺管	Vention Medical	定制	内径：0.5 mm；壁厚：0.15 - 0.2 mm。用于绝缘金尖电极
2.5 mm方形盒丝，4.5 mm宽	Sutter Instrument Company	FB245B	用于制作阴极电极
HBSS，无钙，无镁，无酚红	Gibco - Life Technologies	14175-095
Moloney 镊子	Roboz	RS-8254	带齿；轻微弯曲；4.5" 长度
Dumont 镊子 5/45	Roboz	RS-5058	型号 #5，45度角；0.10 × 0.06 mm 尖端尺寸；109 mm 长度
Bonn 显微镊，1×2 齿	Roboz	RS-5172	打结平台；1×2 齿，0.12 mm 齿长；3.75" 长度；0.3 mm 尖端宽度