本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
本论文阐述了一种利用附加体型质粒和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，从外周血高效制备无整合的人诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。该方法的优势包括：（1）仅需少量外周血作为起始材料；（2）使用非整合型重编程载体；（3）成本较低，可用于生成无载体残留的iPSCs；（4）仅需一次转染；（5）利用小分子化合物促进表观遗传重编程。简言之，从常规静脉采血样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在特定生长因子条件下培养，以获得高度增殖的红系祖细胞群体，该细胞群体对重编程具有极高的敏感性。通过单次核转染，将表达OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A以及p53短发夹RNA（shRNA）的非整合、非传播型附加体型质粒导入上述成红细胞中。共转染一个表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的附加体，可便于转染细胞的识别。此外，反应体系中还加入一种表达Epstein-Barr病毒核抗原1（EBNA1）的复制缺陷型质粒，以增强附加体蛋白的表达水平。转染后的细胞接种于经辐照处理的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）饲养层上，以继续重编程过程。在核转染约12天后，一旦出现类似iPSC的克隆，即向培养基中添加HDAC抑制剂，以促进表观遗传重塑。我们发现，加入HDAC抑制剂通常可使完全重编程的iPSC克隆数量提高2倍。当iPSC克隆呈现出典型的人胚胎干细胞（hESC）形态时，即可将其轻柔地转移至单独的、涂有iMEFs的组织培养板中，进行后续的生长与扩增。
引言
iPSC 来源于体细胞组织，通过异位表达一组最少数量的多能性基因获得。该技术最初通过逆转录病毒将人成纤维细胞转导 OCT4, SOX2, KLF4, 和 cMYC在多能性状态下高表达的基因1这些瞬时表达的“重编程因子”会改变靶细胞的表观遗传景观和基因表达谱，使其类似于人类胚胎干细胞2一旦生成，诱导多能干细胞（iPSCs）理论上可分化为任何类型的组织，用于进一步研究。因此，它们在再生医学、疾病建模和基因治疗应用中具有广阔前景。然而，使用整合型病毒对基因组进行干扰可能改变内源性基因表达、影响细胞表型，并最终导致科学结果出现偏差。此外，病毒的随机整合可能引发有害的细胞效应，包括恶性转化的风险。3 或癌基因转染基因的重新表达4未来的临床应用将需要非整合型iPSC的生成。
附加体（episomes）是一类染色体外的环状DNA分子，可作为一种生成成本较低且无整合的诱导多能干细胞（iPSCs）的策略5。如表1所示，所用的附加体载体共同表达重编程因子OCT4, SOX2, KLF4, MYCL和LIN28A。pCXLE_hOCT3/4-shp53-F质粒还包含一段p53的短发夹RNA（shRNA），用于暂时抑制TP53基因表达....
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方案
由Fred Hutchinson癌症研究中心和儿童医院机构审查委员会批准的书面知情同意书"费城儿童医院的患者在采集外周血样本前均获得了知情同意。所有实验均遵守机构指南。包括小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）制备和畸胎瘤形成在内的所有动物实验均经机构动物护理与使用委员会批准。
1. 使用Ficoll分离PBMCs并扩增成红细胞——第0天
- 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将外周血按1:1比例稀释。在15 ml圆底聚苯乙烯管中，小心地将7 ml稀释后的血液叠加于3 ml室温的Ficoll-Hypaque液面上。
- 以400 × g离心30分钟。
- 单个核细胞（PBMCs）将沉降至血浆与Ficoll-Hypaque之间的界面处，表现为一层浑浊的白色层。使用无菌移液管收集PBMCs至一个15 ml锥形管中，并用DPBS定容至10 ml。
- 使用血细胞计数板对PBMCs进行计数。
- 将2 × 106个PBMCs移入另一个15 ml锥形管中，以300 × g离心5分钟。将剩余细胞离心后，以2 × 106 PBMCs/ml的浓度悬浮于90%胎牛血清（FBS）/10%二甲基亚砜（DMSO）中并冻存。
- 配制扩增培养基：QBSF-60无血清培养基（避光保存）+ 青霉素/链霉素（1%）+ 抗坏血酸（50 ng/ml）+ 干细胞因子（SCF，5....
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结果
在进行核转染后三天，以及将核转染的细胞接种到iMEFs之前，应通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况，以评估核转染的成功效率。图1展示了一次典型的核转染实验，其中约有5-10%的细胞群体表达eGFP。
转染后约两周，重编程的诱导多能干细胞（iPSC）克隆将开始出现。这些克隆通常呈圆形，边界清晰，可根据人胚胎干细胞（hESC）的典型形态特征进行识别，包括：（1）细胞体积小、排列紧密，核质比高；（2）可见核仁（图2，明场）。未完全重编程的细胞会退化或形成异质性细胞团，易于与真正的iPSC克隆相区分。
在我们选择进行完全表征的代表性细胞系中，所有细胞系均表达标准的多能性标志物（图2），可重新激活内源性多能性基因（图2），并在注射到NOD-SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。
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讨论
采用本方案成功生成iPSC时，需注意以下几个关键事项。在红细胞母细胞扩增阶段，必须严格遵守培养基更换时间表，因为偏离该流程可能导致目标前体细胞群体刺激不足，从而降低iPSC的生成效率。每次更换培养基时，必须使用新配制的含新鲜地塞米松的扩增培养基；QBSF-60基础培养基和地塞米松在储存期间应避光保存。在核转染过程中，使用DPBS洗涤至关重要，目的是去除细胞悬液中可能引起核转染仪电流电弧的过量溶质，否则会导致大量细胞死亡。核转染后约10天，应每天观察培养板中iPSC克隆的出现情况。一旦出现多个小型克隆，应将重编程培养基更换为hESC培养基（含HDAC抑制剂），因为长期暴露于血清中可能诱发自发性分化。
根据实验室的配置和可用资源，可对本方案进行适当调整。我们倾向于采用低 O₂2 培养箱，因为低氧条件已被证明可提高诱导多能干细胞（iPSC）的生成效率13；然而，我们在使用含5% CO的常氧条件下，已成功从外周血中生成iPSCs2因此，标准的加湿CO₂2 也可使用培养箱。本方案中使用的小鼠胚胎成纤维细胞.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者希望感谢以下机构对本研究提供的资助：美国国立卫生研究院（NIH）提供的资助项目编号 K08DK082783（AR）、P30DK56465（BTS）、U01HL099993（BTS）、T32HL00715036（SKS）和 K12HL0806406（SKS）；以及 JP McCarthy 基金会（AR）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 菲可尔-帕克 PLUS（Ficoll-Paque PLUS） | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 45-001-750 | 4 °C 保存。使用前恢复至室温。 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | 生命技术公司（Life Technologies） | 14190-250 | 4 °C 保存。 |
| RPMI 1640 培养基 | 生命技术公司（Life Technologies） | 11875-093 | 4 °C 保存。 |
| 胎牛血清（FBS） | 生命技术公司（Life Technologies） | 10437028 | -20 °C 保存至使用前。解冻后分装，4 °C 保存。 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | 154938 | 室温保存。 |
| 无血清 QBSF-60 培养基 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 50-983-234 | 4 °C 保存。 |
| 青霉素/链霉素 | 生命技术公司（Life Technologies） | 15140122 | 4 °C 保存。 |
| 细胞系核转染试剂盒 V（Cell Line Nucleofector Kit V） | 龙沙公司（Lonza） | VCA-1003 | 4 °C 保存。 |
| 2% 明胶溶液 | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | G1393 | 4 °C 保存，使用前在 37 °C 水浴中液化。 |
| 汉克氏平衡盐溶液（HBSS） | 生命技术公司（Life Technologies） | 14175-103 | 4 °C 保存。 |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | 生命技术公司（Life Technologies） | 11965-092 | 4 °C 保存。 |
| 伊氏改良杜氏培养基（IMDM） | 生命技术公司（Life Technologies） | 12440-061 | 4 °C 保存。 |
| L-谷氨酰胺，200 mM | 生命技术公司（Life Technologies） | 25030-081 | 分装后于 -20 °C 冻存。 |
| 非必需氨基酸（NEAA），100X | 生命技术公司（Life Technologies） | 11140-050 | 4 °C 保存，避光。 |
| DMEM/Ham's F12 培养基（1:1） | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | SH30023.02 | 4 °C 保存。 |
| 无血清替代物（KnockOut Serum Replacement） | 生命技术公司（Life Technologies） | 10828-028 | 分装后于 -20 °C 冻存。 |
| 丙酮酸钠，100 mM | 生命技术公司（Life Technologies） | 11360-070 | 4 °C 保存。 |
| 碳酸氢钠，7.5% | 生命技术公司（Life Technologies） | 25080094 | 4 °C 保存。 |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | 生命技术公司（Life Technologies） | PHG0263 | 用 DPBS 配制成 10 mg/ml 储存液，分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 丁酸钠 | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | B5887-1G | 用 DPBS 配制成 2000 倍储存液（400 mM），分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 人胚胎干细胞克隆与复苏添加剂（hES Cell Cloning & Recovery Supplement） | Stemgent 公司 | 01-0014-500 | -20 °C 保存至使用前。解冻后 4 °C 保存。 |
| 适用于胚胎干细胞的 BD Matrigel | BD 生物科学公司（BD Biosciences） | 35-4277 | 在 4 °C 冰上过夜解冻，使用预冷的移液器吸头分装至预冷的离心管中。 -20 °C 保存至使用前。使用时在 4 °C 解冻并立即使用。 |
| StemSpan SFEM | STEMCELL 科技公司（STEMCELL Technologies） | 9650 | 分装后于 -20 °C 冻存。 |
| 粉末状抗坏血酸 | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | A4403-100MG | 用 DPBS 配制成 5 mg/ml 储存液，无菌过滤后 4 °C 保存。 |
| 重组人干细胞因子（SCF） | R & D 系统公司（R & D Systems） | 255-SC-010 | 用 SFEM 配制成 100 μg/ml 储存液，分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 重组人白细胞介素 3（IL-3） | R & D 系统公司（R & D Systems） | 203-IL-010 | 用 SFEM 配制成 100 μg/ml 储存液，分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 促红细胞生成素（EPO） | R & D 系统公司（R & D Systems） | 287-TC-500 | 用 SFEM 配制成 1000 U/ml 储存液，分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 重组人胰岛素样生长因子 1（IGF-1） | R & D 系统公司（R & D Systems） | 291-G1-200 | 用 SFEM 配制成 100 μg/ml 储存液，分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| β-巯基乙醇 | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | M7522 | 用 DPBS 配制成 1000 倍储存液（100 mM）。 |
| 地塞米松 | 西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich） | D4902-25MG | 用 DPBS 配制成 50 倍储存液（50 μM），无菌过滤后 4 °C 保存。 |
| SAHA（伏立诺他） | Cayman 化学公司（Cayman Chemical） | 149647-78-9 | 用 DPBS 配制成 2000 倍储存液（400 mM），分装后于 -20 °C 冻存。解冻后 4 °C 保存。 |
| 12 孔组织培养板 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 08-772-29 | |
| 15 ml 锥形离心管 | Sarstedt 公司 | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf 离心管 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 05-408-129 | |
| 6 孔组织培养板 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 08-772-1B | |
| 35 mm 组织培养板 | BD 生物科学公司（BD Biosciences） | 353001 | |
| 10 ml 一次性血清移液管 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 13-675-20 | |
| 5 ml 一次性血清移液管 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 13-675-22 | |
| 2 ml 一次性血清移液管 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 13-675-17 | |
| 20 μl 移液器吸头，带滤芯 | Genesee 公司 | 24-404 | |
| 玻璃巴斯德移液管 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 13-678-20D | |
| 移液器辅助器 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene 公司 | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene 公司 | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene 公司 | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene 公司 | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene 公司 | 37624 |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodelin....
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