从血液高效的iPS细胞生成使用附加体和HDAC抑制剂

摘要

在这里，我们描述了一种协议，用于使用基于附加体重编程的策略和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的外周血产生的诱导的人多能干细胞。

摘要

此稿件说明了一个协议，用于建立高效集成的无人类诱导多能干细胞从外周血中使用游离质粒和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂细胞​​（iPS细胞）。这种方法的优点包括：（1）使用的外周血作为源材料的最小量; （2）nonintegrating重编程载体; （3）具有成本效益的方法，用于产生向量自由iPSCs的; （4）单次转染;及（5）使用的小分子，以促进表观重编程。简言之，将外周血单核细胞（PBMC）从常规采血样品中分离，然后培养中所定义的生长因子，以产生高度增殖红细胞祖细胞群是非常适合进行再编程。 Nonintegrating，表达OCT4，SOX2，KLF4，MYCL，LIN28A和p53的短发夹（SH）RNA非传播游离质粒introdu通过单核转染土木工程署到来自红细胞。表达增强的绿色荧光蛋白的游离基因（绿色荧光蛋白）的共转染允许容易识别转染细胞。表达爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）一个单独的复制缺陷型的质粒也将被添加到该反应混合物中游离的蛋白的表达增加。然后转染的细胞接种在层照射的小鼠胚胎成纤维细胞（的iMEFs），用于持续重新编程。只要iPSC的样集落核转染后出现在大约十二天后，HDAC抑制剂被加入到培养基中，以方便后生重塑。我们已经发现，包含HDAC抑制剂的常规由2倍增加的完全重新编程的iPSC集落的生成。一次的iPSC集落呈现出典型的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的形态，它们被轻轻转移到个人IMEF涂覆组织培养板中进行的持续增长和扩展。

引言

iPS细胞是从体组织经由一组的多能性基因的最小的异位表达而得。该技术最初是由人成纤维细胞与OCT4，SOX2，KLF4和cMYC的 ，其高度表达在多能状态¹的逆转录病毒转导的展示。这些瞬时表达“重编程因子”改变靶细胞的表观遗传学景观和基因表达谱类似于人类胚胎干细胞^2。一旦创建了iPS细胞有可能分化成任何类型的组织作进一步调查。因此，它们有望用于再生医学，疾病建模和基因治疗的应用中使用。然而，破坏与整合的病毒基因组有改变内源基因的表达，影响细胞表型的潜力，最终偏置的科学成果。此外，随机的病毒整合可能会导致有害细胞éffects，包括恶性转化³或重新表达致癌基因的转基因⁴的可能性。未来的临床应用需要非整合的iPSC生成。

附加体，它是染色体外的环状DNA分子，提供了一项战略，以产生成本效益，整合无iPS细胞^5。在表1所示的附加 ​​型载体的组合表达重编程因子OCT4，SOX2，KLF4，MYCL和LIN28A。该pCXLE_hOCT3 / 4- shp53-F质粒还含有p53基因的shRNA对TP53的临时抑制，增强细胞的初始化^6。复制缺陷型pCXWB-EBNA1载体通过提供核抗原表达⁷一过性升高促进重编程因子的放大和提高重编程效率。该pCXLE_EGFP质粒可以被添加到核转染混合物为射探测器的目的rmining转染效率或用于细胞分选的应用程序。除P CXWB-EBNA1的，在该协议中使用的附加 ​​型质粒含有的Epstein-Barr病毒起源的病毒复制和EBNA1基因，其宿主细胞⁸的分裂过程介导的复制和附加体的分区。该附加体都不约而同的用连续的iPSC扩张⁷丢失。亚克隆和iPS细胞与附加型载体的损失，这可以从eGFP的表达缺失推断的特性，可能会导致完全集成免费的iPSC供将来的临床应用。

固有的iPSC生成的过程是抑制的细胞系特异性基因和多能性相关基因的重新激活。基因表达的调节发生在细胞核内的多个级别，包括修饰的DNA和染色质，以允许转录因子，调节DNA元件，和RNA聚合酶的访问目标基因。通过全球性染色质修饰的后生景观改造是重新表达的一个关键组成部分的多能性的遗传程序。一个具体的染色质修饰是在基因表达的调控是重要的乙酰化的组蛋白在特定的赖氨酸残基，其允许访问通过组蛋白的DNA线圈的张力下降到目标基因。 HDAC抑制剂是小分子已经显示出增强的iPSC重编程和人类胚胎干细胞的自我更新^9,10，可能是由于支承乙酰化状态^11。下面描述的协议中，适于从使用整合的慢病毒¹²的现有出版物，提供了从外周血使用附加体和HDAC抑制剂的步骤的分步方法优化的iPSC产生。这里所用的HDAC抑制剂浓度是半那些由洁具所描述的， 等。 ^{如图9所示} ，并经常导致了2倍的增加完全重新编程的iPSC集落，标准游离重编程协议，而不HDAC抑制剂。重新编程的这个水平看齐与我们观察到与慢病毒方法的效率。使用此协议，我们已经有效地产生iPSC的个人老87岁。

方案

签署知情同意书，批准由弗雷德·哈钦森癌症研究中心的机构审查委员会和儿童“费城医院，从患者采集外周血标本之前获得所有机构的指导方针的变化。所有的动物实验，包括MEF生成和畸胎瘤的形成被批准的机构动物护理和使用委员会。

外周血单个核细胞和红细胞扩张的1。聚蔗糖分离 - 0天

1. 稀释外周血1:1的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）。在一个15毫升的圆底聚苯乙烯试管，小心7层毫升稀释血置于3mL室温的Ficoll-Hypaque上的。
2. 离心样品以400×g离心30分钟。
3. 的外周血单个核细胞将落户在等离子和聚蔗糖 - 泛影葡胺，看作是一个白色混浊层之间的接口。用无菌移液管，收集PB管委会为一体的15毫升锥形管。使体积达到用DPBS 10毫升
4. 使用血球计数器，计数外周血单个核细胞。
5. 移液管2×10 ⁶个PBMC中到一个单独的15毫升锥形管中，离心分离机，在300×g离心5分钟。降速剩余细胞并冷冻，以2×10 ⁶个PBMC中/ ml，在90％胎牛血清（FBS）/ 10％二甲亚砜（DMSO）的浓度。
6. 制备膨胀介质：QBSF-60无血清培养基（避光）+青霉素/链霉素（1％）+抗坏血酸（50毫微克/毫升）+干细胞因子（SCF，50纳克/毫升）+。白细胞介素3（IL- 3，10纳克/毫升）+促红细胞生成素（EPO，2单位/毫升）+胰岛素样生长因子-1（IGF-1，40纳克/毫升）+地塞米松（1μM;从光保护;解冻新鲜等分试样的每个媒体改变）。
7. 重悬2×10 ⁶个PBMC中的2ml新鲜配制的扩展培养基，并放入12孔组织培养板的一个孔中，并孵育在37℃的潮湿培养箱具有5气氛％ _的 O _2，5％的CO ₂和90％N _2。
8. 在3日和6日，更换介质。
   1. 收集细胞并用2ml QBSF-60的洗井以收集任何残留的细胞。
   2. 离心细胞悬浮液，在300×g离心5分钟，吸出上清液。
   3. 悬浮细胞在2毫升的新拓展中，并将其返回到相同的12孔板。

2.重编程细胞的核转 - 9日

1. 吸管的重新编程质粒进入无菌1.5毫升Eppendorf管中（ 表1）。
2. 拌上补充（由制造商提供）和吸管核转解到无菌1.5毫升Eppendorf管中。
3. 吸管2毫升扩展中等入12孔板和地点的一个孔，在湿润的37℃培养箱（5％O _{2，5％CO 2}和90％N _2），用于平衡加入细胞之前的。
4. 收集培养的细胞和洗井用2ml QBSF-60，以收集剩余的细胞。
5. 离心将细胞在300×g离心5分钟，吸出上清液。
6. 通过重新悬浮于5ml的DPBS中，并在300×g离心离心5分钟清洗细胞。
7. 吸出上清液。
8. 悬浮于100μl核转染溶液+补充细胞沉淀，同时注意避免产生气泡。
9. 吸取细胞悬浮液到含有重编程的质粒，移液器上下一旦管，样品吸取到核转染反应杯的底部。
10. 将试管放入核转染机和运行程序的T-019。
11. 转移100微升的预热膨胀介质（从平衡化板在步骤2.3）进入核转试管。
12. 立即收集全部样品和沉积成的预热膨胀介质的井。避免收集白色，浮尸细胞碎片。
13. 将板在湿润的37℃培养箱（5％O _{2，5％CO 2}和90％N _2）的生长。

3.电镀饲养细胞 - 10日或11

1. 在第10天，板式给料机的细胞。
   1. 涂层1 6孔组织培养板用明胶。
      1. 吸管0.1％，1明胶中Hank氏缓冲盐溶液（HBSS）插入所述板的每个孔中。
      2. 将板在湿润的37℃培养箱中培养至少5分钟。
      3. 在即将使用前，吸从板的明胶溶液。
   2. 解冻的照射在3000 cGy的在10ml预热的MEF培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+胎牛血清（10％）+青霉素/链霉素（1％））的2×10 ⁶的小鼠胚胎成纤维细胞的一个小瓶。
   3. 离心将细胞在300×g离心5分钟，吸出上清液。重悬细胞于12ml MEF媒体和吸管2毫升我n要在明胶包被的6孔板的每个孔中。将板在湿润的37℃培养箱（5％O _{2，5％CO 2}和90％N _2），直到第12天。

4.在电镀饲养细胞和细胞介质变化 - 12日

1. 收集nucleofected细胞成一体的15毫升锥形管中，并通过洗涤以及用2ml QBSF-60的收集任何残留的细胞。离心样品以300×g离心5分钟。
2. 准备重编程培养基：Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM）+ FBS（10％）+非动物L-谷氨酰胺（1毫米）+非必需氨基酸（NEAA，1％）+青霉素/链霉素（1％）+β β-巯基乙醇（0.1毫摩尔）+碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，加入新鲜的在馈送，10纳克/毫升）+抗坏血酸（加入新鲜的进料，50微克/毫升）。
3. 吸出上清液，重悬细胞于12ml重编程中的。吸管2毫升％的细胞悬浮液以及成在6孔板饲养细胞（如准备在第3节）。离心反应板在50×g离心30分钟，在室温下进行。
4. 将板在湿润的37℃培养箱（5％O _{2，5％CO 2}和90％N _2）的生长。改变重编程中的每一天，直到IPSC的殖民地开始出现（1-2周）。
5. 制备人类胚胎干细胞培养基：DMEM / F12 1：1 +敲除血清替代品（20％）+青霉素/链霉素（1％）+ NEAA（1％）+非动物L-谷氨酰胺（1毫米）+丙酮酸钠（1％） +碳酸氢钠（0.12％）+β巯基乙醇（0.1毫摩尔）+ bFGF的（补充新鲜的进料，10纳克/毫升）的
6. 准备HDAC抑制剂：丁酸钠（在喂养补充新鲜的，100微米），suberanilohydroxamic酸（SAHA，加入新鲜的饲养，200纳米）。一旦IPSC的菌落出现，开始饲养细胞，人类胚胎干细胞中+ HDAC抑制剂，每天换液。
   注：丁酸钠是一种小分子被吸附到塑料管中，叔herefore其存储在硼硅玻璃管在4℃下。

5.隔离的iPSC克隆

1. 一次的iPSC集落有足够大的分离（20-25个细胞），选择其中一个，P20移液管。
2. 准备HDAC抑制剂：丁酸钠（加入新鲜的饲养，100微米），萨哈（补充新鲜的饲养，200纳米）
3. 将分离出的菌落到含有人类胚胎干细胞培养基+ HDAC抑制剂+克隆与恢复补充个人35毫米菜肴的iMEFs。
4. 当天采摘的殖民地后，改变介质为人类胚胎干细胞中+ HDAC抑制剂。
5. 每天更换培养基，直到IPSC的殖民地准备好传代。
6. 从介质中删除HDAC抑制剂一次菌落传代2-3稳定。

结果

核转染后三天和电镀nucleofected细胞上的iMEFs之前，成功的核转染的效率，应通过对eGFP的荧光显微术进行估计。 图1显示了一个典型的核转染实验用表达绿色荧光蛋白的总细胞群的约5-10％。

重新编程的iPSC克隆将开始核转染后出现大约两个星期。该菌落是具有明确定义的边界大致为圆形的，并且可以由人类胚胎干细胞特性的形态包括：（1）小的，紧凑的细胞具有较高的核质比和（2）可见核仁（ 图2中 ，明场）来确定。不完全重编程的细胞要么恶化或形成异质细胞团，很容易从真实的iPSC克隆区分开来。

我们已经选择了完全表征代表行，均表示了STANDARD多潜能标志物（ 图2），当注射入NOD-SCID小鼠激活内源性多能性基因（ 图2），并形成畸胎瘤。

讨论

对于成功的iPSC生成使用此协议的时候，有一些应该考虑几个重要的注意事项。在红细胞膨胀阶段，媒体改变调度必须严格遵守，因为偏差可能导致目标的祖细胞群体的低效刺激和iPSC的产生效率较低。重要的是，使用新鲜地塞米松与各介质变化的新的扩展介质;和QBSF-60基础培养基和地塞米松在存储期间应避光。在核转染，所述的DPBS洗涤是关键，除去从细胞悬浮液过量的溶质可能导致电流从nucleofector电弧，导致广泛的细胞死亡。核转染后大约10天，板应每天的iPSC集落的外观检查。一旦几个小菌落都存在，则重新编程中应该改变为人类胚胎干细胞培养基（用HDAC抑制剂），为prolongeD曝光血清可诱导自发分化。

根据实验室的设置和可利用的资源，修改的协议可以被考虑。我们优选的低O ₂的培养箱中，因为在低氧条件已被证明能增加的iPSC产生¹³的效率;然而，我们已经成功地使用在常氧条件下，用5％的CO ₂从外周血中产生的iPSC。因此，一个标准的加湿的CO ₂培养箱中也可使用。在这个协议中使用的MEF中可以从生命...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	储存温度为 4 °C。使用前请加热至室温。
DPBS	Life Technologies	14190-250	储存在 4 &°C。
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	储存在 4 °C。
胎牛血清 （FBS）	Life Technologies	10437028	储存在 -20 °C 直到需要为止。解冻，等分试样，储存在 4 °C 下。
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	154938	在室温下储存。
QBSF-60 无血清培养基	Fisher Scientific	50-983-234	储存在 4 &°C。
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122	储存在 4 &°C。
细胞系 Nucleofector Kit V	LONZA	VCA-1003	储存温度为 4 °C。
2% 明胶溶液	Sigma-Aldrich	G1393	储存在 4 °C，在 37 °C 中液化;C 使用前进行水浴。
Hank's 平衡盐水溶液 （HBSS）	Life Technologies	14175-103	储存在 4 &°C。
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Life Technologies	11965-092	储存温度为 4 °C。
Iscove 的改良 Dulbecco's Medium （IMDM）	Life Technologies	12440-061	储存在 4 &°C。
L-谷氨酰胺，200 mM	Life Technologies	25030-081	等分试样，在 -20 °C 下冷冻。
非必需氨基酸 （NEAA），100X	Life Technologies	11140-050	储存在 4 °C，避光。
DMEM/Ham's F12,1：1	Fisher Scientific	SH30023.02	商店，温度为 4 °C。
KnockOut 血清替代物	Life Technologies	10828-028	等分试样，在 -20 &°C 下冷冻。
丙酮酸钠，100 mM	Life Technologies	11360-070	储存在 4 &°C。
碳酸氢钠，7.5%	Life Technologies	25080094	储存温度为 4 &°C。
碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）	Life Technologies	PHG0263	制备 10 mg/ml 的 DPBS 原液，等分，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
丁酸钠	Sigma-Aldrich	B5887-1G	在 DPBS 中制备 2000x 原液 （400 mM），等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
hES 细胞克隆 &恢复补充剂	Stemgent	01-0014-500	储存在 -20 °C 直到需要为止。解冻后，储存在 4 °C 下。
经 ESC 认证的 BD 基质胶	BD Biosciences	35-4277	在 4 &°g 的冰上解冻过夜;C，使用预冷的移液器吸头分装到预冷的试管中。储存在 -20 °C 直到需要为止。在 4 °C、立即使用。
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	等分试样，在 -20 &°C 下冷冻。
抗坏血酸，粉末状	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	在 DPBS 中制备 5 mg/ml 原液，无菌过滤器，储存在 4 °C 下。
重组人干细胞因子 （SCF）	R &D Systems	255-SC-010	制造 100 μg/m SFEM 原液，等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
重组人白细胞介素 3 （IL-3）	R &D Systems	203-IL-010	制造 100 μg/ml SFEM 储备液，等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
促红细胞生成素 （EPO）	R &D Systems	287-TC-500	在 SFEM 中制备 1000 U/ml 原液，等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
重组人胰岛素样生长因子 1 （IGF-1）	R &D Systems	291-G1-200	制造 100 μg/ml SFEM 储备液，等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
&β;-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M7522	在 DPBS 中制备 1000x 原液 （100 mM）。
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x库存（50 &μ;M） 在 DPBS 中，无菌过滤器，在 4 &°C 下储存。
SAHA （伏立诺他）	开曼化学	149647-78-9	在 DPBS 中制备 2,000x 储备液 （400 mM），等分试样，在 -20 °C 下冷冻。解冻后，储存在 4 °C 下。
12 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml 锥形管	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
6 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue 培养板	BD Biosciences 353001
10 ml 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl 移液器吸头、屏障吸头	Genessee	24-404
玻璃巴斯德移液器	Fisher Scientific	13-678-20D
移液器辅助	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624