大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。
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本文内容
摘要
摘要
原位肿瘤模型目前是研究肿瘤类型特征的最佳方法，可在活体动物体内（特别是在具有独特生理和结构特性的部位如大脑）观察干预或非干预条件下的肿瘤行为。体外和异位模型无法模拟血管系统、血脑屏障、代谢、药物递送与毒性以及其他多种相关因素。尽管原位模型也存在局限性，但通过适当的技术，可将目标肿瘤细胞精确移植到最接近人类大脑环境的组织中。采用能够以恒定速率和压力将精确体积的细胞悬液递送至明确定位区域的方法，可重复性地建立具有可预测生长速率的人脑肿瘤小鼠模型，适用于对各种干预手段进行可靠分析。本文所述方案重点介绍颅内注射的设计与术前准备、手术操作的技术细节，以及确保肿瘤成功且可重复生长的关键步骤，并为多种可定制的脑肿瘤模型提供基础条件参考。
引言
体外对脑肿瘤细胞的研究对于解析驱动癌细胞生长、存活、迁移和侵袭的分子机制具有重要价值；培养细胞实验能够定义信号通路，提示潜在的治疗靶点，并表征细胞对药物处理的反应。然而，体外系统过于简化，无法准确预测机体对药物的反应；它们缺乏生理反应、免疫应答、细胞微环境以及活体动物系统整体的异质性。当可用时，基因工程模型可能极为有用，但不同物种之间存在分子差异，小鼠细胞可能无法重现人类过程中的事件，导致动物模型与临床观察结果之间出现显著差异1。通过皮下（SQ）注射将人脑肿瘤细胞系接种于小鼠 flank 区皮肤下的异种移植模型操作简便且易于测量；可用于研究基因修饰以及药物给药/递送、代谢和毒性的效应。然而，SQ 模型存在明显缺陷，限制了其应用价值。该模型的微环境无法模拟自然发生的脑肿瘤环境：各种细胞类型与组织之间的相互作用、局部血管系统，以及脑部特有的多种其他因素均无法复制。为了更准确地重现自然发生的脑肿瘤所特有的微环境，并测试药物干预的效果，应采用小鼠原位模型。此外，原位技术也可用于基因工程策略中，即对人源原代非癌变细胞（分化或前体细胞）进行遗传修饰，并将其注射到小鼠相应部位，可同时或不同时联合人源间质细胞，从而诱导产生类似于人类肿瘤发生的过程1。
本文介绍了一种在小鼠体内精确且可重复地诱导脑肿瘤的方法。利用该技术，操作者可将少量悬浮细胞准确注射至小鼠大脑皮层的额顶颞区域特定位置。该方法的小鼠死亡率极低；在我们已完成的185次手术中，无一例因手术并发症死亡。所形成的肿瘤特征可与典型的人类临床肿瘤进行比较，例如：生长速度、坏死程度、浸润范围、细胞类型的异质性、有丝分裂细胞的存在、增殖与凋亡标志物等。随后可基于细胞系或解离的人体组织及肿瘤样本模拟实际临床表型的能力对其进行评估。根据其在细胞培养中表现筛选出的药物，可在具有完整代谢系统、循环系统和血脑屏障的荷瘤动物模型中进行测试，从而在符合生理结构的背景下开展研究。此外，用于注射的细胞可经过基因修饰，以研究特定基因敲低、缺失、敲入、突变等对肿瘤生长和存活的影响。
已有大量出版物报道了采用多种颅内技术进行的肿瘤研究。Yamada 等 对染料和U87细胞的注射进行了详细研究，发现减小注射体积和降低注射速率可获得最佳肿瘤效果2. Brooks 等 使用微处理器控制的注射器递送病毒载体相较于手动方法具有更优的可重复性和效率；他们关于最佳注射参数的结论同样适用于细胞递送3. Shankavaram 等 表明，将多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系通过原位注射（使用手动方法）注入大脑后，其基因表达谱比其他两种情况更接近临床肿瘤的基因表达谱 体外 或SQ异种移植模型，支持将颅内模型用于临床前研究4. Giannini 等 将来源于人类手术标本、并通过连续传代在裸鼠 flank 部位维持的细胞注射到额外小鼠的脑内，证明该方法可在模型中保留患者肿瘤的基因改变5. Yi 报道了类似的结果 等6使用立体定位装置、精确定义的注射位点以及缓慢而稳定的注射速率，研究人员获得了可重复的脑肿瘤模型，其生长速率一致且移植成功率高（达100%）。该技术的有效性因此已得到充分验证；文献检索表明，该技术的应用范围广泛。Carty 等 采用颅内注射将表达治疗基因的病毒载体成功递送至阿尔茨海默病转基因模型的额叶皮层7. Thaci 等 描述了通过颅内注射将携带治疗性溶瘤腺病毒的神经干细胞载体递送至已原位接种胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤的裸鼠体内8显然，颅内注射是临床前研究中一种多功能且有效的工具。《视觉化实验杂志》早期发表的文章描述了基本的操作方法9-11但通过易于掌握的技术，我们将颅内肿瘤注射和原位建模的概念提升到了更高精度的水平。
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方案
所有描述的实验程序均经本机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 规划实验
- 选择待注射的细胞。多种来源的细胞均可作为注射候选：贴壁细胞系、基因修饰克隆、神经球细胞、原代培养细胞或解离的肿瘤组织。所需模型的类型将决定最合适的注射部位。
- 确定注射用细胞数量。形成肿瘤所需的细胞数量因细胞系而异，必须通过实验确定；肿瘤生长速度在很大程度上取决于细胞类型、细胞数量以及细胞培养传代次数。每针注射细胞数在 1 × 104 至 2 × 105 或更高范围内，均可产生不同生长速率的肿瘤。
- 限制注射体积。细胞应悬浮于尽可能小体积的无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中，以确保其能顺利、轻松地通过 26 G 针头。实际注入脑内的体积越小，所形成的肿瘤位置越精确、边界越清晰；注射体积控制在 3 至 6 µl 范围内可获得最佳效果。无论计划进行多少次注射，均应准备至少 50 µl 的细胞悬液总体积，以便准确测量、混匀和取样。
- 选择适合模型的实验小鼠。人类肿瘤的鼠类模型通常使用年轻的免疫缺陷小鼠，以避免免疫介导的移植物排斥反应。只要采取适当预防措施（包括去污染、消毒和器械灭菌），操作无需在生物安全柜中进行。本实验所用为 6 至 12 周龄的雄性和雌性裸鼠（athymic nude mice）。体重低于 20 g 的小鼠在立体定位仪上固定时可能存在困难，且更易发生低体温。
2. 组装设备
- 获取并消毒小鼠立体定位仪、对准控制台、小鼠气体麻醉头固定装置、微量注射泵、加热垫、麻醉机、光纤工作灯以及可调速旋转钻。对所有设备进行清洁和消毒处理。
- 设定注射参数（包括注射体积、流速、速率单位、注射器类型）以及微量注射泵运行所需的其他变量。根据每种具体型号优化设置。
注：本实验中采用的参数为使用25 µl注射器（设备类型“E”），以400 nl/min的速率（速率单位“M”）注射3,000 nl样品，工作模式为非分组模式（“N”）。 - 用无菌去离子水（diH2O）和70%乙醇（EtOH）反复冲洗一支带26 G 针头的精密微量注射器，最后用diH2O完成终末冲洗。部分型号（非全部）设计为可高压灭菌。确保推杆运动顺畅且无阻力。
- 准备麻醉给药设备。异氟烷为首选麻醉剂，因其易于调控麻醉深度与持续时间。确保立体定位仪配备小鼠用麻醉气体连接装置，并正确安装必要的管道和接头，以将麻醉机输出的气体混合物输送至小鼠。
- 将手术器械进行高压灭菌，包括精细剪刀、两把带齿镊子/止血钳（用于缝合）、中号剪刀、中号和细尖镊子，以及至少两个1 mm牙科钻头。术中使用70% EtOH、消毒剂或干热灭菌器保持器械清洁。
- 从兽医或医疗用品处获取异氟烷、镇痛剂、眼用软膏/润滑剂、抗生素软膏、生理盐水、30%过氧化氢（H2O2）、消毒剂以及骨蜡（如需要）。准备无菌去离子水（diH2O）和70%乙醇。一次性用品如纱布垫、无菌敷料、缝合线、乙醇棉片、棉签、无菌外科手套、手术刀片等详见材料清单。用于标记颅骨的细尖永久性记号笔应经过消毒，并专用于外科操作。
3. 准备注射用细胞
- 在本实验中，选择一种永生化的人源胶质母细胞瘤（GBM）细胞系。根据经验确定细胞数量（2 × 105）和注射体积（3 µl）；具体参数可能因细胞类型而异。使用至少50 µl的体积，以便准确测量、混匀和注射。
- 用胰酶消化细胞，并重悬于培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中。在细胞注射前立即执行以下步骤：
- 通过抽吸去除细胞培养基，并用每块100 mm培养皿10 ml PBS清洗一次，随后去除PBS。
- 向每块100 mm培养皿中加入1 ml胰酶，在室温下孵育足够时间，直至形成单细胞悬液。
- 每块100 mm培养皿加入5 ml含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以终止胰酶活性。
- 以450 × g离心沉淀细胞，并将每块100 mm培养皿的细胞重悬于约5 ml无血清DMEM（SF-DMEM）中。
- 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。
- 通过离心沉淀细胞并重悬于SF-DMEM中，将活细胞密度调整至2 × 105 个细胞/3 µl（或根据实验确定的其他数值）。
- 将细胞置于冰上或冰袋中保持低温（切勿使细胞冻结）。通过轻弹管壁轻轻混匀。
4. 麻醉小鼠并进行手术准备
- 使用约 5% 的异氟烷（氧气流速约 2 L/min）诱导麻醉，或根据兽医指导进行。诱导时间应为 2 至 3 分钟。以约 3% 的异氟烷维持小鼠适宜的麻醉深度。
- 通过夹捏脚趾检查麻醉深度，必要时调整异氟烷浓度，并在手术过程中持续监测呼吸和脚趾夹捏反应。用纱布垫覆盖小鼠以保持体温，并在整个手术过程中定期观察小鼠状态，手术可能持续 45 分钟至 1 小时，具体时间取决于注射速度。
- 小心地将腭杆滑过舌头并置入小鼠口中，将小鼠固定于立体定位仪上。将前门齿钩入齿孔中。使用耳杆固定头部，使眼耳平面尽可能水平。切勿强行将耳杆插入耳道。确保头部固定牢固至关重要：应用指尖轻轻检查头部左右及上下方向的移动情况。使用立体定位仪的可调节控制装置优化固定位置。
- 用眼用软膏润滑眼睛。使用聚维酮碘消毒剂和 70% 乙醇交替擦拭耳眼之间的皮肤区域两次。
- 皮下（SQ）注射选定的镇痛药物至小鼠侧腹部（或按指导进行）。
5. 进行注射
- 确定注射位点。注射位点可能因小鼠的品系、大小以及细胞类型而异。若细胞注射位置过于靠近脑室，可能导致颅脊髓扩散性疾病；若注射过浅，细胞可能沿针道向外生长。
注意：在本实验中，注射靶点定义为大脑皮层的额叶区域，相对于前囟（bregma）向右 2.5 mm、前 1.5 mm、腹侧 3.5 mm 的位置（图1），该位点可在体重为 20 至 30 g 的小鼠中诱导中脑肿瘤。 - 采用无菌技术在小鼠头部皮肤上做一个小切口（约 8 mm 长），暴露前囟及注射位点。从正中轴线与右眼之间某点向右耳方向做一斜切口（图2），可同时暴露前囟和注射位点。
- 将皮肤拉开，用无菌棉签擦干颅骨表面。再用另一支蘸有 H2O2 的棉签轻拭骨面以显示前囟。H2O2 会产生氧气气泡，在前囟交汇处的冠状缝和矢状缝上形成白色泡沫细线。
- 将装有针头的空注射器固定在微量泵上，移动针尖正对前囟位置；在定位控制台上将坐标设为外侧 0.0 mm、前后 0.0 mm、腹背 0.0 mm。
- 使用立体定位仪的调节旋钮，将针尖移动至相对于前囟外侧 2.5 mm（右侧）和前侧 1.5 mm 的位置（或目标位置）。略微抬起注射器，用专用记号笔在颅骨上标记确切位置。若颅骨外表面与前囟不在同一水平面（即，腹背坐标不再显示为零），应将腹背读数重置为 0.0，以确保注射深度不发生偏移。
- 使用配备无菌牙科钻头的手持旋转钻机，在步骤 5.5 中标记的适当位置钻一个小孔。将钻头以一定角度接触颅骨，并极其轻柔地触碰骨面。根据需要重复操作。钻孔时应几乎穿透但不完全穿透骨层，由针头最终穿透剩余骨层，以实现最干净的注射。
- 用蘸有 PBS 或生理盐水的棉签清除骨屑。将注射器重新装回泵上，并将针头垂直下降至钻孔处以确认位置。若钻孔未对准针头中心，可用钻头扩大开口。
- 轻轻混匀细胞悬液，并通过泵控制器将细胞吸入注射器。避免产生气泡或细胞团块，用酒精棉签擦拭针头外表面以去除可能污染的细胞。若注射器/针头发生堵塞或卡滞，应立即取下，用无菌水和 70% 乙醇快速清洗。
- 将针头降至颅骨表面水平（腹背 0.0 mm）。然后缓慢地（约 1 分钟内）将针头继续垂直下插，穿透颅骨全层并进入脑组织至腹侧 4 mm 深度，再缓慢回撤至腹侧 3.5 mm。若小鼠头部在立体定位仪中固定牢固，颅骨应几乎无移动。
- 确认泵控制器中已输入正确的参数（见第 2.2 节），按下“RUN/STOP”键（或按产品说明书指示）自动注射细胞。密切观察小鼠状态，必要时调整异氟烷浓度。观察注射器，确保活塞在针筒内正常移动。活塞卡滞或冻结可能导致其弯曲或断裂。
- 注射完成后，将针头保留在脑内 1 至 2 分钟，然后非常缓慢地（3 至 4 分钟内）将针头从组织中撤出。注射结束后完全拔出针头的总时间为 5 分钟。用棉签轻拭钻孔周围区域，保持皮肤边缘开放，以便颅骨干燥。
- 将注射器从泵上取下，迅速用无菌 H2O 冲洗 3 次 ，70% 乙醇冲洗 3 次 ，再用无菌 H2O 冲洗 3 次 （或按制造商说明操作）。用乙醇擦拭针头后放置一旁。
- 将无菌骨蜡（相当于 1 或 2 µl）涂抹于钻孔处，并用无菌棉签的木质端将骨蜡压入骨孔内。若骨面充分干燥，骨蜡应能牢固粘附。
- 将无菌手术巾覆盖于小鼠及周围操作区域，缝合切口，三针即可。也可使用外科粘合剂。局部涂抹抗生素。
- 将异氟烷浓度降至 0%，小心将小鼠从立体定位仪中取出，注意保护牙齿。检查耳朵、口腔和舌头。
- 注射后密切监测小鼠状态。将小鼠置于加热垫上 5 至 10 分钟，随后转移至笼中（仍置于加热垫上），持续观察直至小鼠苏醒并能自主活动。在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。在完全恢复前，不得将其与其他动物合笼。若观察到疼痛迹象，应考虑使用额外镇痛剂。
6. 完成并监测恢复 & 肿瘤发展
- 在每只小鼠之间使用70%乙醇、玻璃珠灭菌器或消毒剂清洁所有器械和设备。
- 操作后连续两天监测注射小鼠是否出现疼痛、感染或其他并发症迹象。操作后24小时和48小时（或按指示）注射镇痛剂。如有必要，在7至10天后拆除缝线。
- 评估小鼠是否出现疾病临床症状，如瘫痪、活动减少、体重减轻、癫痫发作或一般性病症。
- 采用适当方法监测肿瘤发育情况[如磁共振成像（MRI）、In Vivo 成像系统（IVIS）等]。
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结果
采用所述技术可建立可靠的颅内异种移植模型。识别小鼠颅骨的关键结构（图1）有助于定位前囟，并引导研究者准确且可重复地确定注射位点。在本研究中，将U251亲本细胞系、转染荧光素酶的U251细胞（U251-Luc）或U87永生化人胶质母细胞瘤组织培养细胞悬浮于4至6 µl的SF-DMEM中，并相对于前囟在右侧2.5 mm、前侧1.5 mm、腹侧3.5 mm处进行注射（图2）。
可通过磁共振成像（MRI，图3）、体内发光成像（IVIS，图4）或常规大体病理学技术（H&E染色，图5）对所形成的肿瘤进行可视化观察和分析。必须格外注意并进行优化，以确定合适的细胞类型和注射部位，从而准确反映预期的成瘤时间、生长速度及肿瘤模型特征。
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讨论
人脑癌的原位小鼠模型是评估临床治疗效果的优良工具，但在将细胞植入脑组织时必须优化操作以确保精准定位。研究表明，过大的接种体积、不理想的注射技术以及过快的注射速度可能导致细胞外漏，并使肿瘤细胞出现在非目标区域（如脑室、脊髓、硬膜外区域）。 等等肿瘤大小存在显著差异2 （个人观察）。对微处理器驱动的非细胞样品递送进行的分析发现，与手动注射方法相比，使用微泵可实现更局灶化的递送、更少的样品回流以及更小的变异度，这归因于其平稳、均匀的递送过程和稳定的压力控制。3尽管将所需数量的细胞浓缩于仅2或4 µl的体积中可能存在挑战，但使用配备可编程微泵的立体定位仪和对准控制台，可获得具有相似生长速率、可重复且可靠的肿瘤。异种移植模型无法完全复制天然肿瘤的微环境、发生及发展过程，尤其是在免疫缺陷宿主中；但设计合理且实施良好的原位移植模型是最佳替代方案，远优于异位移植模型。
该方案的主要优势在于能够在一致的时间范围内建立可检测的肿瘤。肿瘤出现的时间取决于细胞类型和注射的细胞数量，但具有较高的可预测性，且大多数肿瘤的形成时间相对于整个肿瘤生长时...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Keating 博士的研究由美国国防部资助项目 CA100335 提供经费支持，并且是圣·巴尔德里克基金会学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备 | |||
| 带数字显示控制台的小动物立体定位仪 | Kopf | Model 940 | |
| 小鼠气体麻醉头固定器 | Kopf | Model 923-B | |
| 小鼠耳杆 | Kopf | Medel 922 | |
| 光纤照明器 | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III 微量泵 | WPI | UMP3 | |
| Micro4 微处理器 | WPI | UMC4 | |
| 可变速手持式旋转钻机 | Dremel | Model 300 | |
| 牙科钻头，1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| 牙科钻头适配器：3/32 英寸夹头 | Dremel | 481 | |
| 加热垫 | 用于小鼠 | ||
| 异氟烷蒸发器系统 | 用于小鼠 | ||
| 医用导管及连接件 | 用于连接异氟烷蒸发器与立体定位架 | ||
| 器械 | |||
| 精密 25 μl 微量注射器 | Hamilton | 7636-01 | Model 702，不带针头 |
| 微量注射器针头，26s G | Hamilton | 7804-04 | RN，25 mm，尖端类型 2 |
| 细尖剪刀（直型，锐/锐） | |||
| 中号标准剪刀 | |||
| 标准齿状镊 | |||
| 齿状止血钳（2 把） | |||
| 细尖镊 | |||
| 耗材 | |||
| 5-0 Vicryl P-3 13 mm 缝合线（Ethicon） | MWI | J463G | |
| 手术刀片 #10，不锈钢（Feather） | Fisher | 296#10 | |
| 异氟烷（Fluriso） | VetOne | NDC 13985-528-60 | 货号 #502017。液体吸入性麻醉剂。根据联邦法律，此药品仅限持证兽医使用或在其指导下使用。 |
| 卡洛芬（Rimadyl 注射液 50 mg/ml） | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | 用生理盐水稀释 |
| 眼用软膏（人工泪液） | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| 外用抗生素（AK-Poly-Bac） | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| 聚维酮碘外用消毒剂，10%（Betadine） | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| 过氧化氢，30% | Fisher | H325-100 | 用于可视化颅骨标志 |
| 无菌生理盐水 | VetOne | NDC 13985-807-25 | 用于稀释溶液、清洗组织 |
| 骨蜡 | WPI | Item #501771 | |
| 无菌手术巾 | McKesson | 25-517 | |
| 无菌外科手套 | McKesson | （合适尺寸） | |
| 无菌纱布垫，2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| 无菌纱布垫，4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| 酒精消毒棉片（中号） | PDI | B603 | |
| 无菌棉签 | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| 带盖无菌 0.5 ml 螺口管 | USA Scientific | 1405-4700 | 用于细胞 |
| 独立包装的无菌一次性移液管 | Fisher | BD 357575 | 用于针头清洗液 |
| BD 带针头的胰岛素注射器 | Fisher | 329461 | 用于镇痛 |
| 70% 乙醇 | 用于清洁 | ||
| 无菌去离子水（diH2O） | 用于清洁 | ||
| 用于清洗液的微量离心管 | 用于针头清洗液 | ||
| 记号笔（专用） | 用于标记颅骨 |
参考文献
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
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- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626(2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
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