创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

摘要

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。

摘要

原位肿瘤模型目前是研究肿瘤类型特征的最佳方法，可在活体动物体内（特别是在具有独特生理和结构特性的部位如大脑）观察干预或非干预条件下的肿瘤行为。体外和异位模型无法模拟血管系统、血脑屏障、代谢、药物递送与毒性以及其他多种相关因素。尽管原位模型也存在局限性，但通过适当的技术，可将目标肿瘤细胞精确移植到最接近人类大脑环境的组织中。采用能够以恒定速率和压力将精确体积的细胞悬液递送至明确定位区域的方法，可重复性地建立具有可预测生长速率的人脑肿瘤小鼠模型，适用于对各种干预手段进行可靠分析。本文所述方案重点介绍颅内注射的设计与术前准备、手术操作的技术细节，以及确保肿瘤成功且可重复生长的关键步骤，并为多种可定制的脑肿瘤模型提供基础条件参考。

引言

体外对脑肿瘤细胞的研究对于解析驱动癌细胞生长、存活、迁移和侵袭的分子机制具有重要价值；培养细胞实验能够定义信号通路，提示潜在的治疗靶点，并表征细胞对药物处理的反应。然而，体外系统过于简化，无法准确预测机体对药物的反应；它们缺乏生理反应、免疫应答、细胞微环境以及活体动物系统整体的异质性。当可用时，基因工程模型可能极为有用，但不同物种之间存在分子差异，小鼠细胞可能无法重现人类过程中的事件，导致动物模型与临床观察结果之间出现显著差异¹。通过皮下（SQ）注射将人脑肿瘤细胞系接种于小鼠 flank 区皮肤下的异种移植模型操作简便且易于测量；可用于研究基因修饰以及药物给药/递送、代谢和毒性的效应。然而，SQ 模型存在明显缺陷，限制了其应用价值。该模型的微环境无法模拟自然发生的脑肿瘤环境：各种细胞类型与组织之间的相互作用、局部血管系统，以及脑部特有的多种其他因素均无法复制。为了更准确地重现自然发生的脑肿瘤所特有的微环境，并测试药物干预的效果，应采用小鼠原位模型。此外，原位技术也可用于基因工程策略中，即对人源原代非癌变细胞（分化或前体细胞）进行遗传修饰，并将其注射到小鼠相应部位，可同时或不同时联合人源间质细胞，从而诱导产生类似于人类肿瘤发生的过程¹。

本文介绍了一种在小鼠体内精确且可重复地诱导脑肿瘤的方法。利用该技术，操作者可将少量悬浮细胞准确注射至小鼠大脑皮层的额顶颞区域特定位置。该方法的小鼠死亡率极低；在我们....

方案

所有描述的实验程序均经本机构动物护理和使用委员会审查并批准。

1. 规划实验

1. 选择待注射的细胞。多种来源的细胞均可作为注射候选：贴壁细胞系、基因修饰克隆、神经球细胞、原代培养细胞或解离的肿瘤组织。所需模型的类型将决定最合适的注射部位。
   1. 确定注射用细胞数量。形成肿瘤所需的细胞数量因细胞系而异，必须通过实验确定；肿瘤生长速度在很大程度上取决于细胞类型、细胞数量以及细胞培养传代次数。每针注射细胞数在 1 × 10⁴ 至 2 × 10⁵ 或更高范围内，均可产生不同生长速率的肿瘤。
   2. 限制注射体积。细胞应悬浮于尽可能小体积的无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中，以确保其能顺利、轻松地通过 26 G 针头。实际注入脑内的体积越小，所形成的肿瘤位置越精确、边界越清晰；注射体积控制在 3 至 6 µl 范围内可获得最佳效果。无论计划进行多少次注射，均应准备至少 50 µl 的细胞悬液总体积，以便准确测量、混匀和取样。
2. 选择适合模型的实验小鼠。人类肿瘤的鼠类模型通常使用年轻的免疫缺陷小鼠，以避免免疫介导的移植物排斥反应。只要采取适当预防措施（包括去污染、消毒和器械灭菌），操作无需在生物安全柜中进行。本实验所用为 6 至 12 周龄的雄性和雌性裸鼠（athymic nude mice）。体重低于 20 g 的小鼠在立体定位仪上....

结果

采用所述技术可建立可靠的颅内异种移植模型。识别小鼠颅骨的关键结构（图1）有助于定位前囟，并引导研究者准确且可重复地确定注射位点。在本研究中，将U251亲本细胞系、转染荧光素酶的U251细胞（U251-Luc）或U87永生化人胶质母细胞瘤组织培养细胞悬浮于4至6 µl的SF-DMEM中，并相对于前囟在右侧2.5 mm、前侧1.5 mm、腹侧3.5 mm处进行注射（图2）。

可通过磁共振成像（MRI，图3）、体内发光成像（IVIS，图4）或常规大体病理学技术（H&E染色，图5）对所形成的肿瘤进行可视化观察和分析。必须格外注意并进行优化，以确定合适的细胞类型和注射部位，从而准确反映预期的成瘤时间、生长速度及肿瘤模型特征。

讨论

人脑癌的原位小鼠模型是评估临床治疗效果的优良工具，但在将细胞植入脑组织时必须优化操作以确保精准定位。研究表明，过大的接种体积、不理想的注射技术以及过快的注射速度可能导致细胞外漏，并使肿瘤细胞出现在非目标区域（如脑室、脊髓、硬膜外区域）。 等等肿瘤大小存在显著差异² （个人观察）。对微处理器驱动的非细胞样品递送进行的分析发现，与手动注射方法相比，使用微泵可实现更局灶化的递送、更少的样品回流以及更小的变异度，这归因于其平稳、均匀的递送过程和稳定的压力控制。³尽管将所需数量的细胞浓缩于仅2或4 µl的体积中可能存在挑战，但使用配备可编程微泵的立体定位仪和对准控制台，可获得具有相似生长速率、可重复且可靠的肿瘤。异种移植模型无法完全复制天然肿瘤的微环境、发生及发展过程，尤其是在免疫缺陷宿主中；但设计合理且实施良好的原位移植模型是最佳替代方案，远优于异位移植模型。

该方案的主要优势在于能够在一致的时间范围内建立可检测的肿瘤。肿瘤出现的时间取决于细胞类型和注射的细胞数量，但具有较高的可预测性，且大多数肿瘤的形成时间相对于整个肿瘤生长时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
带数字显示控制台的小动物立体定位仪	Kopf	Model 940
小鼠气体麻醉头固定器	Kopf	Model 923-B
小鼠耳杆	Kopf	Medel 922
光纤照明器	Fisher	12-562-36
UltraMicroPump III 微量泵	WPI	UMP3
Micro4 微处理器	WPI	UMC4
可变速手持式旋转钻机	Dremel	Model 300
牙科钻头，1.0 mm	Spoelting	514554
牙科钻头适配器：3/32 英寸夹头	Dremel	481
加热垫			用于小鼠
异氟烷蒸发器系统			用于小鼠
医用导管及连接件			用于连接异氟烷蒸发器与立体定位架
器械
精密 25 μl 微量注射器	Hamilton	7636-01	Model 702，不带针头
微量注射器针头，26s G	Hamilton	7804-04	RN，25 mm，尖端类型 2
细尖剪刀（直型，锐/锐）
中号标准剪刀
标准齿状镊
齿状止血钳（2 把）
细尖镊
耗材
5-0 Vicryl P-3 13 mm 缝合线（Ethicon）	MWI	J463G
手术刀片 #10，不锈钢（Feather）	Fisher	296#10
异氟烷（Fluriso）	VetOne	NDC 13985-528-60	货号 #502017。液体吸入性麻醉剂。根据联邦法律，此药品仅限持证兽医使用或在其指导下使用。
卡洛芬（Rimadyl 注射液 50 mg/ml）	Pfizer	NDC 61106-8507-01	用生理盐水稀释
眼用软膏（人工泪液）	Rugby	NDC 0536-6550-91
外用抗生素（AK-Poly-Bac）	Akorn	NDC 17478-238-35
聚维酮碘外用消毒剂，10%（Betadine）	Betadine	NDC 67618-150-04
过氧化氢，30%	Fisher	H325-100	用于可视化颅骨标志
无菌生理盐水	VetOne	NDC 13985-807-25	用于稀释溶液、清洗组织
骨蜡	WPI	Item #501771
无菌手术巾	McKesson	25-517
无菌外科手套	McKesson	（合适尺寸）
无菌纱布垫，2 x 2	Fisherbrand	22028556
无菌纱布垫，4 x 4	Fisherbrand	22-415-469
酒精消毒棉片（中号）	PDI	B603
无菌棉签	Fisherbrand	23-400-114
带盖无菌 0.5 ml 螺口管	USA Scientific	1405-4700	用于细胞
独立包装的无菌一次性移液管	Fisher	BD 357575	用于针头清洗液
BD 带针头的胰岛素注射器	Fisher	329461	用于镇痛
70% 乙醇			用于清洁
无菌去离子水（diH2O）			用于清洁
用于清洗液的微量离心管			用于针头清洗液
记号笔（专用）			用于标记颅骨