本文描述了一种利用大肠埃希菌 K1（Escherichia coli K1）培养物在新生大鼠中建立全身性感染的方法。该非侵入性操作可实现病原体在胃肠道的定植、向全身血液循环的转位，以及通过脉络丛侵入中枢神经系统。
本文内容
摘要
摘要
只有当所采用的感染模型能够复制自然感染的主要特征时，对动物宿主与细菌病原体之间相互作用的研究才具有意义。本方案描述了建立和评估新生大鼠因神经致病性大肠杆菌（Escherichia coli）K1引起全身性感染的实验步骤。病原体首先定植于胃肠道，随后沿“肠-淋巴-血-脑”途径播散，该模型表现出显著的年龄依赖性。一株对新生大鼠具有增强毒力的 E. coli O18:K1 菌株，可导致极高的定植率、向血液系统的易位率以及经脉络丛进入后对脑膜的侵袭率。与人类感染相似，病原体侵入中枢神经系统伴随局部炎症反应，并 invariably 导致死亡结局。该模型已被证实可用于病原机制研究、治疗干预评估以及细菌毒力评价。
引言
全身性细菌感染对新生儿的健康和生存构成重大威胁，其中早产儿尤其易感。新生儿细菌性脑膜炎（NBM）常与细菌性败血症相关，在生命最初几周内仍是导致死亡和病患的重要原因，而抗菌药物耐药性的持续演变进一步加剧了这一问题1,2。NBM 属于医疗急症，带来沉重的医疗、社会和经济负担3；因此，迫切需要开发新的治疗方法，特别是创新的预防策略，以减轻感染负担。NBM 的某些特征较为特殊：在发达国家，Escherichia coli（大肠杆菌）和B族链球菌是绝大多数病例的致病原，这些菌株引发 NBM 的能力几乎总是与其具有的保护性多糖荚膜有关，该荚膜可使病原体逃避宿主免疫识别过程4。高达 80–85% 的神经侵袭性 E. coli 表达 K1 荚膜5,6，这是一种 α-2,8 连接的多聚唾液酸聚合物，其结构与宿主神经可塑性调节因子完全相同7。
评估针对新生儿脑膜炎（NBM）及相关菌血症和败血症的新疗法与预防措施，显然需要一种能够模拟人类新生儿疾病关键特征的稳健动物感染模型，特别是年龄依赖性强以及自然感染途径这两个方面。目前已有多种可用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌脑膜炎的模型8,9 这些研究极大地拓展了我们对这些感染性疾病发病机制、病理生理学以及治疗方案的认识。因此，研究人员已利用大鼠、小鼠、兔子和猴子的实验性感染来研究新生儿及成人的脑膜炎。然而，许多此类模型采用直接向小脑延髓池或皮下注射细菌的方式启动感染，通过绕过病原体从定植部位自然播散的过程，从而造成一种人为的发病机制。在某些情况下，这些接种方法导致病理学发生显著改变；例如，皮下给予细菌 大肠杆菌 K1菌株消除了自然感染中与年龄相关的依赖性，可在新生儿和成年个体中均引起菌血症及中枢神经系统（CNS）侵袭10. 易感性 E. coli NBM 的发生极为依赖于病原体在出生时或出生后不久由母亲向婴儿的垂直传播11母源性 大肠杆菌 K1型细菌定植于新生儿胃肠道（GI） tract11-13，出生时无菌，但会迅速定植复杂的微生物群14在定植的新生儿中， 大肠杆菌 K1型细菌能够从肠腔易位至全身循环系统，随后穿过血脑屏障或血-脑脊液屏障进入中枢神经系统9,15在设计可靠的实验感染模型时，应考虑这些细节。
尽管小鼠已被广泛用于某些类型细菌性脑膜炎的研究8，因此不适用于新生儿感染研究：它们会因全身性感染而迅速恶化，且不表现出人类婴儿感染中显著的年龄依赖性特征16。此外，α-防御素是胃肠道的关键肽，可提供针对全身侵袭的保护 E. coli K117在人类和大鼠的潘氏细胞和中性粒细胞中高表达，但在小鼠中不表达18小鼠防御素及相关隐素基因存在显著程度的重复、冗余和异质性，这在其他动物中未见。19新生大鼠最初由 Moxon 及其同事使用20 研究发病机制 流感嗜血杆菌 经鼻接种后发生脑膜炎，模拟该新生儿病原体在人体内的自然定植部位，随后针对年龄依赖性进行了优化 大肠杆菌 K1 菌血症和脑膜炎。Bortolussi 等21 采用腹腔注射细菌接种物以启动感染，但Glode及其同事的关键研究22 采用口服胃管喂养以模拟胃肠道定植后自然感染途径。由于胃管可能损伤黏膜表面，该操作已改进为将接种物喂饲新生鼠23本文描述了胃肠道定植的方法以及在易感幼鼠中追踪感染的实验步骤；此外，还讨论了该模型的治疗和预防应用。
方案
本研究中进行的所有动物实验均符合国家和欧洲立法要求，并获得了伦敦大学学院药学院伦理委员会和英国政府内政部（HO）的批准。所有动物实验均在内政部项目许可证PPL 80/2243和PPL 70/7773的授权下进行。
1. 大鼠准备
- 使用无病原体的Wistar新生大鼠进行所有体内实验。
- 将所有大鼠窝仔（每窝12只新生大鼠）与其哺乳期母鼠（9–11周龄雌鼠）共同饲养在单独的笼具中，并置于最佳条件下（19–21 °C，45–55%湿度，每小时换气15–20次，12小时光照/黑暗循环）。
2. 细菌细胞制备
- 储存 E. coli 在 -80 °C 条件下将 K1 菌种保存于 20% (v/v) 甘油中。每次实验时，将保存的菌种接种至 Mueller-Hinton (MH) 琼脂平板，37 °C 过夜培养。
- 喂食前一天，用单个菌落接种10 ml MH肉汤 E. coli K1 菌落于 37 °C、200 rpm 条件下过夜培养。作为培养基污染的对照，准备 10 ml 未接种的 MH 肉汤，于 37 °C、200 rpm 条件下培养。
- 将100 µl过夜培养的细菌悬液转移至9.9 ml MH肉汤中（体积比1:100），于37 °C、200 rpm条件下振荡培养，直至达到对数中期，此时在600 nm波长下测得的光密度值（OD600）为0.6600).
3. 新生大鼠的喂养 大肠杆菌 K1
- 用一只手轻轻抓住动物颈背部，将其垂直固定，使其口腔张开。将无菌移液器吸头缓慢插入动物口腔内，并在30秒的时间内将20 µl接种物（约37 °C）滴入动物口腔中。喂食后立即将动物放回母鼠身边。
- 通过将接种物在PBS中进行系列稀释，并点样至MH琼脂平板，验证每只幼鼠已摄入4 - 8 × 106个细菌。
4. 定植情况的评估 E. coli K1
- 用一只手轻轻抓住动物颈部的皮肤。将无菌棉签浸入无菌 PBS 中，然后轻轻擦拭肛周区域。采样后立即将动物放回母体身边。
- 将棉签头放入含有 300 µl 无菌 PBS 的离心管中，并置于冰上保存。
- 通过在 PBS 中进行系列稀释，并接种至麦康凯琼脂平板，测定可存活细菌的数量。
- 通过噬菌体敏感性试验确定有活性的 E. coli K1。使用无菌微生物接种环挑取单个菌落，浸入 200 μl 无菌 PBS 中，随后进行涡旋振荡混合。
- 使用无菌微生物接种环，在 MH 琼脂平板上以直线方式划线接种。让平板干燥 30 秒，然后用移液器将 10 µl 噬菌体 K1E（109 噬斑形成单位/ml (PFU/ml)）加至划线中心。于 37 °C 过夜培养平板。
- 次日，观察平板上是否出现噬菌体介导的裂解现象。
5. 疾病严重程度评估
- 使用表1中所述的七分制评分系统，每天对每只动物的疾病严重程度进行4至5次评估。
- 若动物评分达到或超过7分中的3分，应立即实施安乐死以尽量减少其痛苦，并记录该动物为死亡。
6. 新生大鼠的安乐死与血液采集
- 用一只手轻轻握住动物，露出其头部和颈部。用酒精棉片擦拭动物颈部进行消毒 。使用70%乙醇对一把较大的剪刀进行消毒 ，然后用无菌PBS冲洗以去除残留乙醇。
- 将动物轻轻悬于培养皿正上方。使用锋利的手术剪剪断新生动物头部，确保血液滴入培养皿中。避免接触头部，以防皮肤菌群污染血液。
- 立即用无菌移液管收集血液，并在0.5 ml微量离心管中加入肝素钠盐，使其终浓度为20–50单位/ml，混匀。
- 通过在PBS中进行系列稀释并接种至MacConkey琼脂平板，测定活菌数量。通过检测活菌对噬菌体K1E的敏感性，确定活的E. coli K1菌的数量。
7. 解剖
- 对新生大鼠进行断头后，在无菌条件下取出并收集目标组织。将所有器械（如图1所示）用70%乙醇和无菌PBS清洗。
- 清洁解剖板，并用70%乙醇完全润湿腹部。将尸体仰卧放置，用无菌针头将其固定在解剖板上：(i) 将左后肢固定在操作台上，(ii) 拉伸尸体并将右前肢固定在操作台上，(iii) 将右后肢和左前肢分别固定在操作台上。
- 用镊子夹住下腹部左侧的皮肤，然后使用小型解剖剪从下腹部沿尸体左侧向上剪至胸骨。
- 继续用镊子和小型解剖剪将切口横向延伸至胸骨，再从胸骨沿尸体右侧向下剪至下腹部，注意避免损伤任何深层结构。
- 最后，使用虹膜弯头解剖镊轻轻将皮肤瓣从胸骨向下牵拉，以暴露腹膜。
- 用镊子轻轻提起腹膜，纵向剪开以暴露内脏器官，注意避免损伤任何深层器官。
8. 收集胃肠道
- 辨认胃、小肠、盲肠、结肠及肠系膜淋巴系统。
- 用无菌镊子轻轻横断胃的两侧，将其切除，然后放入含有1.6 ml无菌PBS的螺旋盖小瓶中。
- 在直肠处横断结肠。用解剖镊子小心地将整个肠组织从尸体中拉出，并置于无菌培养皿中。操作过程中应轻柔进行，以确保肠结构和肠系膜淋巴结构不发生分离。
9. 分离胃肠道与肠系膜淋巴系统（图2）
- 向培养皿中加入 30 ml 无菌 PBS，确保胃肠道完全浸没。
- 识别肠系膜淋巴系统的中央团块，并用精细解剖镊夹住；识别小肠最靠近近端的部分，并用精细解剖镊夹住。
- 缓慢将肠系膜淋巴系统的中央团块与远端小肠向相反方向牵拉，直至两部分组织完全分离。操作时应小心进行，避免拉伸小肠，以防影响近端、中段和远端小肠区域的可重复取样。将肠系膜淋巴系统置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并置于冰上。
10. 消化道的切片
- 在盲肠处横切胃肠道，以分离小肠与结肠。
- 将结肠置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置于冰上。
- 从小肠的近端、中段和远端区域采集代表性组织。以小肠中点为基准对齐小肠。
- 然后，(i) 采集中点以下 3 - 5 cm 处的组织作为中段小肠，(ii) 采集中点以上 5 - 7 cm 处的组织作为近端小肠，以及 (iii) 采集盲肠前最后 2 cm 的组织作为远端小肠。
11. 肝脏的采集
- 在移除胃部后，辨认大鼠肝脏的三个叶。
- 使用精细解剖镊将肝叶从腹腔中轻轻拉开。
- 使用精细剪刀切断任何连接的韧带以取下肝脏。将肝脏置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置于冰上。
12. 脾脏的采集
- 识别脾脏。
- 将脾脏从胃部拉开，并使用精细剪刀剪断胃脾韧带。
- 将脾脏置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置在冰上。
13. 收集肾脏
- 移除胃肠道及其他器官后，辨认腹腔后部将显露的肾脏。
- 使用精细解剖剪剪断输尿管及任何相连的韧带，并用精细镊子取出肾脏。若肾上腺及脂肪组织仍附着，使用精细镊子和解剖剪将其去除。
- 将双侧肾脏置于 300–500 μl 无菌 PBS 中，并置于冰上。
14. 收集脑组织
- 断头后，使用弯头镊子将头部保持直立位置。用另一把弯头镊子纵向夹住头顶的皮肤，并用精细解剖剪进行切口。再用精细解剖剪在靠近颈部的位置纵向剪开其余皮肤。
- 用精细镊子从两侧向外牵拉皮肤，暴露颅骨，并用精细解剖剪去除皮肤瓣。将精细解剖剪插入脊髓开口处，沿颅骨向吻端方向剪开。
- 用精细镊子将颅骨两侧向外牵拉，剪除颅骨片段。
- 用宽头镊子从脊髓开口向吻端方向以向上铲动的动作取出脑组织。用 PBS 清洗脑组织两次，以去除断头过程中残留的血液。
15. 组织处理与匀浆化
- 对于需要进行活力计数或DNA提取的实验，将组织放入含有无菌PBS的离心管中。通过在PBS中进行系列稀释并接种至麦康凯琼脂平板，立即测定活菌数量；或在-20 °C条件下以含20%甘油的溶液短期保存。如需进行DNA提取，应将组织在-20 °C下保存。
- 对于需要进行RNA提取的实验，将组织放入适量体积的RNAlater溶液中（每1 mg组织使用10 μl），随后立即在-20 °C下短期保存，或在-80 °C下长期保存。
- 对于需要进行成像的实验，将组织放入10 ml Methacarn溶液（60%甲醇、30%氯仿和10%乙酸）中，然后在室温（20 - 25 °C）下保存不超过3周。
- 通过比较加入组织前后离心管的重量来计算组织重量。使用匀浆器对组织进行匀浆处理。每次样本匀浆之间，用70%乙醇清洗匀浆器一次，再用无菌PBS清洗两次。
注：为保留与黏蛋白相关的黏膜防御结构，肠道样本宜采用Methacarn固定；系统性组织可使用福尔马林固定。
结果
本文所述的 E. coli K1 全身感染模型复制了人类自然感染的多种特征。细菌经摄入后定植于胃肠道，通过肠系膜淋巴结易位进入血液，继而引发器官特异性疾病，并伴有脑部炎症24。重要的是，该模型表现出显著的年龄依赖性；如图3所示，出生两天（P2）的大鼠幼崽对侵袭性感染高度易感，但在随后的七天内，动物对感染的抵抗力逐渐增强，尽管其对胃肠道定植的易感性并未下降17。细菌从胃肠道定植部位转移至血液后，可通过荧光显微镜在血样中观察到细菌的存在（图4），随后细菌主要经脉络丛进入中枢神经系统25。在部分动物中，细菌还会广泛侵袭其他主要器官，如肺、脾和肾25。
不同幼崽组织中的细菌数量可能存在显著差异25 但当生物负荷被评定为存在或不存在时，关于器官侵袭的检测结果具有高度的可重复性。以每窝12只幼鼠作为一个独立的实验组，通过G*Power软件进行功效分析，结果表明，从该组中选取6只动物进行生存率评估时，该样本量可达到98.6%的效应检出概率。 >综合考虑全部十二个因素时，概率为99%。因此，该模型适用于评估专门针对新生儿细菌感染治疗的新型药物，并已用于评估选择性去除细菌表面K1荚膜的胶囊裂解酶EndoE的治疗潜力24-26它也可用于研究影响细菌致病过程的宿主-细菌相互作用。 E. coli 神经病原体；在此背景下，它已被用于对以下方面的研究 E. coli A192PP 的定植与扩散。已有研究表明 E. coli A192PP细胞在P2、P5和P9幼鼠的胃肠道中大量持续存在；这三个组群在定植的时间特征上非常相似（图5）反映了细菌在肠道内复制并维持种群密度的能力。
为了确保动物使用的最小化或无冗余，临床分离株 A192 通过在新生大鼠体内连续传代以增强其毒力。E. coli A192 能以 100% 的效率定植于出生后第 2 天（P2）的新生大鼠，引发 35% 动物的菌血症，并在 25% 的动物中产生致死效应27。传代获得的衍生株 A192PP 能够定植胃肠道，引发菌血症，并导致所有 P2 幼鼠死亡。因此，该模型可用于研究不同 K1 菌株从定植部位侵入中枢神经系统及其他器官系统的毒力特性。在此背景下，Pluschke 及其同事23利用新生大鼠感染模型评估了 95 株来源于人类的 E. coli K1 菌株在肠道定植后引起菌血症的能力；他们观察到各菌株在定植效率和侵袭能力方面存在显著差异，这进一步支持了 E. coli K1 神经致病菌的克隆性特征。
图1. 组织采集所需材料：(A) 天平，(B) 预先称重并装有必需培养基的离心管，(C) 手术台、直尺及用于固定动物的针具，(D) 70% (v/v) 乙醇和PBS，用于消毒组织采集器械，(E) 组织采集工具包，包括用于断头的大剪刀，以及不同尺寸和形状的剪刀、镊子和刀片，(F) 冰块，用于保存组织，(G) 70% (v/v) 乙醇，用于消毒手术台及周围环境。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 胃肠组织与肠系膜淋巴系统的分离。(A) 使用精细解剖镊夹住肠系膜淋巴系统的中央团块。(B) 夹住小肠的近端部分，并向相反方向牵拉。(C) 胃肠组织与肠系膜淋巴系统将完全分离。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 口服给药后2日龄（P2）至9日龄（P9）新生大鼠仔鼠的存活情况 E. coli A192PP，表明系统性感染具有显著的年龄依赖性。 每组包含24名新生儿。
图4. 口服接种细菌后，从P2幼鼠血液涂片中获得的E. coli A192PP细胞的荧光图像。 细菌表面的脂多糖O抗原使用兔抗O18多克隆抗体及Alexa546标记的山羊抗兔二抗进行染色。K1荚膜使用EndoE-GFP试剂进行可视化。在血液样本中检测到的几乎所有细菌均表现出具有保护作用的K1荚膜。图像由Andrea Zelmer博士采集。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. E. coli 接种细菌后A192PP在肠道内的定植。 从整个肠道中提取了DNA E. coli K1 菌落形成单位/克（CFU/g）组织，通过以多聚唾液酸转移酶（polysialyltransferase）为靶标的定量聚合酶链式反应（qPCR）测定neuS 基因，如 elsewhere 所述17检测限（LOD）。
| 特征 | 健康 | 不健康 |
| 皮肤颜色 | 粉红色 | 苍白/发黄 |
| 敏捷性（翻正反射） | 幼崽在仰卧放置后立即翻转 | 翻转困难（> 3 秒）或无法完成 |
| 轻压腹部 | 无声音 | 出现躁动声 |
| 胃部/乳线 | 可见且呈白色 | 不可见 |
| 体温 | 温暖 | 相对较冷* |
| 体重 | 每日增重 1.5–2 g | 无体重增长或体重下降 |
| 放入笼中时的行为 | 向母体移动并开始进食 | 无法向母体移动且进食困难 |
表1. 七分评分系统： 所列前三个评分通常是最初观察到的体征。*患有全身性感染的新生动物体温会升高（> 2 °C）。然而，由于动物活动能力差，无法靠近母体以维持体温，不健康的动物可能脱离仔群体，用手触摸时感觉发凉。
讨论
本文所述的动物模型是在先前研究基础上建立的，旨在重现人类自然感染的关键特征。由于满足感染模型所需的关键标准，新生大鼠最初被用于研究b型H. influenzae引起的婴儿脑膜炎。因此，相关病原体的入侵途径应与人类自然感染途径一致，并能稳定地引发相似的病理变化，且病程足够长，以便进行治疗干预。所采用的技术不应限制该方法的适用性，也不应影响疾病结局20。Moxon 及其同事建立的婴儿大鼠H. influenzae脑膜炎模型符合这些标准20；自然感染发生在病原体定植于上呼吸道黏膜之后，这一重要特征通过将细菌无创性地接种至幼鼠鼻腔黏膜得以复制。重要的是，该模型还重现了感染的年龄依赖性特征。
同一研究团队也是首个建立新生大鼠E. coli K1 NBM非侵入性模型的团队22。无病原Sprague-Dawley新生大鼠通过口服胃管喂食108至1010个细菌进行定植；因此，接种剂量明显高于我们所采用的剂量。在检测的三种K1菌株C94（O7:K1:H-）、EC3（O1:K1:H-）和LH（O75:K1:H3）中，喂食K1菌株的动物有相对较高比例（48–74%）实现了定植，但菌血症、脑膜炎和死亡的发生率则存在差异，且显著低于定植率。随后研究进一步证实了E. coli K1实验感染的克隆特性23，目前明确只有O18:K1以及在较小程度上的O7:K1血清型能够持续引起全身性感染。因此，这些关于神经致病性E. coli K1发病机制的研究均基于毒力增强的O18:K1菌株A192PP。比较通过胃管喂食E. coli K1（Glode及其同事所用方法22）与Achtman团队采用的液滴喂食法23发现，前一种方法导致过多死亡，几乎可以确定是由于胃管对黏膜表面造成损伤所致。由于两种方法的定植率相当，因此建议采用侵入性更小的方法，即使用带无菌吸头的移液器喂食细菌，如本文所述。
E. coli A192PP菌株在本研究中使用的是O18:K1血清型。它是临床分离株E. coli A192的一个更具毒力的衍生株，原始菌株最初从一名败血症患者中分离得到27。该菌株毒力的增强是通过在新生大鼠体内连续传代获得的26。该菌株引起的疾病严重程度具有年龄依赖性：给予2日龄动物后，可导致100%的菌血症和死亡率28。相比之下，9日龄动物则完全抵抗该疾病。可使用K1特异性裂解性噬菌体来区分E. coli K1与其他E. coli菌株29。在本研究中，应利用活细菌对K1E噬菌体的敏感性：（i）检测准备喂给动物的E. coli K1菌悬液的纯度；（ii）区分E. coli K1与其他肠杆菌，以便计算肛周拭子、血液及组织样本中的活菌数量。若菌落为E. coli K1，则会对K1E噬菌体裂解敏感，在噬菌体接种部位细菌生长将被抑制；若菌落不是E. coli K1，则对K1E噬菌体裂解具有抗性，在噬菌体接种部位应出现细菌生长区域。需要注意的是，动物模型无法反映自然发生疾病的全部特征。当前模型可进行修改，以研究除E. coli A192PP以外的神经致病菌的毒力特征，也可调整定植接种量的大小。该技术未来的应用可能包括评估治疗该疾病亟需的药物，以及揭示宿主对定植和组织侵袭反应的详细机制。
此处描述的方法简单而有效。采用每窝10至12只幼鼠作为实验组或对照组，这种窝内分组方法可确保高度的可重复性和统计学有效性。任何操作后必须尽快将幼鼠归还给亲生母鼠，因此不应在同一窝幼鼠中实施不同的干预措施。喂饲的接种物必须预先温热，否则幼鼠会拒食所提供的菌液。幼鼠肠道微生物群迅速建立，出生后两天内，胃肠道即被一系列细菌定植，这些菌群所属的门类正是在婴儿及成年肠道中丰度最高的微生物。未接受喂饲的幼鼠 E. coli A192PP 不携带 E. coli 胃肠道中的 K117 因此，定植率的测定相对直接。然而， neuS基于qPCR的定植检测方法 E. coli K1 比传统培养方法敏感得多，强烈推荐使用17.
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了医学研究理事会的研究资助 G0400268 和 MR/K018396/1 以及行动医学研究（Action Medical Research）的支持。英国国家卫生研究院伦敦大学学院医院生物医学研究中心也提供了进一步资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无病原体Wistar大鼠（12只新生幼鼠，1只哺乳期母鼠） |  Harlan, UK | ||
| E. coli K1 A192PP | Taylor实验室 | Mushtaq 等 2004 | |
| 噬菌体K1E | Taylor实验室 | Mushtaq 等 2004 | |
| 甘油 | Sigma, UK | G5516 | |
| 穆勒-欣顿琼脂 | Oxoid, UK | CM0037 | |
| 穆勒-欣顿肉汤 | Oxoid, UK | CM0405 | |
| 麦康凯琼脂 | Oxoid, UK | CM0007 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma, UK | P4417 | |
| 100%乙醇 | Sigma, UK | E7023 | |
| 肝素钠盐 | Sigma, UK | 84020 | 配制为20 - 50单位/毫升 |
| RNA later溶液 | Sigma, UK | R0901 | 每毫克组织使用10 μl |
| 乙酸 | Sigma, UK | 320099 | |
| 氯仿 | Sigma, UK | C2432 | |
| 甲醇 | Sigma, UK | 322415 | |
| 棉签 | Fisher Scientific, UK | 11542483 | |
| Alcotip拭子 | Scientific Laboratory Supplies, UK | SWA1000 | |
| 培养皿 | Sigma, UK | P5856 | |
| 30 ml通用管 | AlphaLaboratories, UK | CW3890 | |
| 0.5 ml微量离心管 | StarLab, UK | I1405-1500 | |
| 1.5 ml微量离心管 | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 0.1 μl定量接种环 | StarLab, UK | E1412-0112 | |
| L型涂布棒 | StarLab, UK | E1412-1005 | |
| 比色皿 | Fisher Scientific, UK | 10594175 | |
| 直头尖头镊子 | Fisher Scientific, UK | 12780036 | |
| 直头钝头镊子 | Fisher Scientific, UK | 12391369 | |
| 钟表匠用弯头超细尖镊子 | Fisher Scientific, UK | 12740926 | |
| 直剪超细尖头剪刀 | Fisher Scientific, UK | 12972055 | |
| 实验室剪刀 | VWR, UK | USBE4251 | |
| 25G注射器针头 | Greiner Bio-One Ltd | N2525 | |
| LAMBDA 25紫外/可见光分光光度计 | PerkinElmer, UK | L60000BB | |
| Unitemp培养箱 | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron摇床培养箱 | INFORS HT, UK | AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10匀浆器 | IKA Werke | 0003737000 |
参考文献
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