记者的增长分析的蛋白质降解的系统分析

摘要

本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率，其依赖于报告蛋白的细胞内水平，该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。

摘要

通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS），蛋白质降解是一个主要的调节机制在所有真核生物蛋白的动态平衡。该标准方法测定细胞内蛋白质降解依赖于生化分析了以下的蛋白质下降的动力学。这样的方法通常是费力和费时，因此不适合进行实验，目的是评估多种底物和降解的条件。作为另一种选择，细胞生长为基础的分析已被开发出来，那是，在他们的常规格式，不能定量确定在蛋白质水平的相对变化终点分析。

在这里，我们描述了一种方法，通过它们连接到酵母细胞的生长动力学，忠实地决定改变蛋白质的降解率。该方法是基于已建立的选择系统，其中的URA3的尿嘧啶营养缺陷型-deleted酵母细胞是通过外源表达报告蛋白获救，包括必要的URA3基因和一个退化行列式（降解决定子）之间的融合。报告蛋白被设计成使得它的合成速率是恒定的，而其降解速率由降解决定子确定。作为细胞生长的尿嘧啶缺陷型培养基是成比例的Ura3的相对水平，生长动力学的完全依赖于报告蛋白降解。

这种方法精确测量变化的细胞内蛋白质降解动力学。它适用于：（a）评估称为泛素结合因子蛋白水解（B）的相对贡献E2结合酶结构与功能分析（三）鉴定及新型降解决定子表征。该degron- URA3基于系统的应用超越蛋白降解字段，因为它也可以适用于蛋白质水平与其他细胞途径功能相关联的监视更改。

引言

泛素 - 蛋白酶体降解系统是一种主要的调节机，它有牵连的蛋白质稳态中的所有真核生物中的维持。 UPS的最初偶联物多泛素分子，以在此之后，多聚遍在蛋白标记的蛋白质被26S蛋白酶体降解的靶蛋白。在大多数情况下，速率限制为泛素介导的降解步骤是泛素化底物，由E2结合酶和E3结扎酶介导的（E3连接酶^）1。因此，特定的蛋白质的细胞内稳定性反映了其易泛素缀合和它们的同源泛素酶的活性。

E3连接酶是UPS的主要底物识别元件。因此，这些内切酶识别它们的底物是不存在或是在其稳定的对应²不暴露于降解决定子。例如，许多的细胞周期调节米乌斯进行合成，并为了保持细胞周期进程，以便降低在时间上的具体方式。这些蛋白质的降解往往是由磷酸化控制，通过细胞信号调节的激酶介导的^3,4。另一方面，异常折叠的蛋白质是通过隐蔽降解决定子的认可。这些是通常隐藏在天然结构并且在结构扰动被暴露的区域。这种降解决定子包括疏水区^5-7和内在的无序段^8。

由于泛素系统的精液发现对蛋白质降解和其基本特征中的网织红细胞裂解物^9，酵母遗传学是有助的发现许多泛素系统¹⁰的组件。酵母作为模式生物的蛋白质降解的由UPS系统的分析的成功主要是由于这样的事实，所述UPS处于高LY保守的所有真核生物^4，再加上他们的顺从作为一个实验系统。的确，基于酵母的系统通常用于破译泛素化机械的作用机制。

研究蛋白质降解的生物化学手段，通常需要准备的细胞提取物。虽然动物细胞的蛋白可以在相对 ​​温和的条件，同时保留蛋白质相互作用和功能下被提取，稳健的细胞壁中酵母¹¹的存在需要相当苛刻的中断条件可能影响蛋白的恢复。事实上，不同的程序，酵母细胞破碎有很大的不同在他们恢复完整蛋白质在正确表示它们的相对丰度的细胞数量的能力。此外误差是固有的用于确定特定蛋白质的降解速率的不同方法：代谢标记为基础的“脉冲追踪”的实验，随后通过QQ，MSNmunoprecipitation，以隔离特定蛋白^12，往往不是严格的定量。因此，当蛋白质的降解是由该方法相比，格外小心，应解释结果的行使。为了克服这个缺点，另一种放线菌酮（CHX）追法可聘请了¹²位。在此测定中，翻译抑制剂加入到细胞培养物和蛋白质的稳态水平的时间变化随后被监视。然而，放线菌酮的使用仅限于蛋白质具有相对短的半衰期（<90分钟），由于长期抑制蛋白质的合成是细胞毒性的。值得注意的是，无论是在上述测定中需要使用蛋白质特异性抗体，这并不总是可用的。

为了克服这些技术限制，研究人员已开发了几种方法，不需要的细胞的提取和蛋白质直接处理。一种方法是基于建立营养缺陷型酵母的圣菌株，通过缺失基因编码的必需的代谢酶的获得。这样的基因包括HIS3，LEU2，LYS2和TRP1，对于所需的氨基酸生物合成的酶的编码，以及URA3，其编码的OMP脱羧酶（的Ura3）的嘧啶核糖核苷酸生物合成的必需酶。的ura3已被广泛用于蛋白质降解研究。在这些测定中，的Ura3的组成型表达拯救的ura3细胞的尿嘧啶缺陷型培养基中生长^13。因此，通过降解决定子的融合不稳定的Ura3可以减少对基本培养基中缺乏尿嘧啶的细胞生长。此方法已被应用于各种蛋白质降解的研究，包括降解的识别决定因素^5，E3连接酶¹⁴和辅助泛素化因子¹⁵和新颖的UPS降解决定子¹⁶的发现。所有的这些方法中使用的琼脂平板测定法读出的细胞生长。然而，T他生长标准（正/负增长），而健壮和有效的，主要是定性的，并且不提供用于评估降解决定子的效力或各种辅助降解因素的相对贡献重要的定量信息。

因此，我们开发和利用酵母载体和筛选方法的URA3 -degron融合系统使蛋白质降解系统和定量的分析。该协议基于一个易于手柄测定，其测量的生长动力学在选择性条件下（GILS）液体培养和对标准生长曲线的生成。酵母生长动力学的特征在于三个主要阶段 - 滞后，指数（日志）和固定相。计算过程中的选择性的条件下的对数期，这是由的Ura3，降解决定子的表达水平的测定酵母的复制动力学，提供了一个无偏定量测定öF蛋白的降解。这个方法可以适用于测量和比较同时在多种菌株和在各种条件下的多个UPS基材的降解速率。

方案

1.细胞培养

1. 变换相应的营养缺陷型的酵母细胞，诸如Try467（ 表2），用含有（a）一种酵母URA3 -degron融合和（b）额外的代谢标记物的质粒的选择和维护的质粒。
   注：合适的质粒的实例是YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-的Ura3（LYS2）（Deg1-紫外线）这是一个含有一种融合蛋白，其包含Deg1的酵母整合质粒的-从酵母转录得到的降解决定子。因子MAT2 ^17，FLAG表位-为检测通过免疫印迹法，Vma12 -稳定的ER蛋白，和的Ura3 ^15,18（ 图3A）。 （请参阅表3本研究和对合适的质粒的额外实施例中使用的质粒）。
2. 对于质粒的选择和维护，保持细胞在琼脂平板在合适的合成定义（SD）中缺少的氨基酸选择标记 19（例如，Deg1 -UV被选择并下的SD-LYS选择性培养基维持）。
3. 在对质粒保持一个合适的选择性的SD培养基上生长的细胞O / N在30℃下，直至稳定期为止。生长的细胞在试管中或在96孔板中，根据样本的数目要被检查（第2部分）。

2.细胞制备方法分析

1. 当少量样品（N≤15）是待测定，稀释细胞并更换培养基如下：
   1. 稀释50μl的细胞从一种O / N培养物用150微升每孔的SD培养基中，在96孔板（透明底）。注意，第一个样品被指定只作为空白包含介质。
   2. 测定用酶标仪在96孔板中的样品的OD ₆₀₀值。
   3. 计算实际的OD ₆₀₀在各孔中通过乘以OD ₆₀₀读数乘以稀释因子（4个），从的whICH空白读数的值中减去。由0.55分，得到为1cm根据比尔 - 朗伯定律计算出的路径长度的归一化所得的值。注意，测量OD ₆₀₀ 200微升的细胞在标准的96孔板，当这个值是恒定的。
   4. 计算出所需的用于获得的酵母细胞在量相当于OD ₆₀₀为0.25，并将其转移到Eppendorf管中的准确体积。
   5. 降速细胞以高速（12,000 xg离心），持续1分钟。
   6. 弃上清，重悬细胞于1ml适当的选择性培养基（见3.1节），以获得OD ₆₀₀为0.25。
   7. 转移200微升稀释的菌株，以一个新的井在96孔板中。
2. 当大量的样本（N> 15）进行测试，稀释细胞并替换无需事先的OD ₆₀₀测量的介质，具体如下：
   1. 转让10微升静止细胞生长的O / N在96孔板到一个新的96孔板中含有合适的选择性培养基的190微升（稀释1:20）（见3.1节）。

液体培养在选择性条件3.生长动力学（GILS）

1. 使用下面的媒体使用的Ura3，降解决定子记者成长的测量：
   1. 对于非限定性条件下酵母菌的生长，利用质粒选择性SD存储介质的阳性对照（参见1.2节）。如果没有质粒的选择是必需的，例如，使用整合质粒如Deg1 -UV，含有所有必需氨基酸（SD完整）的SD培养基中时，可以使用。
   2. 对于实验样品的测量限制条件下生长，使用SD-URA中。
2. 设置一个多模酶标仪到：30℃，外径₆₀₀测量的15分钟间隔的温育温度，1分钟每7分钟的轨道和线性振荡周期
   注：此双模摇动优化，以获得细胞的均匀分布;然而，其他的晃动模式，甚至没有晃动可以正常工作。
3. 在孵育的细胞中，在30℃的微量板读数器的O / N或直到细胞达到稳定期（12-24小时）。
4. 原始数据导出到电子表格文件。
5. 确定细胞加倍的人口规模使用MDTcalc，即计算最小时间（小时）定制的软件程序，酵母生长动力学（最小的倍增时间（MDT）;有关详细信息，请参见第4节）。

最小的倍增时间4计算（MDT）：在MDTcalc算法的原理

注：该MDTcalc算法的原理，使用在SD完全培养基中生长Try467酵母细胞（ 表2）的有代表性的样品，示于表1和图1中 ，示出了数据的电子表格和生长的地块，respectively。

1. 减去的OD ₆₀₀为空白值，在相应的孔获得，从每个样品中获得良好的读数。由0.55分所得的差异（对于96孔板），以校正所述光路长度。绘制的最后的值（ 表1中 ，反式。）对时间，以产生实际的酵母的生长曲线（OD ₆₀₀ /小时）（ 图1A）。
2. 计算日志_{2（OD 600）}为每个经变换的值以对数生长期的转化为线性曲线（ 图1B）。
3. 计算10的时间点的时间间隔（N = 10）开始于时刻0和移动一个时间点的时间，直到Ñ<10的斜率（ 表1，斜率; 图1C）。
4. 计算每个斜率的倒数的值，以获得加倍所需的细胞群的时间（ 表1中 ，1 /斜率; 图1C）。计算最小1 /斜率值，以确定MDT的（ 表1，黑色矩形; 图1C）。提取所计算的MDT为从选定的时间间隔内的细胞样品中（ 表1中，1 /斜率，黑色矩形）（ 表1中，由红色矩形概述， 图1B，图1D）。
   注：在SD-URA培养基中的细胞生长速率成反比的MDT。

5.使用MDTcalc

1. 补充的程序的文件复制到在计算机中的指定文件夹。
2. 确保保存包含增长数据的电子表格文件，并关闭。打开MDTcalc应用程序，看看屏幕出现的开始。
   1. 插入所需信息，这表现在图2中：
      1. 在“文件路径”，单击矩形上找到电子表格文件的权利。
      2. 在“表名称”，其中t编写电子表格名称他的原始数据所在的位置。
      3. 下“起始位置”中，插入的第一样本的时间0的电子表格坐标。
      4. 下“时间列'，插入信限定时间点列的位置（时间用秒来提供）。
      5. 根据'空白列'，插入字母定义空白栏的位置（通常是但不一定是在A1孔在96孔板中）。
      6. 在“OD值”，选择所需的MDT计算的开始（通常0.15-0.25）的最低转化OD ₆₀₀值。设置此值可防止MDT的计算由于过度稀释培养的滞后期，这样MDT只为达到规定的OD ₆₀₀值以上的样本计算的。
   2. 一旦最后的值被输入，按下屏幕底部的“计算”按钮。确保在正确的进度条逐渐变化到克颖。在计算过程中不要打开电子表格文件。
   3. 导出的两组数据，可自动显示在屏幕上，在完成了的MDT计算到电子表格。确保该数据包括：（a）在各孔中传递的最小OD值测试（如在节5.2.1.6中设置）和（b）从所述的MDT来计算的时间间隔的起始时间点的MDT值（开始时间）。

结果

调查记者衬底的降解Doa10途径的酶的作用

为了测试GILS方法与其相比较传统的降解测定法的有效性。该实验评估对ER-膜的组成部分的相对贡献本地化Doa10的E3连接酶复合物^20,21的蛋白质量控制记者基板Deg1- VU（ 图3A）的降解。该Deg1- VU质粒整合到野生型细胞或进入细胞缺乏该基因的E2结合酶，UBC7（ubc7）和蛋白质的稳定性通过CHX追逐法⁶随后确定。抗FLAG免疫印迹显示了稳定的Deg1 -vu蛋白条带在ubc7细胞，这是不存在于野生型细胞（ 图3B）。在野生型细胞缺乏Deg1 -vu是attribu泰德其被废除ubc7细胞，这表明Deg1 -vu稳定性强烈地依赖于Ubc7连续下降。

讨论

在这里，我们描述了基于细胞的生长来确定蛋白质的相对降解率的测定，称为“液体培养基中的生长动力学下的选择性的条件”（GILS）。该GILS法有几个优点：它是简单的设置，数据采集和分析是很简单的，是非常模块化。因此，GILS可以同时应用于多个样品中，可适应于自动化高通量应用的一种用户友好的多井板格式。最重要的是，GILS提供高度可重复的，定量和可靠的数据和比选择为正/负生长的琼脂板基于生长测定法更为灵活。此外，GILS是因为它能够检测在蛋白质降解率或稳态水平的微小变化高度敏感的，反映相关的UPS组件或降解决定子的活性。最后，GILS试验要求显著缩短生长周期（<12小时）相比，growtħ试验在琼脂平板上（通常2-4天）。

而GILS测定法是用于研究蛋白质的降解非常有用的，几个重要的考虑因素，应考虑在内。例如，有必要使用同基因的酵母菌株背景由于菌株特异性的生长特性。此外，以确定测定法的有效性，每次测定应重复相同的条件下至少3倍，最重要的是，在初始细胞密度（OD _600），生长温度，以及细胞培养物摇动强度不应改变。因此，建议的具体测定方案被存储在微板读数器的软件...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含氨基酸和硫酸铵的 Difco 酵母氮源基础培养基	BD Biosciences	233520	用于 SD 最小培养基上的酵母培养。  需额外添加的氨基酸为：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸
硫酸铵	Sigma - Aldrich	A4418
葡萄糖	Sigma - Aldrich	16325
腺嘌呤	Sigma - Aldrich	A8626
尿嘧啶	Sigma - Aldrich	U0750
氨基酸	可获得的最高纯度
96 孔板	Nunc	167008	可使用任何其他兼容品牌
放线菌酮	Sigma - Aldrich	C7698	工作浓度 0.5 mg/mL
Infinite 200 PRO 系列	Tecan		用于酵母培养及 OD600 测定。可使用其他任何兼容的温控酶标仪。
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