方法文章

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

DOI:

10.3791/52021

2014年11月6日

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率,其依赖于报告蛋白的细胞内水平,该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。

摘要

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通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)进行蛋白质降解是所有真核生物中维持蛋白质稳态的主要调控机制。目前确定细胞内蛋白质降解的标准方法依赖于生物化学检测,以追踪蛋白质减少的动力学过程。这类方法通常耗时且劳动强度大,因此难以适用于需要评估多种底物和不同降解条件的实验。作为替代方案,已开发出基于细胞生长的检测方法,但其传统形式属于终点检测,无法对蛋白质水平的相对变化进行定量测定。

本文介绍一种将蛋白质降解速率的变化与酵母细胞生长动力学相偶联,从而准确测定其变化的方法。该方法基于一个已建立的筛选系统:通过表达一种报告蛋白来挽救因缺失URA3基因而无法合成尿嘧啶的酵母细胞的尿嘧啶营养缺陷型,该报告蛋白由必需的URA3基因与一个降解决定子(degron)融合而成。该报告蛋白的设计使其合成速率保持恒定,而其降解速率则由degron决定。由于在缺乏尿嘧啶的培养基中细胞生长与Ura3蛋白的相对含量成正比,因此生长动力学完全依赖于报告蛋白的降解速率。

该方法可准确测量细胞内蛋白质降解动力学的变化。其应用包括:(a)评估已知泛素结合因子在蛋白质降解中的相对作用;(b)E2结合酶的结构-功能分析;(c)新降解子(degrons)的鉴定与表征。基于降解子-URA3 系统的应用超越了蛋白质降解领域,还可被改造用于监测与其他细胞通路功能相关的蛋白质水平变化。

引言

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泛素-蛋白酶体降解系统是一种主要的调控机制,在所有真核生物中均参与维持蛋白质稳态。泛素-蛋白酶体系统(UPS)首先将多个泛素分子共价连接至靶蛋白,随后由26S蛋白酶体降解带有聚泛素标记的蛋白。在大多数情况下,泛素介导的降解速率限制步骤是底物的泛素化,该过程由E2结合酶和E3连接酶(E3连接酶)1介导。因此,特定蛋白质在细胞内的稳定性反映了其对泛素化修饰的敏感性及其对应的泛素化酶的活性。

E3 连接酶是泛素-蛋白酶体系统(UPS)中主要的底物识别组分。因此,这些酶能够识别其底物中的降解子(degron),而这些降解子在其稳定的对应蛋白中要么不存在,要么未暴露2。例如,许多细胞周期调控因子必须以特定的时间顺序合成并被降解,以确保细胞周期的有序进行。这些蛋白的降解通常由细胞信号通路调控的激酶所介导的磷酸化来控制3,4。另一方面,错误折叠的蛋白则通过隐匿性降解子被识别,这些区域在天然结构中通常被隐藏,但在结构发生扰动时会暴露出来。此类降解子包括疏水结构域5-7和 内在无序片段8。 

自从在网织红细胞裂解液中首次发现泛素系统介导的蛋白质降解并阐明其基本机制以来9,酵母遗传学在鉴定泛素系统的众多组分方面发挥了关键作用10。酵母作为研究泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导蛋白质降解的模式生物之所以取得成功,主要归因于UPS在所有真核生物中高度保守4,同时酵母本身具有良好的实验可操作性。事实上,基于酵母的实验系统常被用于解析泛素化机制的作用原理。

通过生物化学方法研究蛋白质降解通常需要制备细胞提取物。虽然动物细胞的蛋白质可以在相对温和的条件下被提取,从而保持蛋白质相互作用和功能,但酵母具有坚固的细胞壁11,其破碎需要更为剧烈的条件,这可能影响蛋白质的回收效率。事实上,不同的酵母细胞破碎方法在回收完整蛋白质的能力方面存在显著差异,且所获得的蛋白质量未必能准确反映其在细胞内的相对丰度。此外,目前用于测定特定蛋白质降解速率的方法本身也存在固有的不准确性:基于代谢标记的“脉冲-追踪”实验结合免疫沉淀来分离特定蛋白质12,通常并非严格意义上的定量方法。因此,使用该方法比较蛋白质降解时,应对结果的解读格外谨慎。为克服这一局限,可采用另一种环己酰亚胺(CHX)追踪实验12。在此方法中,将翻译抑制剂加入细胞培养物中,随后监测目标蛋白质稳态水平随时间的变化。然而,CHX 的应用仅限于半衰期相对较短的蛋白质(< 90 分钟),因为长期抑制蛋白质合成具有细胞毒性。值得注意的是,上述两种实验方法均依赖于特异性识别目标蛋白质的抗体,而这类抗体并不总是可获得的。

为了克服这些技术局限,研究人员已开发出多种无需细胞提取和直接蛋白质操作的方法。其中一种方法基于构建营养缺陷型酵母菌株,即通过删除编码必需代谢酶的基因获得此类菌株。这些基因包括编码氨基酸生物合成所需酶的 HIS3, LEU2LYS2TRP1,以及编码乳清酸单磷酸脱羧酶(Ura3)的 URA3,后者是嘧啶核糖核苷酸生物合成中的一种关键酶。Ura3 已被广泛应用于蛋白质降解研究中。在这些实验中,Ura3 的组成型表达可使 ura3 缺陷细胞在缺乏尿嘧啶的培养基中恢复生长13。因此,通过将降解决定子(degron)与 Ura3 融合以使其不稳定,可导致细胞在缺乏尿嘧啶的最低培养基上生长能力下降。该方法已被用于多项蛋白质降解研究,包括降解决定子的鉴定5、E3 连接酶14 和辅助泛素化因子的筛选15,以及新型泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解决定子的发现16。上述所有方法均以细胞在琼脂平板上的生长情况作为检测读数。然而,尽管生长表型(生长/不生长)具有良好的稳健性和高效性,但主要是定性结果,无法提供评估降解决定子效力或各种辅助降解因子相对贡献所需的定量信息。

因此,我们开发并利用了酵母载体和筛选方法,以实现通过URA3-降解决定子融合系统对蛋白质降解进行系统性和定量分析。该实验方案基于一种易于操作的检测方法,即在选择性条件下测定液体培养中的生长动力学(GiLS),并生成标准生长曲线。酵母生长动力学具有三个主要阶段——延滞期、指数(对数)期和稳定期。在选择性条件下,通过对Ura3-降解决定子表达水平所决定的对数生长期酵母复制动力学进行计算,可获得对蛋白质降解的无偏定量测量结果。该方法可用于在多种菌株和不同条件下,同时测量和比较多个泛素-蛋白酶体系统(UPS)底物的降解速率。

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方案

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1. 细胞培养

  1. 使用含有(a)URA3-降解决定子(degron)融合基因和(b)用于质粒筛选与维持的额外代谢标记的质粒,转化相应的营养缺陷型酵母细胞(如 Try467,见表2)。
    注:一种合适的质粒示例为YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) Deg1-UV) 。该质粒是一种酵母整合型质粒,编码一个融合蛋白,包含Deg1——源自酵母转录因子Mat2的降解决定子17、FLAG表位(用于免疫印迹检测)、Vma12——一种稳定的内质网蛋白,以及Ura315,18(见图3A)。(本研究中所用质粒及其它合适质粒的更多示例见表3。)
  2. 为进行质粒筛选与维持,将细胞培养于缺乏相应氨基酸筛选标记的合适合成定义(SD)琼脂平板中19(例如,Deg1-UV 质粒需在 SD-LYS 选择性培养基中进行筛选与维持)。
  3. 在适宜的选择性 SD 培养基中,于 30 °C 过夜培养细胞,以维持质粒,直至进入稳定生长期。根据待检测样本数量,可在试管或 96 孔板中进行培养(见第 2 节)。

2. 分析用细胞的制备

  1. 当待检测的样本数量较少(N≤15)时,按以下步骤稀释细胞并更换培养基:
    1. 取过夜培养(O/N)的细胞50 µl,加入150 µl SD培养基(透明底96孔板),每孔总体积为200 µl。注意:第一个样本设为空白对照,仅含培养基。
    2. 使用酶标仪测定96孔板中各样本的OD600值。
    3. 将测得的OD600值乘以稀释倍数(×4),再减去空白对照的读数,得到各孔的实际OD600值。随后将所得数值除以0.55进行归一化处理,以根据比尔-朗伯定律获得相当于1 cm光程的计算值。注意:当在标准96孔板中测定200 µl细胞悬液的OD600时,该系数为常数。
    4. 计算获得OD600为0.25对应的酵母细胞量所需的精确体积,并将其转移至EP管中。
    5. 以高速(12,000 × g)离心1分钟,使细胞沉淀。
    6. 弃去上清液,将细胞重悬于1 ml相应的选择性培养基中(见第3.1节),使最终OD600为0.25。
    7. 将200 µl稀释后的菌液转移至新的96孔板中的一个新孔中。
  2. 当待测样本数量较多(N>15)时,无需预先测定OD600,直接按以下步骤稀释细胞并更换培养基:
    1. 将96孔板中过夜培养(O/N)的静止期细胞10 μl转移至另一新的96孔板中,该新板每孔已预先加入190 μl相应选择性培养基(稀释比例为1:20)(见第3.1节)。

3. 选择性条件下液体培养中的生长动力学(GiLS)

  1. 使用 Ura3-降解决定子报告系统进行生长测量时,请采用以下培养基:
    1. 对于非限制性条件下酵母生长的阳性对照,使用质粒选择性 SD 培养基(见第 1.2 节)。若无需质粒筛选(例如使用整合型质粒如 Deg1-UV),可使用含所有必需氨基酸的 SD 完全培养基(SD complete)。
    2. 对于在限制性条件下测量生长的实验样品,使用 SD-URA 培养基。
  2. 将多功能酶标仪设置为:30 °C 培养温度,每 15 分钟测量一次 OD600,每 7 分钟进行一次轨道和线性振荡,每次振荡持续 1 分钟。
    注意:该双模式振荡程序已优化以实现细胞均匀分布;但其他振荡模式甚至不振荡也可能同样有效。
  3. 在酶标仪中于 30 °C 培养过夜(O/N)或直至细胞进入稳定期(12–24 小时)。
  4. 将原始数据导出为电子表格文件。
  5. 使用 MDTcalc(一种定制软件程序)分析酵母生长动力学,该程序可计算细胞群体数量翻倍所需的最短时间(最小倍增时间,Minimal Doubling Time,MDT);详细信息见第 4 节。

4. 最小倍增时间(MDT)的计算:MDTcalc 算法的原理

注意:MDTcalc 算法的原理使用在 SD 完全培养基中培养的 Try467 酵母细胞代表性样本(表 2)进行说明,分别在 表 1图 1 中展示数据电子表格和生长曲线图。

  1. 从样品孔中测得的每个读数中减去相应孔中获得的OD600空白值。将所得差值除以0.55(适用于96孔板),以校正光程长度。将最终数值(表1,Trans.)对时间作图,得到实际的酵母生长曲线(OD600/hr)(图1A)。
  2. 对每个转换后的数值计算log2 (OD600),以将对数生长期转化为线性曲线(图1B)。
  3. 计算从时间0开始、包含10个时间点(N=10)的区间斜率,并逐个时间点向前移动,直到N<10(表1,Slope;图1C)。
  4. 计算每个斜率的倒数,得到细胞群体倍增所需的时间(表1,1/Slope;图1C)。计算最小的1/Slope值以确定MDT(表1,黑色矩形;图1C)。从选定的时间区间(表1,红色矩形框出,图1B、1D)中提取样品细胞的计算MDT值(表1,1/Slope,黑色矩形)。
    注:细胞在SD-URA培养基上的生长速率与MDT成反比。

5. 使用 MDTcalc

  1. 将补充的程序文件复制到计算机中的指定文件夹。
  2. 确保包含生长数据的电子表格文件已保存并关闭。打开 MDTcalc 应用程序,查看起始界面是否出现。
    1. 输入所需信息,如图2所示:
      1. 在“文件路径”下,点击右侧矩形框以定位电子表格文件。
      2. 在“工作表名称”下,填写包含原始数据的工作表名称。
      3. 在“起始位置”下,输入第一个样本时间0点在电子表格中的坐标。
      4. 在“时间列”下,输入表示时间点列所在位置的字母(时间应以秒为单位提供)。
      5. 在“空白列”下,输入表示空白对照列所在位置的字母(通常但不一定位于96孔板的A1孔)。
      6. 在“OD值”下,选择进行MDT计算所需的最小转换后OD600值(通常为0.15–0.25)。设置此值可防止因过度稀释而处于迟滞期的培养物被计算MDT,从而确保仅对达到或超过设定OD600值的样本进行MDT计算。
    2. 输入最后一项数值后,点击屏幕底部的“计算”按钮。请确保右侧进度条逐渐变为绿色。在计算过程中请勿打开电子表格文件。
    3. MDT计算完成后,将屏幕上自动生成的两组数据导出至电子表格中。确保数据包括:(a) 通过最小OD值测试(如5.2.1.6节所设)的每个孔的MDT值;(b) 用于计算MDT的时间区间的起始时间点(起始时间)。

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结果

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研究Doa10通路中酶在报告底物降解中的作用

为验证GiLS方法的有效性,将其与传统的降解实验进行了比较。该实验评估了定位于内质网膜的Doa10 E3泛素连接酶复合物各组分的相对贡献20,21 蛋白质质量控制报告底物的降解 Deg1-VU (图3A)。该 Deg1-VU 质粒被整合到 野生型 细胞或缺乏E2结合酶基因的细胞中 UBC7 (ubc7)随后通过CHX追踪实验测定蛋白质稳定性6. Anti-FLAG 免疫印迹显示一种稳定的 Deg1-VU 蛋白条带在 ubc7 细胞,这在 野生型 细胞(图3B)。不存在 Deg1- VU 在 野生型 细胞的这一特性归因于其持续的降解过程,而该过程在 ubc7 细胞,表明 Deg1-V...

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讨论

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本文介绍一种基于细胞生长的检测方法,用于测定蛋白质相对降解速率,称为“选择性条件下液体培养中的生长动力学”(GiLS)。GiLS 检测具有多项优势:实验设置简便,数据采集与分析直接明了,且具备极高的模块化特性。因此,GiLS 可以以用户友好的多孔板形式同时应用于多个样本,并可适配自动化系统,适用于高通量应用。最重要的是,GiLS 能够提供高度可重复、定量且稳健的数据,相较于基于琼脂平板、仅筛选生长阳性/阴性结果的生长实验,具有更高的灵活性。此外,GiLS 具有高度敏感性,能够检测蛋白质降解速率或稳态水平的微小变化,从而反映相关泛素-蛋白酶体系统(UPS)组分或降解决定子(degrons)的活性。最后,与琼脂平板上的生长实验(通常需要 2–4 天)相比,GiLS 实验所需的生长周期显著缩短(<12 小时)。

尽管GiLS检测法在研究蛋白质降解方面非常有用,但仍需考虑若干重要因素。例如,必须使用遗传背景一致的酵母菌株,以避免菌株特异性生长特征带来的影响。此外,为确保检测的有效性,每次检测应在相同条件下至少重复三次,其中最重要的是初始细胞密度(OD600)、...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢 Yuval Reiss 博士和 William Breuer 博士对本文稿的审阅,以及 Omri Alfassy 在 Ura3-GFP 筛选实验开发过程中的帮助。同时感谢 M. Hochstrasser 博士和 R. Kulka 博士提供的质粒和菌株。本研究由以色列科学基金会(资助号 786/08)和美国-以色列双边科学基金会(资助号 2011253)提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含氨基酸和硫酸铵的 Difco 酵母氮源基础培养基BD Biosciences233520用于 SD 最小培养基上的酵母培养。  需额外添加的氨基酸为:精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸
硫酸铵Sigma - AldrichA4418
葡萄糖Sigma - Aldrich16325
腺嘌呤Sigma - AldrichA8626
尿嘧啶Sigma - AldrichU0750
氨基酸可获得的最高纯度 
96 孔板Nunc167008可使用任何其他兼容品牌
放线菌酮 Sigma - AldrichC7698工作浓度 0.5 mg/mL
Infinite 200 PRO 系列Tecan用于酵母培养及 OD600 测定。可使用其他任何兼容的温控酶标仪。
MDTcalc实验用软件

参考文献

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  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

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URA3 E2

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