逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

摘要

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。

摘要

胚胎干细胞（ESCs）是阐明细胞分化分子机制的优秀模型，尤其适用于研究早期造血祖细胞（HPCs）的发育过程。可通过多种技术操控ESC中的基因表达，从而确定单个分子在发育中的作用。一个难点在于，特定基因的表达往往因其表达时间的不同而产生不同的表型效应。该问题可通过构建可诱导表达目的基因的ESC系来克服，例如使用多西环素诱导型转基因系统。然而，构建此类可诱导细胞系成本高且耗时。本文描述了一种方法：将ESC来源的拟胚体（EBs）解离为单细胞悬液，通过逆转录病毒转导感染细胞悬液，随后采用悬滴法重新形成EBs，再通过流式细胞术评估后续分化情况。利用该方案发现，在ESC分化起始阶段外源表达某个microRNA基因会阻断HPC的生成；而当该microRNA基因在EB来源细胞中、于原始中胚层形成后表达时，则可促进造血分化。该方法适用于研究特定胚层组织形成后基因的功能。

引言

小鼠胚胎干细胞（ESCs）具有多能性，在白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）存在的情况下能够保持未分化状态并自我更新¹。当撤除LIF后，这些细胞会自发分化形成称为类胚体（embryoid bodies, EBs）的三维（3D）结构²。这种3D结构可促进外胚层、内胚层和中胚层这三种胚层的发育，随后进一步分化为成熟的组织类型³。胚胎干细胞是研究细胞分化分子机制的优异模型，尤其适用于早期造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs）发育过程的研究⁴。

可通过多种技术操控胚胎干细胞（ESCs）中的基因表达，从而确定单个分子在发育过程中的作用。其中最常用的技术之一是利用同源重组技术构建缺乏特定目的基因的ESC细胞系^5,6。此外，也有多种技术可用于基因的过表达。最早用于修饰ESC基因表达的技术是用重组逆转录病毒感染细胞^7,8。然而，目的基因在ESC分化为前体细胞及成熟细胞类型的过程中常常发生沉默。使用慢病毒可在一定程度上抑制病毒介导基因表达的沉默现象⁹。其他用于过表达的病毒载体还包括腺病毒和腺相关病毒¹⁰。此外，常规的转染技术被广泛用于稳定导入表达质粒，以实现ESC中外源基因的表达¹¹。这些系统存在一个共同难点....

方案

1. 胚状体（EB）形成

1. 已在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上适应并维持的明胶包被ESC。将ESC在涂有0.1%明胶的6孔组织培养板上连续传代3次，以去除MEFs。
   1. 使用含LIF的ESC维持培养基培养细胞，以保持其未分化状态（表1）。确保细胞融合度 never 超过80%。用于分化实验的细胞应为低代次细胞（从MEFs去除后传代10次或更少）。
2. 在ESC进行拟胚体（EB）分化培养的前一天，对细胞进行传代，使其在次日达到约50–70%的融合度。继续使用ESC维持培养基培养细胞，以保持其多能性。
3. 在分化当天，吸除ESC维持培养基，并用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，11.9 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）洗涤6孔板的每孔。
   1. 向每孔加入200 µl 0.25%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育3分钟。
   2. 用800 µl分化培养基终止胰蛋白酶/EDTA的作用。使用带p200枪头的2 ml血清移液管反复吹打5–10次，使细胞充分解离为单细胞悬液。确保p200枪头与移液器接口紧密，防止液体渗入枪头与移液管之间。
   3. 吹打约5–10次。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 将细胞转移至15 ml锥形离心管中，用PBS补总体积至10 ml。在室温下以31....

结果

在这些研究中，使用了来自129X1/SvJ小鼠品系的RW4来源的已凝胶化的胚胎干细胞（ESCs）。在分化第3天分离拟胚体（EBs）。为获得最佳结果，EBs应呈球形且不贴壁（图1A、B）。通过使用共表达荧光标记GFP及目的基因的病毒进行离心接种（spinoculation）后，采用悬滴法重新形成EBs。从分化第2.0、2.5和3.0天的EBs制备的细胞悬液均能成功重新形成EBs，但从第4.0天的EBs制备的细胞悬液则无法重新形成EBs。在分化第8天，通过荧光显微镜观察感染细胞与非感染细胞之间EBs的嵌合情况（图2A、B）。由于EBs密度较高，常使其看起来似乎100%为GFP阳性。然而，通过聚焦于不同的焦平面，可揭示GFP阳性与阴性细胞对EBs的贡献（图2B）。

为了分析造血祖细胞（HPC）的发育，将嵌合体拟胚体（EB）在分化8天后解离为单细胞悬液。拮抗mirn23a基因簇（miR-23a、24-2和-27）中miRNA的活性会导致胚胎干细胞（ESCs）无法分化为血液.......

讨论

如上所述，可利用多西环素系统生成可诱导表达目的基因的胚胎干细胞（ESC）克隆，但构建这些细胞系耗时且劳动强度大。本实验方案描述了一种方法，可在由ESC来源的拟胚体（EB）制备的单细胞悬液中表达目的基因。经病毒感染的细胞随后通过悬滴法重新聚集成EB，以观察其后续分化情况。在示例（图3）中显示，在分化第3天表达mirn23a基因簇可促进造血发育。此时，原始胚层组织已经形成，包括可发育为血液前体细胞的早期中胚层。在RW4 ESC分化第2天和第3天，通过定量反转录PCR（Q-RT-PCR，数据未显示）可检测到代表外胚层（Pax6）、内胚层（FoxA2）和中胚层（T、Twist和Tbx6）的基因表达。若要增强造血前体细胞（HPC）的生成，mirn23a可能需要在早期中胚层中表达。该技术使得研究人员能够在不耗费大量精力构建新型试剂的情况下，判断转基因在不同时间点表达是否会产生不同的效应。当观察到与特定时间表达相关的表型后，研究者可进一步投入精力构建可诱导表达细胞系，以实现对转基因表达的精确调控。

该技术的其他应用包括在基因双.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma/Aldrich	D5796
β-巯基乙醇	Sigma/Aldrich	M3148
FBS（胚胎干细胞筛选型）	Hyclone	SH30070.03E
FBS（明确成分型）	Hyclone	SH30070.03
非必需氨基酸	Life Technologies	11140
L-谷氨酰胺	Life Technologies	35050
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070
胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25200
LIF ESGRO	Millipore	ESG1107
ACCUMAX	Millipore	SCR006
胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25200
Falcon 组织培养板 6 孔	Fisher Scientific	08-772-1B
Falcon 未处理板 6 孔	Fisher Scientific	08-772-49
Falcon 培养皿 10 cm	Fisher Scientific	08-757-100D
Falcon 培养皿 15 cm	Fisher Scientific	08-757-148
Falcon 离心管 5 ml	Fisher Scientific	14-959-11A
Falcon 带细胞滤网盖的 5 ml 离心管	Fisher Scientific	08-771-23
白色无菌储液槽	U.S.A. Scientific	111-0700
大鼠抗小鼠 CD41 PE 标记抗体	Biolegend	133906
大鼠抗小鼠 CD117 APC/CY7 标记抗体	Biolegend	105826
RW4 胚胎干细胞	ATCC	CRL-12418