本文介绍了一种内嗅-海马体脑片器官型培养的实验方案，该方法可重现缺血性脑损伤的多个方面。通过在研究神经元变化的同时，对神经血管系统的变化进行观察，该方案成为研究脑损伤后神经组织可塑性变化的多功能工具。
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摘要
摘要
缺血性脑损伤是最常见且最具破坏性的疾病之一，会损害脑的正常功能，常导致患者出现持续性的功能障碍。尽管已有大量研究，目前仍缺乏有效的治疗手段来减轻神经元损伤，或保护缺血区域神经元免于延迟性继发性死亡。该领域的研究通常依赖复杂且存在问题的动物模型。经受氧糖剥夺（OGD）的内嗅皮层-海马体器官型脑片培养体系已被确立 在 体外 模拟脑缺血的模型。本研究的新颖之处在于，除了神经元变化外，还研究了脑血管的变化，从而能够比较和关联神经元区室与血管区室的反应。本方案中介绍的方法显著拓展了器官型脑片培养技术的潜在应用范围。在器官型脑片培养中，仅通过相对简单的方式即可诱导氧糖剥夺（OGD）或单纯缺氧，并在神经组织中引发可靠且可重复的损伤。这与诱导中风和缺血的复杂且存在问题的动物实验形成鲜明对比。 体内通过扩大分析范围，纳入对血管系统反应的研究，可能为保护和恢复脑功能提供新的途径。本文介绍的脑片培养方法可能成为研究缺血性脑损伤的一种有吸引力且重要的工具，并可用于测试旨在神经保护的潜在治疗措施。
引言
中枢神经系统对血管供应的氧气和葡萄糖的缺失或减少尤为敏感。即使脑部血供短暂中断，也可能导致相关脑区功能永久性丧失，从而引发典型的卒中综合征。除了原发受累区域的神经元丢失外，通常还会因继发性损伤而出现额外的延迟性神经元死亡。遗憾的是，迄今为止尚无可用于减少继发性神经元死亡的神经保护治疗方法1。针对继发性损伤机制的研究依赖于脑缺血动物模型，如大脑中动脉闭塞模型以及多种血栓性闭塞技术（近期综述见2）。与此同时，由于动物模型在应用上存在局限性和伦理问题，研究者也广泛采用各种中枢神经系统组织的器官型脑片培养方法，以研究神经元对不同类型损伤的反应3-5。
为了研究模拟缺血性脑损伤条件下神经元的反应，已开发出氧糖剥夺（OGD）模型系统。在此模型中，脑片培养物被暂时暴露于缺乏葡萄糖且用氮气平衡以去除氧气的培养基中。通过这种处理，可诱导产生与体内缺血损伤后观察到的神经元损伤和丢失非常相似的结果in vivo6, 7。在海马体中，这种处理特异性地引起CA1区的神经元丢失，而CA3区或海马齿状回则不受影响。相比之下，目前对脑片培养中血管反应的研究尚不广泛。一个明显的原因是脑片培养模型缺乏血液循环和血管灌注。然而，我们先前已证明，在中枢神经系统（CNS）脑片培养物中维持血管数天是可行的8, 9。
本方法的总体目标不仅是监测神经元在氧糖剥夺（OGD）后的命运，还将研究扩展至对血管系统命运及其重塑过程的观察，而血管系统是损伤反应中的重要组成部分。迄今为止，此类研究仍需依赖动物实验（De Jong et al., 1999; Cavaglia et al., 2001）。在本方案中，我们将详细说明如何在经受缺氧或兴奋性毒性损伤的内嗅-海马体外脑片培养模型中开展此类研究，并同时分析神经元存活情况和血管反应。本方案基于此前发表的关于该主题的研究10，可为任何关注中枢神经系统中神经-血管相互作用的实验室提供参考。
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方案
动物实验遵循2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）的规定，并经瑞士有关当局审查和批准。
1. 建立内嗅皮层-海马脑片器官型培养
- 采用静态培养法从出生后第4天（P4）的小鼠幼崽制备内嗅-海马体脑片器官型培养物（EHOSCs）4,11。此处使用C57Bl6和CB6F1小鼠。
- 每只小鼠幼崽的脑片培养制备过程约需30分钟，即一窝6只幼崽共需3小时。所有操作均须在超净工作台内无菌条件下进行，并使用灭菌的手术器械。
- 为避免脑片在隔-颞轴上的位置可能带来的干扰，仅使用海马体隔侧半段的脑片。除非另有说明，所有步骤均在室温（RT）下进行。
- 用手术剪剪下P4小鼠幼崽的头部。此步骤无需麻醉。
- 去除脑组织周围的颅骨，辨认大脑半球尾端与中脑之间的裂隙。小心将中脑前方的脑组织从颅骨中取出，并置于冰上预冷的制备液中，该液体为添加了稳定型L-谷氨酰胺的MEM培养基。
- 在体视显微镜下继续解剖，期间脑组织始终浸没于预冷的制备液中。去除大脑半球表面残留的脑膜。在半球内侧尾部表面识别海马体，并将其连同邻近的内嗅皮层一起从其余脑组织中分离出来。
- 将组织转移至组织切片机，在无菌条件下沿海马体的隔-颞轴垂直方向切成400 µm厚的脑片。
- 将脑片放置于细胞培养插入式培养皿上（每张插入膜约放置6片脑片），并在6孔板中培养，每孔加入1 ml培养液（47 ml MEM，25 ml Eagle培养基，25 ml 马血清，1 ml GlutaMAX I，1 ml 无菌10%葡萄糖溶液，pH 7.3），置于37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育。次日更换培养液，之后每隔一天更换一次，持续一周。
2. 体外 缺氧与氧糖剥夺及再灌注
- 具体操作时间安排见表1。在缺氧或氧糖剥夺（OGD）处理前，将EHOSCs培养至第5天（DIV5）。此时将培养基从含25%马血清的孵育培养基更换为无血清培养基，其成分为：Neurobasal培养基，添加2% B27补充剂、1% GlutaMAX以及额外的0.1%葡萄糖。
- 按照参考文献7所述方法配制OGD培养基。各组分终浓度如下：0.3 mM CaCl2、70 mM NaCl、5.25 mM NaHCO3、70 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、2 mM MgSO4 和10 mM蔗糖，pH值调至6.8。向两个6孔细胞培养板的每孔中加入1 ml OGD培养基。
- 在缺氧舱内用N2对OGD培养基灌流1小时，随后密封，并于37 °C培养箱中过夜保存。
- 使用厌氧指示条作为缺氧指示。当指示条颜色由粉红色变为白色时，表明培养基中已无氧气。
- 诱导缺氧时，使用含葡萄糖的无血清培养基代替OGD培养基。使用前，参照上述OGD培养基的方法，在缺氧舱内用N2对培养基进行灌流处理。
- 在脑片接受OGD处理前，再次用N2对OGD培养基灌流30分钟。每孔加入2 µl浓度为1 mg/ml的碘化丙啶（PI）溶液（终浓度为2 µg/ml），孵育30分钟，并根据PI阳性细胞数量较少来筛选健康脑片用于后续实验。
- 参照图1所示的时间安排进行OGD处理和再灌注。对脑片分别进行仅缺氧（缺氧）或同时缺氧缺糖（OGD）处理，持续15分钟。
- 为诱导缺氧或OGD，将脑片转移至OGD培养基中，并在缺氧舱内孵育15分钟。当培养体系从常规培养基切换至OGD培养基及恢复时，确保吸除插入膜侧壁残留的所有液体。
- 缺氧或OGD处理后，将OGD培养基更换为含氧的无血清培养基，并将脑片置于常规培养箱（37 °C，5% CO2）中，在无血清培养基中恢复培养3、24或48小时。在固定前再次加入PI，以评估细胞死亡情况。
3. 内嗅-海马脑片组织培养的药理学处理
- 在给予药理学处理前，将EHOSCs在培养基中培养5天（DIV5）。在氧糖剥夺（OGD）期间或OGD结束后立即将脑片转移至无血清培养基时，开始药理学处理。
- 用于保护脑片免受OGD损伤的处理。
- 在诱导OGD期间（持续15分钟）或OGD诱导后立即，在培养基中加入100 µM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）或1 µM 河豚毒素（TTX），处理30分钟。随后在常氧条件下的无血清培养基中孵育48小时，然后进行固定。
- 用于诱导兴奋性毒性死亡的处理。
- 在孵育培养基中培养5天后，将培养物转移至含有100 µM (RS)-α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）的无血清培养基中，处理30分钟。
- 通过抽吸法移除含AMPA的培养基（注意彻底清除插入膜上的残留液体），然后将脑片转移至含有正常无血清培养基的新培养板中，继续培养48小时直至固定。
4. 内嗅-海马器官型脑片培养物的固定与免疫染色
- 碘化丙啶（PI）染色。
- 将 PI 以 2 µg/ml 的浓度加入活体脑片的培养基中，孵育 30 分钟。使用配备荧光光学系统的倒置显微镜观察活体培养物，并挑选脑片进行后续处理。若需将 PI 染色与免疫组织化学结合，应在固定培养物前 30 分钟加入 PI 溶液。
- 脑片的固定。
- 从 6 孔板中移除培养基，每孔加入 3 ml 新鲜配制的 4% 多聚甲醛（PFA）。然后将 6 孔板放入冰箱，在 4 °C 下过夜固定（O/N）。
- 次日移除 PFA 溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脑片 3–4 次。
- 从细胞培养插件中取出脑片，并对游离漂浮切片进行免疫组织化学封闭处理。
- 使用 0 号或更小的美术画笔小心地将脑片从培养插件上分离并取出。将每一片脑片转移至 96 孔板的一个孔中，孔内已预先加入封闭缓冲液（含 3% 正常山羊血清（NGS）和 2% Triton-X100 的 PBS）。将脑片置于封闭缓冲液中，在室温（RT）下置于水平摇床上持续振荡孵育 2 小时 。
- 脑片培养物的免疫染色
- 标记血管时，使用多克隆抗层粘连蛋白（anti-laminin）抗体，按 1:200 的比例稀释于含 1% NGS 和 0.5% Triton-X100 的 PBS 中。
- 标记神经元时，使用抗微管相关蛋白 2（MAP2）抗体，按 1:500 的比例稀释于含 1% NGS 和 0.5% Triton-X100 的 PBS 中。
- 将脑片与一抗在 4 °C 下孵育 48 小时，并持续振荡。孵育结束后，用含 0.5% Triton-X100 的 PBS 洗涤 3–4 次。
- 将二抗按 1:500 的比例稀释于含 1% NGS 和 0.5% Triton-X100 的 PBS 中。在避光条件下，于室温下用 Alexa 荧光素标记的二抗孵育脑片 2 小时。选用适当的 Alexa 350 或 488 标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗。
- 移除二抗溶液，用 Tris 缓冲盐水（TBS）清洗脑片三次；将脑片置于载玻片上，用 Mowiol 封片。
- 染色脑片的显微观察
- 可在配备落射荧光设备的标准显微镜或共聚焦显微镜下观察染色后的脑片。使用合适的相机采集图像。对于部分图像，可反转荧光对比度，以获得亮背景下的深染血管结构（图 5 和 6）。
5. 培养物中区域性血管密度的测定
- 根据参考文献8所述方法，基于血管交叉数量量化血管密度。
- 使用经层粘连蛋白染色的切片进行这些测量。将10倍放大倍率的图像与一个6×6网格叠加，每个网格为100×100 µm的正方形，总视野面积为0.25 mm2。
- 在CA1、CA3、DG和EC区域分别叠加三个这样的网格（图2），计数穿过网格线的血管数量。
- 为获得具有良好统计学意义的结果，需至少进行3次独立实验，每次实验包括来自3只小鼠幼崽的数据，每只幼崽取3张切片。
- 计算每个区域网格中血管交叉数的平均值，并使用适当的统计学软件进行单因素方差分析（ANOVA），以Bonferroni校正作为事后检验（定义p<0.05为具有显著性差异）。
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结果
氧糖剥夺和缺氧可特异性地诱导海马CA1区神经元死亡和血管减少。
单独进行15分钟的氧糖剥夺（OGD）或单纯缺氧即可显著诱导细胞死亡，通过碘化丙啶染色可见，这种效应特异性地出现在海马的CA1区域（图3），与先前报道的结果相似7。利用标记物对血管网络进行可视化后发现，在OGD处理后，除CA1区域外，培养物大部分区域的血管密度和结构与对照组相比无明显差异。而在CA1区域，血管密度降低，血管网络部分遭到破坏（图3，E 和 F）。这些变化仅出现在碘化丙啶染色增强的区域。
血管变化的时间进程与神经元变性过程相平行。
我们通过在缺氧后 3 小时、24 小时和 48 小时的时间点，研究了 CA1 区域神经元变性和血管丢失的时间进程。在缺氧后 3 小时，未见碘化丙啶染色，且血管结构未出现任何改变，表明此时尚未出现可见变化（图 4，A
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讨论
通过本文介绍的方法，海马脑片组织培养可作为一种多功能工具，用于研究神经组织损伤后的可塑性变化。尽管组织脑片培养过去已被用于研究缺血后神经元的反应6, 7，但同时研究血管变化的新角度显著拓展了该方法的潜在应用。在组织脑片培养中，仅通过相对简单的方式即可诱导氧糖剥夺（OGD）或单纯缺氧，并在神经组织中产生可靠且可重复的损伤。此外，脑片培养方法不仅可用于研究缺血刺激的后果，还可用于评估旨在神经保护的潜在治疗措施。因此，脑片培养是研究缺血性脑损伤的一种重要且具有吸引力的工具。
本文所述方法易于实施，适用于所有具备中枢神经系统脑片培养经验的实验室。实施氧糖剥夺（OGD）或缺氧处理时，需用氮气仔细平衡培养基2 为获得可重复的结果，还须注意仅使用在施加氧糖剥夺（OGD）前PI阳性细胞数量较少的脑片培养物。缺氧条件（即， 根据所使用的脑片培养类型，可对缺氧或氧糖剥夺（OGD）的施加时间进行调整和优化。
尽管神经元对缺血的反应已被广泛研究，但关于缺氧-缺血性脑损伤后血管变化的信息...
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披露
动物实验遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）的规定，并经瑞士相关机构审查和批准。作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由巴塞尔大学生物医学系和瑞士国家科学基金会（31003A_141007）资助。Markus Saxer 提供了技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基 MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | L-谷氨酰胺的稳定形式 |
| Millicell 细胞培养小室 | Millipore | PICM03050 | |
| 基础伊格尔培养基 | Gibco | 41010-026 | |
| 马血清 | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| B27 补充剂 | Gibco | 17504-044 | |
| 厌氧条 | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| 碘化丙啶溶液 | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| 多克隆抗层粘连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 抗 MAP2 抗体 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa 抗小鼠 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa 抗小鼠 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa 抗兔 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa 抗兔 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| 统计学软件 | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain 组织切片机 | Ted Pella | 10180 | |
| 低氧培养箱 | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
参考文献
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