由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

摘要

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。

摘要

营养不良性心肌病是肌营养不良症的一种尚未被充分理解的后果。从肌营养不良症患者身上获取诱导多能干细胞（iPSCs）是研究该疾病极为宝贵的细胞来源。 在 体外 疾病模型系统可用于药物筛选研究。已成功将患者来源的尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞，用于构建营养不良性心肌病模型。¹为解决整合型载体系统的安全问题，我们提出了一种利用非整合型仙台病毒载体将山中因子转导至杜氏肌营养不良症患者尿液细胞的实验方案。该方案可在2至3周内获得完全重编程的克隆。经第13代传代后，多能干细胞中已无载体残留。这些肌营养不良症诱导多能干细胞可分化为心肌细胞，可用于疾病机制研究或药物筛选。

引言

心肌病是杜氏与贝克型肌营养不良症（MD）患者死亡的第二大原因。尽管X连锁的肌营养不良蛋白基因突变在每3,500例男性出生中即有一例发生，但目前对导致心肌进行性损伤的分子与细胞事件仍知之甚少。近年来，从肌营养不良症患者来源的人诱导性多能干细胞已成为研究疾病潜在机制及用于药物筛选的一种新型工具^1,2。

皮肤活检或采血可能带来的不适感，可能会使年轻患者和/或其监护人不愿同意参与研究。尿液样本是一种非侵入性获取体细胞的来源，适用于重编程技术。我们近期已证明，从肌营养不良症患者收集的尿液细胞可被培养，并通过使用Yamanaka因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc；OSKM）的逆转录病毒转导高效地重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）¹。逆转录病毒基因递送的缺点是重编程基因会随机整合到宿主染色体中。为克服这一局限，我们采用了非整合型仙台病毒进行尿液细胞的重编程。

本方案详细描述了利用仙台病毒对肌营养不良症患者尿液中分离的细胞进行重编程，随后可将这些细胞分化为心肌细胞或其他细胞类型以供进一步研究。该方案也可根据需要调整，用于其他患者特异性疾病的研究所。

方案

注意：患者和/或其监护人应签署知情同意书，同意参加经机构审查委员会批准的研究。

1. 缓冲液与培养基的配制

1. 洗涤缓冲液：制备 100 ml 洗涤缓冲液，将 1 ml 100 倍浓度的青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素 + 100 µg/ml 链霉素）加入 99 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 尿源性祖细胞（UPC）培养基：制备 UPC 培养基时，将角质形成细胞无血清（KSF）培养基与祖细胞培养基等体积混合。
   1. KSF 培养基：制备角质形成细胞培养基时，向 500 ml KSF 培养基中加入 5 ng/ml 表皮生长因子（EGF）、50 ng/ml 牛垂体提取物（BPE）、30 ng/ml 霍乱毒素以及青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素，100 µg/ml 链霉素）。
   2. 祖细胞培养基：将四分之三体积的 DMEM 与四分之一体积的 Ham-F12 培养基混合，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.4 µg/ml 氢化可的松、0.1 nM 霍乱毒素、5 ng/ml 胰岛素、1.8 × 10^-4 M 腺嘌呤、5 µg/ml 转铁蛋白、2 × 10^-9 M 三碘甲腺原氨酸、10 ng/ml EGF 以及青霉素/链霉素溶液。
3. 人胚胎干细胞（hES）培养基：向 400 ml DMEM/F12 培养基中加入 20% KO-血清替代物（K-SR）、1 倍浓度 MEM 非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM β-巯基乙醇、20 ng/ml bFGF 以及青霉素/链霉素溶液。

2. 尿液样本采集

1. 指导患者在尿液采集前 30 分钟饮用适量液体，以确保能够采集到足够的尿液量（约 30–40 ml）。
2. 向患者和/或其监护人提供尿液采集套装，内含以下物品：（1）获取无菌或清洁中段尿样本的书面说明，（2）湿润的抗菌湿巾，以及（3）一个 100 ml 的无菌标本采集杯。指导患者进行样本采集。
3. 立即将尿液样本置于冰上，并用冷藏箱转运至实验室。应立即处理尿液以分离细胞。若不可避免出现延迟，可将样本在冰上保存最多 4 小时，细胞活力损失最小。

3. 尿液细胞的分离与扩增

注意：以下步骤需在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中的无菌条件下进行。

1. 使用无菌移液管将尿液样本转移至无菌的 50 ml 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。
2. 吸除上清液，保留约 1 ml，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
3. 将多个离心管中的沉淀用 7 ml 洗涤缓冲液重悬并合并，再次在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。
4. 小心吸除上清液，保留细胞沉淀及约 0.2–0.5 ml 上清液，用 2–3 ml 尿源性祖细胞（UPC）培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至 2–6 个未经包被的 24 孔板孔中。
5. 72 小时后，每孔补充 0.5 ml 新鲜 UPC 培养基，此后每 2–3 天更换一次培养基。未贴壁的红细胞和鳞状细胞将随换液被清除。
6. 在接种后 4–6 天观察培养情况。
   注：将开始出现 2–4 个细胞的小克隆。细胞呈圆形或细长形，分别代表肾小管上皮（RE）细胞的 I 型和 II 型³。
7. 自细胞出现后，每 2–3 天更换一次培养基，因为此时细胞将进入快速增殖阶段。
8. 当细胞融合度达到 80–90% 时（接种后约 9–15 天），将细胞消化并传代至 2–4 个 24 孔板孔中进行进一步扩增，接种密度为 15,000–18,000 个细胞/cm²。将此次传代标记为细胞第 1 代（P1）。
9. 通过流式细胞术分析、免疫组织化学染色或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对尿液来源细胞进行谱系鉴定。
10. 对分离获得的尿液细胞进行重编程（见第 4 节），或将其置于冷冻保存液（含 10% 血清和 10% DMSO 的 DMEM）中冷冻，用于长期低温保存。

4. 使用仙台病毒对尿液细胞进行重编程

注意：操作转染试剂时，建议正确处理并使用个人防护装备（PPE）。以下步骤应在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中的无菌条件下进行。建议妥善处置转染试剂和/或转染后的细胞，以避免对环境和健康造成危害。对于尿液细胞重编程，请使用仙台病毒重编程试剂盒，并对生产商提供的依赖饲养层细胞的方案进行如下修改。

1. 为确保使用仙台病毒实现高效的重编程，应选用处于第1至第5代且快速分裂的尿液细胞。若细胞增殖不良或出现衰老现象，则应弃用，因其重编程效率低下。
2. 在6孔板的两个孔中，每孔接种60,000个细胞，标记为第-2天。根据需要调整接种密度（每孔5 × 10⁴–9 × 10⁴个细胞），以确保在第0天达到80–90%的融合度。
3. 在第0天（细胞接种后48小时），准备包含四个OSKM因子的仙台病毒重编程载体（SeV）。将各载体分别加入1 ml预热的UPC培养基中。使用MOI为1–1.5（5–7.5 × 10⁵ CIU），此剂量足以对尿液细胞进行重编程。吸除原有培养基后，缓慢将1 ml UPC + SeV加入一个尿液细胞孔中。另一个孔作为转导阴性对照。
4. 在第1天，将UPC + SeV培养基更换为新鲜的UPC培养基。由于病毒的细胞毒性，24小时后可观察到部分细胞死亡。
5. 根据重编程克隆形成的效率及克隆的致密形态，持续每日更换培养基，直至第6或第7天。
6. 在转导细胞消化前一天（第5或第6天），通过将经丝裂霉素C（10 µg/ml，处理3小时）处理的MEF细胞以5 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种于0.1%明胶包被的100 mm²培养皿上，制备MEF饲养层平板。
7. 次日（第6或第7天），使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞重悬于UPC培养基中，并将5 × 10⁴–2 × 10⁵个细胞/100 mm²接种至MEF饲养层平板。
8. 次日，更换为hES培养基，并每日更换培养基。在显微镜下观察细胞，监测转化后的细胞状态。
   注：转导后12–18天，细胞形成具有典型鹅卵石样形态的克隆样集落，且核质比升高。
9. 转导后两周至三周内，挑选克隆并转移至新培养板进行克隆扩增。
10. 通过活细胞染色法筛选iPSC克隆：将细胞在CO₂培养箱中与TRA-1-81抗体于37 °C孵育1小时，随后加入特异性荧光染料标记的二抗，在CO₂培养箱中37 °C复染1小时。
11. 使用26 G 1½英寸针头将较大的TRA-1-81阳性iPSC克隆划成大小均一的小块（每个克隆4–6块）。
12. 使用无菌移液器吸头挑取多个克隆的10–20个划痕小块，转移至含hES培养基的Matrigel（10 µg/cm²）包被的24孔板的各个孔中。
    注：单个克隆的片段若单独接种于单个孔中，则无法扩增或维持多能性。
13. 在重编程克隆贴附于Matrigel表面后24–48小时内，将培养基由hES培养基更换为iPSC培养基。
14. 在Matrigel包被的培养板上维持培养期间，使用移液器吸头手动刮除任何已分化的细胞或污染的MEF饲养层细胞，以富集完全重编程且具有多能性的肌营养不良iPSC（MD-iPSC）克隆。
15. 当单个克隆达到约100 μm大小时，使用0.48 mM EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化3分钟，将MD-iPSC的小细胞集落重悬于含5 μM Y27632（ROCK激酶抑制剂）的iPSC培养基中，接种至新鲜Matrigel（10 µg/cm²）包被的12孔板中进行扩增。每日更换iPSC培养基。
16. 每个克隆的完全重编程可通过OSKM基因的表达分析以及多能性标志物（Oct3/4和TRA-1-81）的免疫组织化学染色来确定。应采用严格的多能性潜能评估方法，以确认完全重编程的iPSC系能够分化为三个胚层。该目标可通过拟胚体（EB）形成与分化实验或畸胎瘤形成实验实现。

结果

从人尿液中分离的大多数祖细胞对尿路上皮祖细胞和壁细胞标志物呈阳性，例如 CD44、CD73 和 CD146（分别为 97.37%、97.09% 和 97.3%；图 1A 和 1B）。这些细胞还表达其他间充质标志物，如 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和波形蛋白（vimentin）（图 1B）。RT-PCR 分析表明培养物中存在混合细胞群体，表现为角蛋白-7（Cytokeratin-7, CK-7）以及尿路斑蛋白（Uroplakin, UP）-Ia 和 -IIIa 表达较弱，这些是尿路上皮谱系的标志物（图 1C）。

重编程步骤的示意图见图2A。代表性图像展示了在实验流程不同时间点的细胞形态（图2B）。尿液细胞在重编程过程中从细长的II型细胞（第0天）转变为鹅卵石样形态（第4天）。到第12天时，可观察到典型的多能性克隆（iPSC），并在无饲养层条...

讨论

利用诱导多能干细胞（iPSCs）建立心血管疾病模型已成为研究遗传因素贡献的常用方法^4-6。通过提供尿液采集等非侵入性方法，可以避免从患者（尤其是年幼儿童）获取细胞样本时存在的一些意外困难。在这一年轻患者群体中，常常难以收集到足够体积的尿液以获得足量可用于重编程的尿细胞。指导年幼患者在尿液采集前30分钟饮用液体，有助于提高尿细胞分离的成功率。然而，在该人群中可能仍需多次重复采集尿液。为了优化从杜氏肌营养不良症患者中分离和培养尿细胞（UCs）的效果，我们整合并改进了两种不同的实验方案^3,7。

已从肌营养不良症患者的皮肤成纤维细胞或尿液细胞中成功生成诱导性多能干细胞^1,2。然而，这两种重编程方案均依赖于慢病毒将重编程因子导入体细胞。这种整合型病毒递送方法可能存在风险，因为外源基因若随机整合至宿主基因组中，可能引发外源基因再激活或诱变（详见文献8综述）。因此，我们改进了这些技术，采用仙台病毒以非整合方式将OSKM转录因子基因导入尿液细胞⁹。

利用仙...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
4 盎司带盖标本杯	STL Medical Supply	M9AMSAS340	用于尿液样本采集
15 ml BD-Falcon 管	Fisher Scientific	352097
50 ml BD-Falcon 管	Fisher Scientific	352098
圆形玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-81
CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒	Life Technologies	A1378-001
PBS，pH 7.4	Life Technologies	10010-023
青霉素-链霉素（不含谷氨酰胺）	Life Technologies	15140-122	使用前在 37 °C 水浴中预热
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875-093	使用前在 37 °C 水浴中预热
B-27 补充剂（含胰岛素，50 倍浓缩）	Life Technologies	17504-044	使用前在 37 °C 水浴中预热
B-27 补充剂（不含胰岛素，50 倍浓缩）	Life Technologies	0050129SA	使用前在 37 °C 水浴中预热
DMEM/F12（1:1）	Life Technologies	11330-032	使用前在 37 °C 水浴中预热
Versene，1:5,000	Life Technologies	15040066	使用前在 37 °C 水浴中预热
bFGF（10 µg）	Life Technologies	13256-029	使用前在 37 °C 水浴中预热
细胞计数器专用计数板	Life Technologies	C10228
无血清培养用胎牛血清（500 ml 瓶装）	Life Technologies	10828-028	使用前在 37 °C 水浴中预热
Recovery 细胞冻存培养基	Life Technologies	12648-010
角质形成细胞-SFM（1 倍浓度，液体）	Life Technologies	17005-042	使用前在 37 °C 水浴中预热
DMEM，高糖，含 Glutamax	Life Technologies	10566-016	使用前在 37 °C 水浴中预热
Ham's F-12 营养混合物	Life Technologies	11765-054	使用前在 37 °C 水浴中预热
EGF 重组人蛋白，液态	Life Technologies	PHG0311L	使用前在 37 °C 水浴中预热
胰岛素，人重组，锌溶液	Life Technologies	12585-014	使用前在 37 °C 水浴中预热
TeSR-E8	Stem Cell Technologies	5940	使用前在 37 °C 水浴中预热
ROCK 抑制剂（Y-27632）	Selleck	S1049	使用前在 37 °C 水浴中预热
Matrigel	BD Biosciences	354277	适用于人胚胎干细胞的基质，不含 LVED
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74104
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix（2 倍浓度）	Thermo-Scientific	K1081
经鉴定适用于细胞培养的胎牛血清（FBS-Qualified）	Sigma Aldrich	F6178	使用前在 37 °C 水浴中预热
腺嘌呤生物试剂	Sigma Aldrich	A2786-5G	使用前在 37 °C 水浴中预热
霍乱弧菌来源的霍乱毒素 Vibrio cholerae	Sigma Aldrich	C8052-.5MG	使用前在 37 °C 水浴中预热
氢化可的松	Sigma Aldrich	H0888-1G	使用前在 37 °C 水浴中预热
人全转铁蛋白	Sigma Aldrich	T0665-50MG	使用前在 37 °C 水浴中预热
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐	Sigma Aldrich	T6397-100MG	使用前在 37 °C 水浴中预热
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
Fluoromount 水性封片剂	Sigma Aldrich	F4680
16% 多聚甲醛	Alfa-Aesar	43368
抗体
小鼠抗 CD44 抗体 - FITC 标记	BD Biosciences	560977
小鼠抗 CD146 抗体 - PE 标记	BD Biosciences	561013
小鼠抗 CD73 抗体 - PE 标记	BD Biosciences	561014
小鼠抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体	Sigma Aldrich	A2547
小鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗体	Abcam	ab8978-100
小鼠抗 TRA-1-81 抗体	Life Technologies	411100
兔抗 Oct 3/4 抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
小鼠抗肌营养不良蛋白（Dystrophin）抗体	Leica Biosystems	NCL-DYSB