本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。
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本文内容
摘要
摘要
营养不良性心肌病是肌营养不良症的一种尚未被充分理解的后果。从肌营养不良症患者身上获取诱导多能干细胞（iPSCs）是研究该疾病极为宝贵的细胞来源。 在 体外 疾病模型系统可用于药物筛选研究。已成功将患者来源的尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞，用于构建营养不良性心肌病模型。1为解决整合型载体系统的安全问题，我们提出了一种利用非整合型仙台病毒载体将山中因子转导至杜氏肌营养不良症患者尿液细胞的实验方案。该方案可在2至3周内获得完全重编程的克隆。经第13代传代后，多能干细胞中已无载体残留。这些肌营养不良症诱导多能干细胞可分化为心肌细胞，可用于疾病机制研究或药物筛选。
引言
心肌病是杜氏与贝克型肌营养不良症（MD）患者死亡的第二大原因。尽管X连锁的肌营养不良蛋白基因突变在每3,500例男性出生中即有一例发生，但目前对导致心肌进行性损伤的分子与细胞事件仍知之甚少。近年来，从肌营养不良症患者来源的人诱导性多能干细胞已成为研究疾病潜在机制及用于药物筛选的一种新型工具1,2。
皮肤活检或采血可能带来的不适感，可能会使年轻患者和/或其监护人不愿同意参与研究。尿液样本是一种非侵入性获取体细胞的来源，适用于重编程技术。我们近期已证明，从肌营养不良症患者收集的尿液细胞可被培养，并通过使用Yamanaka因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc；OSKM）的逆转录病毒转导高效地重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）1。逆转录病毒基因递送的缺点是重编程基因会随机整合到宿主染色体中。为克服这一局限，我们采用了非整合型仙台病毒进行尿液细胞的重编程。
本方案详细描述了利用仙台病毒对肌营养不良症患者尿液中分离的细胞进行重编程，随后可将这些细胞分化为心肌细胞或其他细胞类型以供进一步研究。该方案也可根据需要调整，用于其他患者特异性疾病的研究所。
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方案
注意：患者和/或其监护人应签署知情同意书，同意参加经机构审查委员会批准的研究。
1. 缓冲液与培养基的配制
- 洗涤缓冲液：制备 100 ml 洗涤缓冲液，将 1 ml 100 倍浓度的青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素 + 100 µg/ml 链霉素）加入 99 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 尿源性祖细胞（UPC）培养基：制备 UPC 培养基时，将角质形成细胞无血清（KSF）培养基与祖细胞培养基等体积混合。
- KSF 培养基：制备角质形成细胞培养基时，向 500 ml KSF 培养基中加入 5 ng/ml 表皮生长因子（EGF）、50 ng/ml 牛垂体提取物（BPE）、30 ng/ml 霍乱毒素以及青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素，100 µg/ml 链霉素）。
- 祖细胞培养基：将四分之三体积的 DMEM 与四分之一体积的 Ham-F12 培养基混合，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.4 µg/ml 氢化可的松、0.1 nM 霍乱毒素、5 ng/ml 胰岛素、1.8 × 10-4 M 腺嘌呤、5 µg/ml 转铁蛋白、2 × 10-9 M 三碘甲腺原氨酸、10 ng/ml EGF 以及青霉素/链霉素溶液。
- 人胚胎干细胞（hES）培养基：向 400 ml DMEM/F12....
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结果
从人尿液中分离的大多数祖细胞对尿路上皮祖细胞和壁细胞标志物呈阳性，例如 CD44、CD73 和 CD146（分别为 97.37%、97.09% 和 97.3%；图 1A 和 1B）。这些细胞还表达其他间充质标志物，如 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和波形蛋白（vimentin）（图 1B）。RT-PCR 分析表明培养物中存在混合细胞群体，表现为角蛋白-7（Cytokeratin-7, CK-7）以及尿路斑蛋白（Uroplakin, UP）-Ia 和 -IIIa 表达较弱，这些是尿路上皮谱系的标志物（图 1C）。
重编程步骤的示意图见图2A。代表性图像展示了在实验流程不同时间点的细胞形态（图2B）。尿液细胞在重编程过程中从细长的II型细胞（第0天）转变为鹅卵石样形态（第4天）。到第12天时，可观察到典型的多能性克隆（iPSC），并在无饲养层条.......
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讨论
利用诱导多能干细胞（iPSCs）建立心血管疾病模型已成为研究遗传因素贡献的常用方法4-6。通过提供尿液采集等非侵入性方法，可以避免从患者（尤其是年幼儿童）获取细胞样本时存在的一些意外困难。在这一年轻患者群体中，常常难以收集到足够体积的尿液以获得足量可用于重编程的尿细胞。指导年幼患者在尿液采集前30分钟饮用液体，有助于提高尿细胞分离的成功率。然而，在该人群中可能仍需多次重复采集尿液。为了优化从杜氏肌营养不良症患者中分离和培养尿细胞（UCs）的效果，我们整合并改进了两种不同的实验方案3,7。
已从肌营养不良症患者的皮肤成纤维细胞或尿液细胞中成功生成诱导性多能干细胞1,2。然而，这两种重编程方案均依赖于慢病毒将重编程因子导入体细胞。这种整合型病毒递送方法可能存在风险，因为外源基因若随机整合至宿主基因组中，可能引发外源基因再激活或诱变（详见文献8综述）。因此，我们改进了这些技术，采用仙台病毒以非整合方式将OSKM转录因子基因导入尿液细胞9。
利用仙.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本方案的开发得到了 Advancing a Healthier Wisconsin 以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心通过资助号 8UL1TR000055 提供的支持。其内容仅由作者负责，不一定代表 NIH 的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 4 盎司带盖标本杯 | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | 用于尿液样本采集 |
| 15 ml BD-Falcon 管 | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon 管 | Fisher Scientific | 352098 | |
| 圆形玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒 | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS，pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| 青霉素-链霉素（不含谷氨酰胺） | Life Technologies | 15140-122 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875-093 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| B-27 补充剂（含胰岛素，50 倍浓缩） | Life Technologies | 17504-044 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| B-27 补充剂（不含胰岛素，50 倍浓缩） | Life Technologies | 0050129SA | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| DMEM/F12（1:1） | Life Technologies | 11330-032 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| Versene，1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| bFGF（10 µg） | Life Technologies | 13256-029 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 细胞计数器专用计数板 | Life Technologies | C10228 | |
| 无血清培养用胎牛血清（500 ml 瓶装） | Life Technologies | 10828-028 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| Recovery 细胞冻存培养基 | Life Technologies | 12648-010 | |
| 角质形成细胞-SFM（1 倍浓度，液体） | Life Technologies | 17005-042 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| DMEM，高糖，含 Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| Ham's F-12 营养混合物 | Life Technologies | 11765-054 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| EGF 重组人蛋白，液态 | Life Technologies | PHG0311L | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 胰岛素，人重组，锌溶液 | Life Technologies | 12585-014 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| ROCK 抑制剂（Y-27632） | Selleck | S1049 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | 适用于人胚胎干细胞的基质，不含 LVED |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix（2 倍浓度） | Thermo-Scientific | K1081 | |
| 经鉴定适用于细胞培养的胎牛血清（FBS-Qualified） | Sigma Aldrich | F6178 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 腺嘌呤生物试剂 | Sigma Aldrich | A2786-5G | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 霍乱弧菌来源的霍乱毒素 Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 氢化可的松 | Sigma Aldrich | H0888-1G | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 人全转铁蛋白 | Sigma Aldrich | T0665-50MG | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐 | Sigma Aldrich | T6397-100MG | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount 水性封片剂 | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% 多聚甲醛 | Alfa-Aesar | 43368 | |
| 抗体 | |||
| 小鼠抗 CD44 抗体 - FITC 标记 | BD Biosciences | 560977 | |
| 小鼠抗 CD146 抗体 - PE 标记 | BD Biosciences | 561013 | |
| 小鼠抗 CD73 抗体 - PE 标记 | BD Biosciences | 561014 | |
| 小鼠抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma Aldrich | A2547 | |
| 小鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗体 | Abcam | ab8978-100 | |
| 小鼠抗 TRA-1-81 抗体 | Life Technologies | 411100 | |
| 兔抗 Oct 3/4 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| 小鼠抗肌营养不良蛋白（Dystrophin）抗体 | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
参考文献
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
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重印与许可
