表达巢蛋白的 前体细胞是发育中小脑中一种新近发现的神经前体细胞群体。结合本文所述的显微解剖技术与荧光激活细胞分选，可有效分离该细胞群体，且不混杂其他小脑区域的污染细胞，进而可用于培养以开展后续研究。
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摘要
摘要
显微解剖是一种新型技术，可分离组织中的特定区域，并消除邻近区域细胞来源的污染。该方法首次应用于研究表达Nestin的前体细胞（NEPs），即小脑外颗粒层（EGL）中新发现的一类细胞群体。通过将显微解剖与荧光激活细胞分选（FACS）相结合，研究人员能够从EGL中传统的颗粒神经元前体细胞以及其他小脑内污染性的表达Nestin的细胞中，单独获取纯化的NEPs细胞群。若不采用显微解剖技术，利用现有方法（如Percoll梯度离心和激光捕获显微切割）将无法实现对NEPs的功能性分析。该技术还可应用于含有可识别区域或荧光标记细胞的多种组织。尤为重要的是，这种显微解剖技术的主要优势在于所分离的细胞具有活性，可进行体外培养以用于后续实验，而这一点是目前其他已描述方法所无法实现的。
引言
小脑由多个细胞层组成，每层包含不同类型的细胞。在发育过程中，外颗粒层（EGL）含有增殖的颗粒神经元前体细胞（GNPs），而分子层和浦肯野层分别含有伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元。小脑深部为白质，其中含有神经干细胞（NSCs）和少突胶质细胞1。
Sonic hedgehog（Shh）在调控小脑发育中起关键作用，特别是通过与其受体Patched（Ptc）结合，促进颗粒神经前体细胞（GNPs）的增殖，而Ptc是Shh信号通路的负向调控因子2-4。Shh信号通路的异常激活可导致髓母细胞瘤（MB）的发生，MB是儿童中最常见的恶性脑肿瘤5,6。
Ptc 突变型髓母细胞瘤（MB）转基因小鼠模型是研究髓母细胞瘤的有力工具，其产生的肿瘤与人类髓母细胞瘤相似7,8。利用这些小鼠模型，研究人员发现颗粒神经元前体细胞（GNPs）是音猬因子型（hedgehog-type）髓母细胞瘤的起源细胞7。此外，除了GNPs之外，我们最近还鉴定出在发育中的小脑外颗粒层（EGL）中存在一类独特的神经元前体细胞群体，也可发展为髓母细胞瘤。这些细胞高表达VI型中间丝蛋白Nestin，被称为NEPs9。NEPs位于EGL的深层，在新生期小脑发育过程中短暂存在。与GNPs一样，NEPs也承诺进入颗粒细胞谱系，但它们处于静息....
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方案
本方案中动物的使用已按照福克斯蔡斯癌症中心动物护理与使用委员会批准的程序进行。
1. 仪器、溶液和盖玻片的准备
- 清洁两把#5精细镊子、一把#7精细弯头镊子、一把大手术剪、一把显微解剖剪、一把刮匙和一把带孔匙。将器械放入自封式灭菌袋中并进行高压灭菌。使用前保持器械存放于灭菌袋内。
- 制备3%低熔点琼脂糖溶液。
- 将1.5 g琼脂糖加入50 ml无菌Dulbecco′将磷酸盐缓冲液（DPBS）加入烧瓶中，放入微波炉加热至出现气泡。摇动烧瓶，并继续加热直至所有琼脂糖完全溶解。若出现团块，加热前可用搅拌子搅拌溶液。
- 将溶液储存在37 °C水浴中，直至使用。
- 长期保存时，可将琼脂糖溶液于室温或 4 ℃ 保存以备后续使用 °数月内于室温保存。使用微波炉加热至融化。若需多次加热琼脂糖溶液，加热前需称量锥形瓶重量，并用温热的无菌蒸馏水补足至初始重量。
- 按照先前所述方法制备以下用于木瓜蛋白酶消化的细胞解离溶液2:
- 含木瓜蛋白酶（100 U/ml）、半胱氨酸（0.2 mg/ml）和DNase（250 U/ml）的无菌含酚红DPBS溶液
- 含酚红的无菌DPBS中含卵类粘蛋白溶液、牛血清白蛋白（BSA；8 mg/ml）、大豆胰蛋白酶抑制剂（8 mg/....
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结果
如图1A所示，小脑切片取自出生后第4天（P4）的Math1-GFP/Nestin-CFP小鼠，其中小脑外颗粒层（EGL）主要由表达GFP的颗粒神经前体细胞（GNPs）构成，而分子层则富含CFP阳性的胶质细胞。为了分离位于EGL深层的神经上皮前体细胞（NEPs），在EGL与分子层之间进行显微解剖（沿虚线；图1A）。解剖获得的EGL组织（图1B）随后被收集，进行酶消化处理，继而进行流式细胞分选（FACS）。
正如预期，分离出的外颗粒层中大部分细胞（超过85%）为常规颗粒神经前体细胞（GNPs），这些细胞GFP呈阳性（图 2A）。根据FACS分析，NEPs（CFP+）仅占EGL细胞群体的约5%。几乎未见GFP与CFP双阳性细胞。通过FACS分选的CFP+细胞被分离后进行培养 体外 以检测其分化潜能。如图所示 图2B培养4天后，NEPs仅生成β-tubulin+神经元，.......
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讨论
此处所述的显微解剖方法是首个能够分离出活细胞纯群体并用于分子与功能分析的技术。如Li所示 等9, 通过该方法获得的NEPs可进行培养并用于各种实验，且由于其纯度较高，也可用于微阵列分析。
花时间熟练掌握这种显微解剖技术非常重要。神经上皮前体细胞（NEPs）位于外颗粒层（EGL）的深层区域，紧邻分子层，而表达Nestin的伯格曼胶质细胞可能污染NEP细胞的分离，从而影响纯度。因此，显微解剖操作应谨慎进行，以确保不包含邻近组织中的污染细胞。本文所述显微解剖技术的主要优势在于能够获得可存活的细胞，用于后续培养和实验。正因如此，整个操作过程中的每一步都必须迅速完成，并尽可能将组织保持在冰上。此外，所有器械和试剂均须无菌。遵循这些步骤可减少细胞死亡和细胞培养污染。另外，将多个小脑组织固定在同一块琼脂糖凝胶块上，有助于缩短操作时间。
该技术不仅限于NEPs的分离，还可用于收集小脑其他区域的细胞，例如分子层中的胶质细胞以及白质中的神经干细胞。除了小脑之外，显微解剖技.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 James Oesterling 在流式细胞术方面的协助。本研究得到了美国国家癌症研究所资助（R01-CA178380，Z.Y.）以及美国国立卫生研究院博士后培训资助（5T32CA009035-37，L.W.Y.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| 超纯低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
参考文献
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-11....
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