表达巢蛋白的 前体细胞是发育中小脑中一种新近发现的神经前体细胞群体。结合本文所述的显微解剖技术与荧光激活细胞分选，可有效分离该细胞群体，且不混杂其他小脑区域的污染细胞，进而可用于培养以开展后续研究。
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摘要
摘要
显微解剖是一种新型技术，可分离组织中的特定区域，并消除邻近区域细胞来源的污染。该方法首次应用于研究表达Nestin的前体细胞（NEPs），即小脑外颗粒层（EGL）中新发现的一类细胞群体。通过将显微解剖与荧光激活细胞分选（FACS）相结合，研究人员能够从EGL中传统的颗粒神经元前体细胞以及其他小脑内污染性的表达Nestin的细胞中，单独获取纯化的NEPs细胞群。若不采用显微解剖技术，利用现有方法（如Percoll梯度离心和激光捕获显微切割）将无法实现对NEPs的功能性分析。该技术还可应用于含有可识别区域或荧光标记细胞的多种组织。尤为重要的是，这种显微解剖技术的主要优势在于所分离的细胞具有活性，可进行体外培养以用于后续实验，而这一点是目前其他已描述方法所无法实现的。
引言
小脑由多个细胞层组成，每层包含不同类型的细胞。在发育过程中，外颗粒层（EGL）含有增殖的颗粒神经元前体细胞（GNPs），而分子层和浦肯野层分别含有伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元。小脑深部为白质，其中含有神经干细胞（NSCs）和少突胶质细胞1。
Sonic hedgehog（Shh）在调控小脑发育中起关键作用，特别是通过与其受体Patched（Ptc）结合，促进颗粒神经前体细胞（GNPs）的增殖，而Ptc是Shh信号通路的负向调控因子2-4。Shh信号通路的异常激活可导致髓母细胞瘤（MB）的发生，MB是儿童中最常见的恶性脑肿瘤5,6。
Ptc 突变型髓母细胞瘤（MB）转基因小鼠模型是研究髓母细胞瘤的有力工具，其产生的肿瘤与人类髓母细胞瘤相似7,8。利用这些小鼠模型，研究人员发现颗粒神经元前体细胞（GNPs）是音猬因子型（hedgehog-type）髓母细胞瘤的起源细胞7。此外，除了GNPs之外，我们最近还鉴定出在发育中的小脑外颗粒层（EGL）中存在一类独特的神经元前体细胞群体，也可发展为髓母细胞瘤。这些细胞高表达VI型中间丝蛋白Nestin，被称为NEPs9。NEPs位于EGL的深层，在新生期小脑发育过程中短暂存在。与GNPs一样，NEPs也承诺进入颗粒细胞谱系，但它们处于静息状态，且不表达Math1——这是传统GNPs的一个明确标志物10。此外，在Shh信号通路激活后，NEPs比GNPs更高效地产生髓母细胞瘤9，这使其成为髓母细胞瘤发生的一种新起源。
我们此前通过本文所述的显微解剖技术，在出生后第4天（P4）从小脑外颗粒层（EGL）分离出了神经上皮前体细胞（NEPs）9。通过显微镜直接观察组织进行显微解剖，可特异性地分离小脑EGL。这一步骤至关重要，因为Nestin也在小脑白质中的神经干细胞（NSCs）以及分子层中的伯格曼胶质细胞（Bergmann glia）中表达1,7,11,12，必须避免这些细胞的混入，否则将干扰后续分析。从显微解剖组织中分离得到的细胞可立即用于分子分析，也可进行培养以用于后续实验应用。
为了特异性地显微解剖外颗粒层（EGL）并进一步纯化神经上皮前体细胞（NEPs），将Math1-GFP（绿色荧光蛋白）小鼠与Nestin-CFP（青色荧光蛋白）小鼠杂交。转录因子Math1在颗粒神经元前体细胞（GNPs）中特异性表达，GFP的表达在外颗粒层中清晰可见9,13。Nestin-CFP小鼠表达一种核定位的CFP，在分子层中易于观察9,14。GFP与CFP的共同表达为外颗粒层的显微解剖提供了明确的边界（见图1）。随后，对解剖获得的EGL组织进行酶解离，再通过流式细胞分选（FACS）分离出CFP阳性的NEPs。
目前，从外颗粒层（EGL）中分离细胞最常用的方法是使用Percoll梯度离心法处理整个小脑组织15,16。然而，该方法无法完全排除分子层和白质中的Nestin+细胞群体，因此不能用于神经上皮前体细胞（NEPs）的研究。激光显微切割技术通过激光能量转移来获取特定细胞，是另一种用于从异质组织中分离特定细胞的方法17,18，但所捕获的细胞仅可用于DNA、RNA和蛋白质的提取，无法进行培养。
本方案提供了一种从外颗粒层（EGL）中特异性分离活的、纯的神经上皮前体细胞（NEPs）群体的方法。该技术也可应用于具有可识别解剖结构或荧光标记细胞/区域的不同组织类型。因此，将这种新型显微解剖技术整合到细胞分离方案中的主要优势在于，能够从特定组织区域分离细胞，从而消除邻近组织的污染，并可立即收集细胞用于分析，或进行培养以用于其他应用。
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方案
本方案中动物的使用已按照福克斯蔡斯癌症中心动物护理与使用委员会批准的程序进行。
1. 仪器、溶液和盖玻片的准备
- 清洁两把#5精细镊子、一把#7精细弯头镊子、一把大手术剪、一把显微解剖剪、一把刮匙和一把带孔匙。将器械放入自封式灭菌袋中并进行高压灭菌。使用前保持器械存放于灭菌袋内。
- 制备3%低熔点琼脂糖溶液。
- 将1.5 g琼脂糖加入50 ml无菌Dulbecco′将磷酸盐缓冲液（DPBS）加入烧瓶中，放入微波炉加热至出现气泡。摇动烧瓶，并继续加热直至所有琼脂糖完全溶解。若出现团块，加热前可用搅拌子搅拌溶液。
- 将溶液储存在37 °C水浴中，直至使用。
- 长期保存时，可将琼脂糖溶液于室温或 4 ℃ 保存以备后续使用 °数月内于室温保存。使用微波炉加热至融化。若需多次加热琼脂糖溶液，加热前需称量锥形瓶重量，并用温热的无菌蒸馏水补足至初始重量。
- 按照先前所述方法制备以下用于木瓜蛋白酶消化的细胞解离溶液2:
- 含木瓜蛋白酶（100 U/ml）、半胱氨酸（0.2 mg/ml）和DNase（250 U/ml）的无菌含酚红DPBS溶液
- 含酚红的无菌DPBS中含卵类粘蛋白溶液、牛血清白蛋白（BSA；8 mg/ml）、大豆胰蛋白酶抑制剂（8 mg/ml）和DNase（250 U/ml）。
将两种溶液均通过滤器除菌，并调节pH值，使含酚红的DPBS恢复至原始颜色。
- 制备细胞培养基（NB/B27）：在基础培养基中添加1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素（P/S）和B27添加剂。过滤除菌，避光保存。将培养基在37℃预平衡 °C 和 5% CO₂2 使用前
- 配制FACS缓冲液：将5%胎牛血清（FBS）加入DPBS中。向47.5 ml DPBS中加入2.5 ml FBS。
- 准备经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片。
- 高压灭菌新的玻璃盖玻片。
- 用PDL（100）包被盖玻片 μg/ml 溶于无菌蒸馏水中），37℃孵育 2 小时 °室温过夜。
- 用无菌蒸馏水清洗盖玻片，再用无菌蒸馏水洗涤一次 NB/B27 培养基。使用前将盖玻片在组织培养罩内彻底晾干。
2. 组织切片的解剖与制备
- 解剖当天，用70%乙醇擦拭解剖区域，并铺上吸水垫。
- 从灭菌袋中取出解剖工具。在小型培养皿中加入冰冻的无菌DPBS/1% P/S，并置于冰上。
- 使用大型手术剪剪下P4 Math1-GFP/Nestin-CFP 小鼠幼崽的头部，然后用精细弯镊固定头部。用#5精细镊子剥离皮肤并轻轻移除颅骨，再用刮勺从颅骨中取出脑组织，转移至含有DPBS/1% P/S的培养皿中。
- 使用#5精细镊子，小心地将小脑与脑的其余部分分离。务必一次快速解剖一只幼鼠。
- 至少收集8个小脑，以获得足够的NEPs用于分子和功能分析。
- 用3%低熔点琼脂糖溶液填充一个尺寸为2 x 2 x 2 cm的包埋模。确保琼脂糖温度不超过37 °C。
- 用实验纸巾轻轻吸去小脑表面多余液体。将小脑垂直放入包埋模中，并将模具置于冰上使其快速凝固。每个包埋块使用约4个小脑。
- 使用振动切片机获取活体组织切片。用刀片修整含小脑的琼脂糖块。将琼脂糖块（小脑保持垂直方向）用胶固定在振动切片机的载物板上。
- 在振动切片机的托盘中加入冰冻的无菌DPBS/1% P/S，并在托盘下方放置冰块。
- 对整个小脑进行600 μm厚度的切片。使用带孔的勺子从冰托盘中收集切片，并将切片置于盛有DPBS/1% P/S并置于冰上的培养皿中。
3. 显微解剖与细胞分离
- 将含有组织切片的培养皿置于荧光解剖显微镜下。
- 使用精细镊子小心地将外颗粒层（EGL）从其余的小脑切片中分离，解剖位置位于CFP+分子层与GFP+外颗粒层之间（参见图1中的虚线）。注意避免带入任何分子层部分，否则会导致表达Nestin的伯格曼胶质细胞污染。
- 此步骤应尽快完成，并将组织保持在冰上，以防止细胞死亡。
- 在进入下一步之前，去除组织周围的琼脂糖。
- 采用基于木瓜蛋白酶的消化方案（如先前所述2）消化显微解剖获得的EGL组织，以得到单细胞悬液。
- 将细胞重悬于FACS缓冲液中，用于通过流式细胞分选（FACS）收集CFP阳性细胞。
4. 细胞分选与铺板
- 使用无菌的高速流式细胞仪（配备适当的CFP滤光片），根据CFP荧光对细胞进行分选，并将细胞收集于冰上的FACS缓冲液中。从每个P4小脑中获取约100,000个NEPs。
- 以300 × g离心5分钟。立即用于分子分析或培养以进行后续实验。
- 如需培养细胞，将细胞重悬于预热的NB/B27培养基中，并接种至PDL包被的盖玻片上，具体方法如前所述2。
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结果
如图1A所示，小脑切片取自出生后第4天（P4）的Math1-GFP/Nestin-CFP小鼠，其中小脑外颗粒层（EGL）主要由表达GFP的颗粒神经前体细胞（GNPs）构成，而分子层则富含CFP阳性的胶质细胞。为了分离位于EGL深层的神经上皮前体细胞（NEPs），在EGL与分子层之间进行显微解剖（沿虚线；图1A）。解剖获得的EGL组织（图1B）随后被收集，进行酶消化处理，继而进行流式细胞分选（FACS）。
正如预期，分离出的外颗粒层中大部分细胞（超过85%）为常规颗粒神经前体细胞（GNPs），这些细胞GFP呈阳性（图 2A）。根据FACS分析，NEPs（CFP+）仅占EGL细胞群体的约5%。几乎未见GFP与CFP双阳性细胞。通过FACS分选的CFP+细胞被分离后进行培养 体外 以检测其分化潜能。如图所示 图2B培养4天后，NEPs仅生成β-tubulin+神经元，...
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讨论
此处所述的显微解剖方法是首个能够分离出活细胞纯群体并用于分子与功能分析的技术。如Li所示 等9, 通过该方法获得的NEPs可进行培养并用于各种实验，且由于其纯度较高，也可用于微阵列分析。
花时间熟练掌握这种显微解剖技术非常重要。神经上皮前体细胞（NEPs）位于外颗粒层（EGL）的深层区域，紧邻分子层，而表达Nestin的伯格曼胶质细胞可能污染NEP细胞的分离，从而影响纯度。因此，显微解剖操作应谨慎进行，以确保不包含邻近组织中的污染细胞。本文所述显微解剖技术的主要优势在于能够获得可存活的细胞，用于后续培养和实验。正因如此，整个操作过程中的每一步都必须迅速完成，并尽可能将组织保持在冰上。此外，所有器械和试剂均须无菌。遵循这些步骤可减少细胞死亡和细胞培养污染。另外，将多个小脑组织固定在同一块琼脂糖凝胶块上，有助于缩短操作时间。
该技术不仅限于NEPs的分离，还可用于收集小脑其他区域的细胞，例如分子层中的胶质细胞以及白质中的神经干细胞。除了小脑之外，显微解剖技...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 James Oesterling 在流式细胞术方面的协助。本研究得到了美国国家癌症研究所资助（R01-CA178380，Z.Y.）以及美国国立卫生研究院博士后培训资助（5T32CA009035-37，L.W.Y.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| 超纯低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
参考文献
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重印与许可
