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舌下免疫疗法作为诱导抵抗急性呼吸道感染的替代方法

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DOI：

10.3791/52036

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2014年8月30日

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1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

本文内容

摘要

本研究展示了使用舌下免疫疗法可增强小鼠肺部的先天免疫反应，并对急性肺炎链球菌性肺炎提供保护作用的便利性。

摘要

舌下途径已被广泛用于将小分子递送入血液，并在不同部位调节免疫反应。研究表明，该途径可有效在全身及黏膜部位（如肺部和泌尿生殖道）诱导体液和细胞免疫应答。舌下疫苗接种可提供针对上下呼吸道感染的保护作用，同时还能促进对过敏原的耐受性，并改善哮喘症状。与经鼻直接给药相比，通过舌下免疫疗法（SLIT）调节肺部免疫反应更为安全，因其无需将潜在有害的分子直接递送至气道。与经鼻给药不同，SLIT不会引发涉及脑毒性或面部麻痹等副作用。目前，SLIT背后的免疫机制尚不明确，其在急性肺部感染治疗中的应用也尚未被探索。因此，建立合适的SLIT动物模型，对于进一步研究其潜在优势十分必要。

本研究展示了如何在小鼠中进行舌下给药以评估治疗剂预防急性肺炎链球菌性肺炎的能力。文中图示了舌下接种过程中小鼠操作的技术细节、舌下黏膜的准确定位、引流淋巴结的识别与组织分离、支气管肺泡灌洗及肺组织获取的方法。同时详细描述了用于流式细胞术分析的单细胞悬液制备方案，并讨论了免疫应答分析的其他后续应用。文末还介绍了相关技术操作的准备步骤。 肺炎链球菌 还解释了接种物的制备以及小鼠的鼻内攻击方法。

舌下免疫疗法（SLIT）是一种简单的方法，可用于筛选能够调节肺部免疫反应的候选分子。影响SLIT成功的关键参数包括分子大小、对降解的敏感性以及高浓度制剂的稳定性。

引言

本研究的总体目标是阐明舌下免疫疗法在治疗急性呼吸道感染（ARI）中的优势，并展示该给药途径相较于其他给药方式（特别是鼻内给药）所具有的优点。

急性呼吸道感染（ARI）每年导致数百万人死亡，尤其在五岁以下儿童中更为严重。Streptococcus pneumoniae 仍是婴幼儿和老年人细菌性肺炎的主要致病菌之一1,2。目前，主要的治疗手段依赖抗生素，但耐药菌株不断出现3,4。

舌下免疫治疗（SLIT）可在全身和黏膜层面诱导广泛的免疫应答，尤其在呼吸道部位5。其对抗流感病毒感染已被证实有效，可诱导体液和细胞免疫应答，实现长期保护6,7。此外，已有研究表明，通过舌下途径给予细菌裂解物进行预防性治疗，可减少老年患者慢性阻塞性支气管炎的急性加重8，并预防儿童反复发生的呼吸道感染9。SLIT已广泛用于过敏性疾病和哮喘的治疗。临床研究不仅证实了其在调节呼吸道免疫应答方面的有效性，也验证了其安全性10。尽管制药企业和科研人员对SLIT的兴趣日益增长，但化合物经舌下递送后诱导黏膜免疫应答的具体机制仍不明确。近期研究关注于与变应原脱敏相关的免疫耐受机制。有研究提出，舌下黏膜部位的常驻细胞及募集的细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）可能在SLIT后促进免疫耐受的形成11-13。口腔黏膜的树突状细胞可促进产生干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-10（IL-10）的辅助性T细胞11，并可迁移至远端生殖道黏膜，促进CD8+ T细胞的应答14。然而，目前对SLIT在固有免疫细胞中的作用，以及其在急性呼吸道感染期间增强病原体清除能力方面的潜力仍知之甚少。

肺部对肺炎链球菌感染的自然控制在很大程度上依赖于局部先天免疫防御的高效和快速激活。我们先前研究表明，通过单次鼻内给予鞭毛蛋白（FliC，一种TLR5和NLRC4激动剂）增强肺部先天免疫，可保护75-100%的小鼠免于致死剂量的1型Streptococcus pneumoniae临床分离株攻击。这种保护作用依赖于局部GR1+细胞（可能是多形核中性粒细胞，PMNs）的募集，而不依赖于抗体、B细胞或T细胞15。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的结构组分。在其单体形式下，可被两种病原体识别受体（PRR）识别：TLR5识别胞外FliC16，NLRC4/NAIP5炎性小体则识别胞内鞭毛蛋白17,18。当PRR识别FliC后，会触发重要的炎症反应。我们及其他研究团队已证实，将来自鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）的纯化FliC滴注至肺部时，可迅速诱导趋化因子和细胞因子的产生，尤其是当肺上皮细胞识别FliC后，会进一步协调免疫细胞向气道募集，主要是中性粒细胞（PMNs）15,19-21。尽管这种反应是短暂的，但经鼻给予FliC后气道内出现的显著中性粒细胞浸润，若用于人类临床治疗，可能引发关注。过度的炎症反应可能损害肺功能。此外，已有研究表明，经鼻递送免疫刺激分子可能导致面部麻痹和/或脑毒性22-24。

与鼻内途径相比，舌下免疫疗法为调节呼吸道免疫反应提供了一种更安全的替代方案。该方法无创、无痛、操作简便，且患者依从性良好25。此外，如前所述，它可在呼吸道黏膜诱导保护性免疫反应，同时避免了制剂直接经鼻内或肺内递送所带来的相关风险。舌下途径还可用于递送某些对肺部免疫系统具有显著作用的分子，这些分子若经鼻内给药已被证实具有毒性或可引发显著炎症反应。除上述优势外，由于舌下免疫疗法无需无菌制剂，且不会引起内毒素休克，因此其生产成本较低。然而值得注意的是，与鼻内或全身给药途径相比，为在肺部诱导免疫反应，舌下途径需要使用更高剂量的免疫刺激化合物；同时，在小鼠舌下免疫模型中，由于制剂沉积部位的解剖空间较小，还需使用高浓度的溶液。

根据我们先前发表的数据，我们建立了一种以鞭毛蛋白作为模型免疫刺激剂的舌下免疫治疗保护模型。我们证明，单剂量的鞭毛蛋白可使动物对血清型1菌株引起的侵袭性肺炎链球菌肺炎产生60%的存活率，而对照组小鼠均在感染后5天内死亡。流式细胞术分析显示，在接受舌下鞭毛蛋白治疗后，受保护动物气道中招募的中性粒细胞（PMN）数量显著增加，提示这些细胞可能参与了舌下免疫治疗所诱导的保护机制。

本视频详细展示了如何进行舌下免疫治疗，以及如何获取舌下黏膜、引流淋巴结、肺和气道等关键组织以进行后续分析。此外，还介绍了用于FACS分析的细胞制备通用技术，并简要演示了如何制备Streptococcus pneumoniae菌液以及如何通过鼻内感染小鼠建立急性感染模型。

方案

涉及动物的实验操作均依照乌拉圭共和国大学医学院荣誉动物实验伦理委员会及管理委员会批准的协议编号 N° 071140-000821-12 和 08052010 进行。

1. 治疗剂的舌下给药

  1. 配制待测试的治疗剂溶液。调整浓度，使每只小鼠给药体积不超过 10 µl。
    注意：对于来自伤寒沙门菌（Salmonella enterica）鼠伤寒血清型的纯化鞭毛蛋白，其在感染第一致死剂量肺炎链球菌（S. pneumoniae）1 型 E1586（导致 100% 死亡率）的小鼠模型中诱导保护作用的最佳剂量为每只小鼠 10 µg。鞭毛蛋白溶液必须在 65 °C 加热 5 分钟，以确保单体释放。有关鞭毛蛋白纯化的更多信息，请参见参考文献26。
    1. 根据不同的免疫调节剂的分子大小、纯度、对蛋白水解的敏感性以及是否使用黏膜黏附剂，调整其有效浓度。针对每种待测试化合物优化其浓度以最大化其效应。若某种化合物已有经鼻途径给药的前期研究，可采用比鼻内给药高 5 至 10 倍的起始剂量，以测试其舌下给药的疗效。
  2. 通过腹腔注射含 110 mg/kg 氯胺酮和 5.5 mg/kg 赛拉嗪的混合麻醉剂使小鼠麻醉，并让动物静置 7 至 10 分钟。
  3. 轻轻按压小鼠后肢足垫以确认麻醉效果；若麻醉充分，动物对刺激无反应且不移动。
  4. 在每只小鼠眼睛上涂抹一层薄薄的眼科软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
    注意：若有配备诱导室和鼻罩的设备，也可使用异氟烷等吸入性麻醉剂替代氯胺酮/赛拉嗪。使用诱导室对动物进行麻醉，并通过舌下途径给予免疫刺激剂。立即将动物连接至鼻罩，持续至少 15 分钟以维持麻醉状态，防止吞咽，促进治疗化合物的吸收。
  5. 用移液器吸取含有免疫刺激剂或对照载体溶液；用非优势手的拇指和食指抓取小鼠，并使其保持垂直体位。
  6. 用优势手将一对闭合的镊子置于舌下，用中指和无名指固定镊子位置，然后轻微张开镊子以抬起舌头。
  7. 持移液器将溶液滴加至口腔底部及舌背侧。
  8. 移除镊子，让小鼠静置 3 至 5 分钟后再放回笼中。为确保麻醉小鼠维持正常体温，将笼子连接至笼式加热系统。若无此类设备，可将同一处理组的小鼠放回同一笼中，彼此紧靠置于垫料上，并用干净的纸巾部分覆盖，以帮助其维持体温。
  9. 在给予免疫调节剂后的任意时间点采集组织样本，以分析治疗所诱导的细胞群体变化。
    注意：在本实验方案中，鞭毛蛋白给药时间为攻毒前 2 小时。应针对每种特定的治疗剂和病原体，确定最佳的给药与攻毒时间间隔。

2. 细菌悬液的制备及经鼻攻毒 肺炎链球菌

注意：S. pneumoniae 是一种天然的人类病原体，可引起侵袭性肺炎、败血症和脑膜炎等危及生命的疾病。当吸入或接触黏膜时，可能发生传播。因此，所有可能接触过 S. pneumoniae 的样本必须在适当的生物安全二级（BSL-2）设施中，使用二级生物安全柜进行操作。请查阅您所在机构关于处理二类病原体的标准操作程序，了解适用的防护服、废物处理及其他安全措施。感染动物应饲养在配备高效颗粒空气（HEPA）过滤器的隔离器中的独立通风笼具内。目前已有抗肺炎链球菌疫苗和抗生素治疗方案。更多信息请参见参考文献27 和 1。

  1. 解冻一份已知细菌CFU数的工作储备液，该储备液为按文献15所述方法制备的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）分装液。
  2. 在室温下以2,500 × g离心5分钟。
  3. 弃去上清液，并通过将菌体沉淀重悬于1 ml无菌生理盐水中进行洗涤。在制备细菌悬液、稀释液或动物攻毒时，应使用带滤膜的吸头。
  4. 再次按照步骤2.2所述条件进行离心。
  5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于适当体积的无菌生理盐水中，以获得每50 µl含4×105 CFU的菌悬液。此剂量对应于血清型1 E1586株肺炎链球菌（S. pneumoniae）在BALB/c小鼠中引起100%死亡率的最低细菌剂量，依据先前研究结果15确定。
    注意：在建立小鼠肺炎链球菌性肺炎模型时，必须针对每一种特定的细菌菌株、血清型与小鼠品系组合确定引起100%死亡率的最低细菌剂量。
  6. 通过涡旋振荡或上下吹打5次使细菌悬液充分混匀。
  7. 使用无菌带滤膜吸头吸取50 µl细菌悬液，并将全部体积滴入麻醉小鼠的鼻孔中。保持小鼠直立姿势2分钟，随后让其仰卧休息2分钟。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，然后将其放回笼中；麻醉期间需确保维持正常体温。
    注意：本研究中采用50 µl攻毒体积，以确保至少90%的总CFU被递送至肺部，该数据依据先前研究15,28确定。为减少动物不适，可使用较小体积（例如，20 µl）。然而，必须验证细菌向肺部的有效递送情况；可通过攻毒后5分钟处死动物取肺组织，制备肺匀浆后进行系列稀释并接种于血琼脂平板，计数CFU来完成验证。
  8. 通过将菌液进行10倍系列稀释后接种至血琼脂平板，确认用于感染的细菌悬液中的CFU数量。在37 °C、5% CO2条件下过夜培养，计数呈现α-溶血特征性绿色晕环的黏液型菌落。

3. 组织采集及用于流式细胞术（FACS）分析的样本制备

3.1）组织采集

  1. 通过颈椎脱位或使用 CO2 室处死动物；切开胸腔直至颈部，并沿前肢做切口，暴露颈部腹侧及下颌下区域。
  2. 用细尖弯镊轻轻提起唾液腺及邻近软组织，暴露口腔底部的背侧。使用弯头细尖镊子，轻柔提起下颌淋巴结及副下颌淋巴结，将其放入含有完全 RPMI 培养基（cRPMI，500 ml 中含 10% 胎牛血清、5 ml 青霉素溶液（10,000 U/ml）和 10 mg/ml 链霉素溶液，以及 5 ml L-谷氨酰胺（200 mM））的离心管中，或根据后续实验步骤放入核酸保存液中。
  3. 为打开胸腔，先在膈肌处做切口；用鼠齿镊夹住胸骨的剑突软骨，从假肋开始，沿背部两侧小心剪开肋骨，直至真肋与胸骨柄连接处。
  4. 用镊子夹住胸骨的剑突软骨，轻柔上提，以暴露胸腔内的器官。
  5. 剪断第一对肋骨和锁骨，完全移除肋骨。胸腺将呈现为位于胸腔前腹侧、靠近心脏基底部的白色双叶状结构。
  6. 用镊子夹住其中一个叶，用剪刀切断其下表面与心包之间的韧带，移除该叶；随后以同样方法移除第二个叶。
  7. 识别腹腔，沿肌肉壁的中线轴做切口打开腹腔以暴露器官。用镊子剪断后腔静脉和胸主动脉，用吸水纸去除多余血液。
  8. 为分析肺泡中常驻及浸润的细胞群体，进行支气管肺泡灌洗（BAL）。切开颈部腹侧的肌肉以暴露气管和食管；通过在结构的侧面和背侧做切口，将其分离。
  9. 用镊子提起气管，用手术刀做一小切口，插入一支装有 1 ml 不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 缓冲液（含 1 mM EDTA）的细尖移液器。反复灌注并抽吸至少三次；将细胞悬液抽吸后转移至无菌 1.5 ml 离心管中，并置于冰上。
  10. 为分析肺实质中的细胞群体，首先通过向右心室注射 5 ml 不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 缓冲液（含 1 mM EDTA）进行肺灌注。
    注意：此步骤可清除肺血管中大部分红细胞和免疫细胞。若灌注操作正确，肺组织颜色将由粉红色变为白色。
  11. 用镊子夹住左心室基底部，将心脏与肺分离，并用剪刀小心剪断血管，完全移除心脏。取出已灌注的肺组织，根据后续分析需求，将其放入 cRPMI 或核酸保存液中。
  12. 为分析舌下黏膜中的细胞群体，分离动物头部，若尚未在步骤 3.2.1 中完成，则移除唾液腺及邻近软组织。
  13. 在口腔两侧做切口，直至下颌关节处，分离下颌连同舌头和口腔底部，并用大头针将其固定在解剖板上。上提舌头，用手术刀在舌根与口腔底部连接处做切口，延伸至第三磨牙，以暴露舌下黏膜。
  14. 完全移除舌头；取一个 0.5 mm 的活检打孔器，将其置于下门牙旁，从舌下组织的牙龈附着处开始，轻压直至完全切出口腔底部组织。
  15. 再重复一次，将活检打孔器置于靠近第三磨牙的位置，以完成舌下组织的完全切除。将组织放入含有 cRPMI 或核酸保存液的洁净离心管中。

3.2）FACS 分析的样品制备。

  1. 将每只小鼠分离的肺组织转移至24孔板中，用干净的剪刀剪碎，直至获得约2 mm大小的组织小块。每孔加入1 ml消化液，消化液含30 mg II型胶原酶、50 µg DNA酶I溶于1 ml不含FBS的RPMI培养基中。用移液器吹打5次，于37 °C、5% CO2条件下孵育40分钟。
    1. 如需分析舌下组织中的细胞群体，将3.2.1步骤中的消化液替换为含2单位Dispase、30 mg II型胶原酶、50 µg DNA酶I溶于1 ml RPMI的消化液。将一只小鼠采集的组织置于500 µl消化液中，于37 °C、50 rpm的摇床中孵育20分钟。
  2. 孵育结束后，用移液器吹打最多10次或30秒，直至大部分组织被分散。将细胞悬液通过40 µm无菌细胞筛过滤，并用5 ml含5 mM EDTA的PBS洗涤。
    注意：细胞外基质和纤维组织无法完全消化。然而，不建议延长胶原酶和/或Dispase的孵育时间或进行剧烈吹打，因为这会导致细胞死亡增加以及细胞外蛋白的破坏，从而影响FACS分析的整体结果。
  3. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。
    1. 如需分析支气管肺泡灌洗液（BAL）中的细胞群体，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，然后继续进行步骤3.2.4。
    2. 如需分析淋巴结中的细胞群体，将70 µm细胞筛置于无菌培养皿上，将淋巴结与1 ml cRPMI一同放入筛中。取出一支2 ml无菌注射器的推杆，用作研杵，在筛网表面研磨淋巴结。用1 ml新鲜cRPMI冲洗细胞筛，并将培养皿中的细胞转移至无菌离心管中。
  4. 取每份样品的代表性等分试样，加入台盼蓝染色，以确定活细胞数量。
  5. 将细胞重悬于FACS-EDTA缓冲液（PBS含5 mM EDTA和1%牛血清白蛋白）中，配制成浓度为2×107个细胞/ml的细胞悬液，并向流式管中加入50 µl。
  6. 根据所用流式细胞仪的配置，配制含有适当组合的表面标志物抗体和荧光染料的2倍浓度抗体混合液。向每管细胞悬液中加入50 µl 2倍浓度抗体混合液。
    注意：应滴定每种荧光标记抗体以确定最佳使用量，详细方案请参见参考文献29。
  7. 在冰上避光孵育30分钟。
  8. 用3 ml FACS-EDTA缓冲液洗涤一次，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于200 µl相同缓冲液中，随后在流式细胞仪上进行分析。
    注意：若处理大量样本，上述FACS分析染色方案可在U型底96孔板中进行，而非使用流式管。但若使用96孔板，洗涤步骤需加入最多200 µl FACS-EDTA缓冲液，并重复4次，每次洗涤之间在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
  9. 此时，可将样本固定，以便后续在流式细胞仪上分析（固定后最多可保存72小时）。
    1. 固定细胞时，先用不含Ca2+/Mg2+、含1 mM EDTA且不含FBS的PBS洗涤已标记FACS抗体的细胞。将细胞重悬于50 µl相同缓冲液中，然后加入50 µl新配制的4%多聚甲醛溶液（溶于高渗（2X）PBS，不含Ca2+/Mg2+）。
    2. 室温孵育20分钟，然后用FACS-EDTA缓冲液洗涤3次。
    3. 将细胞重悬于200 µl FACS-EDTA缓冲液中，于4 °C避光保存，最多可保存72小时。
      注意：固定可能影响FSC-SSC信号。若对样本进行固定，请核查荧光标记抗体与固定剂的兼容性，因为串联染料在固定剂存在下可能降解。若样本来源于感染动物，强烈建议进行固定，以确保在流式细胞仪检测过程中不会存在活病原体，因为在样本采集过程中可能产生微气溶胶。

4. 总RNA提取、cDNA合成和实时PCR。

4.1）RNA 提取与 cDNA 合成。

  1. 使用所选的核酸保存溶液通过机械破碎法（例如，采用转子-定子匀浆器、高速振荡组织破碎仪与珠子等）对组织进行匀浆。在 4 °C 条件下以 12,600 × g 离心 15 分钟，以去除组织碎片。将上清液转移至洁净离心管中。
  2. 根据制造商说明书选择合适的方法提取 RNA。
    注意：RNA 极易降解，若提取后不能立即使用，请分装成小份，置于无 RNA 酶的离心管中，并于 -80 °C 保存。避免反复冻融。操作过程中必须始终佩戴手套。样品解冻后应立即置于冰上保存。
  3. 测定核酸在 260 nm 处的吸光度，并计算其浓度（单位：µg/µl）。
  4. 配制 DNA 酶 I 反应混合液（每份样品）：加入 7.6 µl 超纯水、1 µl 10× DNA 酶 I 缓冲液、0.4 µl DNA 酶 I（扩增级）原液（1 U/µl），然后向每份含有 1 µg 总 RNA 的样品中加入 8.4 µl DNA 酶 I 混合液。
    1. 使用浓度为 1 µg/µl 的 RNA，加入 1 µl 总 RNA 作为模板进行逆转录反应（RT-PCR）。若样品浓度过低，可增加总 RNA 的加入体积以替代部分水体积。但加入的 RNA 体积不得超过最终反应体系的 20%；尤其当所选 RNA 提取方法涉及苯酚-氯仿抽提时，残留苯酚可能影响 RT-PCR 产率，因此需特别注意。
  5. 室温孵育 15 分钟，随后在 4 °C 或冰上孵育 10 分钟。（切勿超过孵育时间！！）
  6. 向每管中加入 1 µl 25 mM EDTA（分子生物学级），于 65 °C 孵育 10 分钟以灭活 DNA 酶 I。
  7. 配制逆转录（RT）反应混合液如下（每反应体系）：0.2 mg/ml 随机六聚体引物原液 1 µl、10 mM dNTPs 原液 1 µl、5× M-MLV-RT 缓冲液 4 µl、0.1 M DTT 2 µl、40 U/µl RNA 酶抑制剂（RNAse OUT）原液 1 µl、200 U/µl M-MLV 逆转录酶原液 1 µl。
  8. 向 10 µl DNA 酶 I 反应体系中加入 10 µl RT-PCR 混合液。
  9. 在热循环仪中按照以下程序进行 PCR 反应：
    1 个循环：25 °C 孵育 10 分钟；37 °C 孵育 50 分钟；70 °C 孵育 15 分钟
  10. 通过加入 80 µl 超纯水将 cDNA 稀释至原体积的 1/5。储存于 -20 °C。

4.2）实时 PCR（qPCR）。

  1. 按照以下方法配制qPCR反应体系（每个反应）：5 µl 含有Taq DNA聚合酶、SYBR Green染料、PCR缓冲液、dNTP混合物和MgCl2的预混液（见下文4.2.2）；0.9 µl 10 µM的正向引物储备液，0.9 µl 10 µM的反向引物储备液，1.2 µl 超纯水，以及2 µl 按步骤4.1.10所述预先稀释的cDNA模板。
    注意：本节所用试剂浓度和扩增程序已针对“材料与试剂表”中列出的特定试剂和仪器进行优化；若使用其他品牌试剂，反应体积、试剂浓度和扩增程序可能有所不同。在进行RT-qPCR前，请查阅试剂生产商的使用说明。
  2. 设置qPCR仪器程序如下：
    1个循环：95 °C，15分钟
    40个循环：95 °C，15秒，随后60 °C，1分钟（在此阶段采集荧光信号）。
    注意：根据Ct法30进行mRNA相对定量时，必须选择一个参考基因用于Ct值的标准化。所选参考基因需在特定实验条件下进行验证，因其表达水平可能发生变化；Actb、Gapdh 或 18S 是常被选作参考的基因。
  3. 设定阈值并分析数据。

结果

舌下免疫治疗可成功用于调节肺部的免疫反应。我们发现，与生理盐水处理的对照组相比，单次给予鞭毛蛋白（TLR5 和 NLRC4 的激动剂）即可显著上调编码趋化因子 CXCL1、CCL20 及细胞因子 IL-6 的 mRNA 表达水平。mRNA 水平的倍数诱导在舌下免疫治疗（SLIT）后 8 小时达到峰值，并在 20 小时后恢复至基础水平（图 1）。然而，当在鼻内感染 S. pneumoniae 前 2 小时进行 SLIT 时，与未处理动物相比，Cxcl1 和 Il6 mRNA 水平在 SLIT 后 24 小时仍保持显著上调（图 2）。

通过FACS对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中的细胞群体进行分析表明，经舌下途径给予FliC处理的动物其气道中中性粒细胞数量增加，但在肺组织中未见增加（图3）。

最后，比较了先前通过舌下途径给予FliC或以生理盐水作为对照处理的动物在肺炎链球菌攻击后的存活情况。如图4所示，使用鞭毛蛋白进行舌下免疫治疗（SLIT）可提供保护作用，并提高对急性肺炎链球菌性肺炎的存活率。

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图 1. 舌下免疫治疗使用鞭毛蛋白后肺部转录谱的动力学变化。 8至10周龄的BALB/c小鼠（n=4）在麻醉状态下通过舌下途径给予10 µg鞭毛蛋白或生理盐水。在不同时间点采集肺组织并置于核酸保存液中。提取总RNA并合成cDNA。使用表1所列的特异性引物通过实时PCR检测mRNA水平。采用ΔCt法进行相对定量，以Actb mRNA水平作为归一化参照。结果以相对于生理盐水处理组的倍数变化表示，数据为中位数±标准误（SEM）。星号表示根据Mann-Whitney检验计算的统计学显著差异（p < 0.05）。结果代表两次独立实验。

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图 2. 经舌下免疫治疗鞭毛蛋白后肺炎链球菌肺炎期间肺部的转录谱。 使用 10 µg 鞭毛蛋白或生理盐水通过舌下途径在麻醉条件下处理 8 至 10 周龄的 BALB/c 小鼠（对照组 n=4，处理组 n=7）。2 小时后，通过鼻内途径以临床分离株 S. pneumoniae 1 型 E1585 的最小致死剂量（MLD，导致 100% 死亡率）进行攻击，相当于 4×105 CFU/50 µl。攻击后 24 小时收集肺组织，并保存于核酸保护剂中，直至进行 RNA 提取和 cDNA 合成。进行实时 PCR 检测（引物列表见表 1），采用 ΔCt 法进行相对定量，以 Actb mRNA 水平作为归一化标准。结果以生理盐水处理组为对照的倍数变化表示，数据为中位数±标准误（SEM）。星号表示根据 Mann-Whitney 检验计算的统计学显著差异（p < 0.05）。

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图3. 舌下免疫治疗（SLIT）后肺组织和气道中多形核中性粒细胞（PMN）募集的分析。 8至10周龄的BALB/c小鼠（n=4）在麻醉状态下通过舌下途径给予10 µg鞭毛蛋白或生理盐水处理。2小时后，小鼠通过鼻内途径攻毒致死剂量的S. pneumoniae 1型E1585菌株。攻毒24小时后，采集支气管肺泡灌洗液（BAL），并取肺组织进行FACS分析。PMN根据FCS-SSC图谱，并定义为Ly6Ghigh/CD11bhigh/CD11cnegative的细胞。结果以BAL或肺组织中PMN占总细胞数的百分比表示。柱状图表示中位数±标准误差（SEM）。星号表示经单因素Mann-Whitney检验计算的统计学显著差异（p < 0.05）。

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图4. 舌下给予鞭毛蛋白可保护小鼠免受急性肺炎链球菌肺炎的侵害。8至10周龄的BALB/c小鼠（n = 8）在麻醉状态下通过舌下途径给予10 µg鞭毛蛋白或生理盐水。2小时后，通过鼻内途径以血清型1 E1585的S. pneumoniae的MLD剂量攻击小鼠。每日评估存活情况。采用Kaplan-Meier曲线并根据Log-rank（Mantel-Cox）检验进行比较。星号表示具有统计学显著性差异（p < 0.05）。结果代表两次独立实验。

名称序列 5’-3’PCR 产物长度 (bp)
mB-actin_FGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT68
mB-actin_RCGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_FTTTTGGGATGGAATTGGACAC69
mCCL20_RTGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_FCTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA84
mCXCL1_RACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_FGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA78
mIL-6_RAAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_FCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA63
mTNFalpha_RCCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_FCCCTCAACGGAAGAACCAAA72
mCxcl2_RCACATCAGGTACGATCCAGGC

表1. 用于实时PCR分析的引物列表。qPCR分析中使用特异性引物序列。小鼠actb、Cccl20、Cxcl1、Il6、Tnfa和Cxcl1的正向与反向引物以5’-3’序列形式列出，预期扩增产物长度以碱基对（bp）表示。

讨论

已证明，舌下给药是一种调节呼吸道免疫反应的有效方法。舌下免疫治疗（SLIT）在治疗呼吸系统疾病方面的主要优势在于，无需将化合物直接递送至肺部或鼻腔，因此相较于基于鼻内给药的治疗方法更为安全31。

舌下免疫治疗可通过多种方式调节免疫反应，既可用于诱导调节性免疫反应以改善过敏性炎症和哮喘的症状32，也可用于诱导先天免疫机制的短暂活化，以治疗急性肺部感染，如本研究中所示。

本视频中展示的小鼠模型是一种用于筛选不同化合物作为舌下免疫治疗（SLIT）治疗剂的便捷方法。

该动物模型为研究SLIT对肺部免疫反应及其他器官的影响提供了一种有效手段（例如，引流淋巴结或远端黏膜部位）无法通过使用 体外 模型。尽管已有若干论文描述了采用舌下免疫疗法所获得的结果，但关于舌下给药操作的详细方法尚未公开。此外，该模型还可用于评估旨在在呼吸道中诱导全身性及局部保护作用的舌下疫苗。

如随附视频所示，化合物的舌下给药是一种简单的操作，无需 extensive training 即可轻松完成。通常，一位熟练掌握动物操作的人员使用本方案中所述的注射用麻醉剂，可在 1 小时内对 10 只小鼠完成舌下免疫治疗（SLIT）。若同时进行肺炎球菌攻击，则还需额外 90 分钟以制备细菌悬液并对动物实施鼻内攻击。

本文所展示的FACS方案可方便地表征SLIT在给药局部位点、引流淋巴结以及对肺部细胞动态的影响。

分别分析支气管肺泡灌洗液和肺实质组织，对于区分存在于气道中的常驻免疫细胞和浸润性细胞与组织内保留的细胞类型至关重要。对支气管肺泡灌洗液（BAL）内容物的分析可用于研究肺泡巨噬细胞的更替，以及不同处理诱导下各类细胞向肺泡腔募集的动态过程，例如，中性粒细胞（PMNs）、嗜酸性粒细胞、单核细胞。BAL 还可用于通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测分泌的细胞因子和趋化因子，或检测舌下免疫接种后诱导产生的分泌型 IgA 抗体。对肺组织的研究则有助于表征其他类型的细胞，通常包括树突状细胞、T 细胞和 B 细胞。

支气管肺泡灌洗样本和淋巴结用于流式细胞术分析的制备过程较为简便。样本采集后，通常需要60分钟完成10至20个样本的染色流程。相比之下，从肺组织或舌下组织中分离细胞所需时间更长，因为需要消化细胞外基质。通过舌下途径递送的治疗剂的吸收情况，可通过追踪荧光标记或放射性标记的分子来评估。 体内 成像系统

舌下免疫疗法是一种有效诱导呼吸道局部及全身免疫反应的吸引人方法，可用于治疗或预防呼吸系统疾病。阐明决定免疫激活的机制 与 舌下免疫治疗（SLIT）后呼吸道免疫应答的耐受性对于合理设计新的治疗策略至关重要，这些策略可单独使用或与现有疗法联合应用于不同的呼吸道疾病。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢法国里尔巴斯德研究所感染与免疫中心的 Jean-Claude Sirard 博士慷慨提供纯化的鞭毛蛋白，以及乌拉圭卫生部国家参考实验室主任 Teresa Camou 博士慷慨提供肺炎链球菌菌株。

作者谨向乌拉圭 BichoFeo Producciones 公司的 Diego Acosta 先生和 Ignacio Turel 先生致以诚挚谢意，感谢他们在整个视频制作与编辑过程中所付出的辛勤努力和坚定投入。

本工作得到了乌拉圭国家研究与创新局（ANII）资助项目 PR_FCE_2009_1_2783 和 BE_POS_2010_1_2544、乌拉圭基础科学促进计划（PEDECIBA）以及乌拉圭共和国大学科学研究中心（CSIC）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮溶液（50 mg/ml）Pharma Service, Uruguay
赛拉嗪溶液（2 %）Portinco S.A., Uruguay
无菌 1 ml 注射器Modern, Uruguay
无菌 27 G 针头Modern, Uruguay
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
胎牛血清ATCC302020
青霉素/链霉素溶液SIGMAP4333
无钙2+/镁2+的无菌 PBSPAAH21002
I 型胶原酶Life Technologies/Gibco17100017
脱氧核糖核酸酶 I（DNAse-I）SIGMAD4513
中性蛋白酶（Dispase）Life Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 IgG2b 抗 CD11b 抗体BD550993克隆号 M1/70
APC 标记的仓鼠抗小鼠 IgG1 抗 CD11c 抗体BD550261克隆号 HL3 
APC-Cy7 标记的大鼠抗小鼠 IgG2a 抗 Ly6G 抗体BD560600克隆号 1A8
无菌生理盐水溶液Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay
胰蛋白酶大豆琼脂BD Difco, France236950
去纤维羊血Biokey, Uruguay
无菌培养皿Greiner633180
p10 移液器GilsonF144802
p20 移液器Eppendorf3120000097
p200 移液器GilsonF123601
p200 移液器CappC200
p200 移液器Eppendorf3120000054
p1000 移液器Eppendorf3120000062
无菌滤芯吸头 p10Greiner771288
无菌滤芯吸头 p200Greiner739288
无菌滤芯吸头 p1000Greiner750288
涡旋振荡器BIOSANV1-plus
不锈钢细尖镊子 SIGMAZ168785/Z168777弯型和直型
敷料组织镊SIGMAF4392长度 8 英寸
显微解剖镊SIGMAF4017直型 
显微解剖镊SIGMAF4142 弯型
梅奥剪刀SIGMAZ265993 
手术刀SAKIRA MEDICAL
无菌活检打孔器 Ø 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079D也可使用 5 mm 直径的打孔器
无菌 1.5 ml 离心管Deltalab200400P
无菌 15 ml 离心管Greiner188271
无菌 50 ml 离心管Greiner227261
无菌刻度移液管 5 mlGreiner606160
无菌刻度移液管 10 mlGreiner607160
无菌刻度移液管 25 mlGreiner760180
II 级生物安全柜Thermo Scientific1300 系列，A2 型
Micro-Isolator 鼠笼系统RAIR IsoSystem 76144WSuper Mouse 1800 AllerZone 
制冷微量离心机EppendorfLegend Micro 21R
微量离心机HeraeusBiofuge-pico
离心机Thermo ScientificSorval ST40R
CO2 培养箱 Thermo Scientific型号  3111
无菌细口巴斯德移液管DeltalabD210022
无菌巴斯德移液管Deltalab200007
无菌 24 孔板Greiner662160
台盼蓝溶液 Life TechnologiesT10282
自动细胞计数仪 - CountessLife TechnologiesC10227 
Countess 细胞计数板载玻片Life TechnologiesC10312
流式细胞仪管BD343675
流式细胞仪 - FACS Canto-IIBD
实时荧光定量 PCR 仪 - Rotor Gene Q 或 ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol 试剂Life Technologies15596-026分子生物学级
DNAse-ILife Technologies18068-015分子生物学级
DNAse-I 缓冲液 10XLife Technologies18068015分子生物学级
EDTA 25 mMLife Technologies18068015分子生物学级
超纯水Life Technologies10977分子生物学级
RNA酶抑制剂（RNAse Out）Life Technologies100000840分子生物学级
随机六聚物引物Life TechnologiesN8080127分子生物学级
M-MLV-RT 缓冲液Life Technologies18057-018分子生物学级
M-MLV-RT 酶Life Technologies28025-021分子生物学级
QuantiTect Syber Green PCR 试剂盒Qiagen204143分子生物学级
特异性引物 Life Technologies分子生物学级

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TLR
舌下免疫疗法作为诱导抵抗急性呼吸道感染的替代方法
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