新生小鼠静脉注射

摘要

儿科疾病的动物模型可能出现早期发病和快速进展的病情。对幼年小鼠模型进行具有临床相关性的治疗给药在技术上可能较为困难。本方案描述了一种针对出生后前两天内的新生小鼠进行的无创静脉注射方法。

摘要

静脉注射是一种临床上可应用的治疗递送方式。对于成年啮齿类动物和较大的动物，静脉注射在技术上是可行且常规的操作。然而，某些小鼠模型可能在早期即出现疾病并迅速进展，使得潜在疗法的给药变得困难。小鼠耳芽前方即为颞静脉（或称面部静脉），在出生后前两天内，使用解剖显微镜可在头部两侧清晰观察到该静脉。在此时间窗口内，可向颞静脉注射体积达50 μl的液体。该注射操作安全，幼鼠及其母鼠均能良好耐受。一次典型的注射操作可在1-2分钟内完成，之后即可将幼鼠放回原笼。出生后第三天起，该静脉难以观察，注射操作的技术可靠性也随之下降。该技术已被用于递送腺相关病毒（AAV）载体，根据所选病毒血清型的不同，可实现几乎全身体性且稳定的转基因表达，并持续至动物整个生命周期。

引言

在儿童疾病的小鼠模型中，将治疗剂递送至中枢神经系统（CNS）仍是一项挑战。用于模拟新生儿疾病状态的小鼠体型较小且发育不成熟，因此难以直接向CNS内适当结构进行注射。血管内注射治疗剂是一种非侵入性且耐受性良好的方法，可将细胞、药物或病毒载体递送至全身，包括中枢神经系统^1-5和视网膜^3,5-9。先前的研究报道了使用透射光源经颞面部静脉注射的方法^10,11，但无需解剖显微镜^11,12，或需要两人协作完成注射¹⁰。本方案所描述的注射技术具有优势，因其仅需一人即可完成仔鼠注射，且用于观察颞静脉的光源不接触仔鼠，从而无需使用手术胶带或将仔鼠固定于透射光源等固定表面¹¹。在小鼠中递送9型腺相关病毒载体血清型（AAV9）可在全脑及脊髓的神经元和星形胶质细胞中实现高效表达（图1）。通过浅表颞面部静脉进行病毒载体的血管内递送已在多种新生小鼠研究中被可靠应用，用于治疗儿童神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症（SMA）^2,4,13,14，并最终延长了治疗小鼠的寿命。

对新生小鼠进行血管内注射也能有效靶向周围神经系统和外周器官（图2）。注射腺相关病毒（AAV）后，已观察到背根神经节、肝脏、心脏、骨骼肌、肺以及肠道肌间神经丛的转导^1,3,6,7,15。由于该注射方法可实现中枢神经系统和外周组织的广泛转导，因此特别适用于需要转基因全身性表达的疾病，例如高雪氏病¹⁶及其他溶酶体贮积症^17,18、巴滕病及相关神经元蜡样脂褐质沉积症¹⁹，以及症状始于幼儿期的多系统遗传病——巴德-比德尔综合征²⁰。新生小鼠血管内注射还应被视为一种模拟全身性儿科疾病的新型建模方法。该技术已被拓展至更大的动物模型^5,21，且血管内注射本身已是临床上可接受的治疗递送方式。

本方案描述了一种简单且高效的方法，可在出生后第2天或之前通过幼鼠的浅表颞面部静脉递送试剂。该注射操作可由一名经过训练的人员独立完成，对幼鼠及其母鼠均具有良好的耐受性。幼鼠所经历的不适极小，并能迅速恢复。重要的是，成功的注射可实现所给予试剂的全身性分布。本方案适用于向新生小鼠递送病毒载体、药物制剂或细胞。

方案

本方案中列出的所有操作步骤均已获得俄亥俄州立大学动物使用与护理研究所委员会（IACUC）的批准。

1. 实验室工作区的准备

1. 准备湿冰以麻醉小鼠幼崽，准备一个空笼子用于将母鼠与幼崽隔开，准备一台解剖显微镜，一个可调节至注射角度的光源（使用与注射部位呈90° 的光源会遮挡静脉），准备一个清洁的操作台面用于放置动物进行注射，另备棉签、3/10 cc胰岛素注射器（每只动物使用一支）配3/8” 30 G 针头，以及用于训练的1%伊文思蓝染料溶液（用磷酸盐缓冲液（PBS）配制）。
2. 在操作幼崽时，将母鼠移至另一个笼子中。

2. 注射操作步骤

1. 将一只幼鼠直接置于湿冰上 30–60 秒 以麻醉动物。由于长时间置于冰上可能导致低体温相关并发症（包括心室颤动、组织缺氧和代谢性酸中毒），切勿使动物在冰上停留过久。
   注意：根据我们的经验，30–60 秒 足以减缓幼鼠活动，便于进行注射。如需更深程度的麻醉，可使用吸入性麻醉剂，例如 1–2% 异氟烷。
2. 在动物处于冰上的同时，用注射器吸取 30 μl 伊文思蓝染料。
3. 当动物已完全麻醉（表现为在冰上无任何运动但仍保持呼吸）时，将其移至显微镜下。若为右手注射，应使动物的吻部朝向右侧。用左手食指按住吻部，左手中指置于耳芽后方，使耳芽位于食指与中指之间（图 1）。
4. 在耳芽前方稍前处寻找一条表浅毛细血管，该血管在皮肤移动时会随之移动。此毛细血管并非注射目标，但其识别对定位颞静脉至关重要。接下来，在该毛细血管下方寻找一条颜色较深、呈阴影状的静脉，该静脉位置固定，不随皮肤移动而改变。颞静脉呈暗影状，由背侧向腹侧走行，并汇入颈静脉（图 1）。
5. 将针头斜面向上刺入颞静脉。若进针正确，可通过皮肤观察到针头斜面被血液充盈。随后缓慢推动针栓，并观察到颜面部静脉出现褪色现象。
6. 让针头在静脉内额外保留 10–15 秒 ，以防止注入物反流。

3. 注射后处理

1. 注射成功后，幼鼠应几乎立即变为蓝色。拔出针头，并轻轻按压棉签于注射部位，直至血液凝固。
2. 密切观察幼鼠是否有痛苦迹象。让幼鼠恢复并复温 2–3 分钟 ，待其意识恢复、能够直立并自主活动后，再放回笼中。必要时，可将幼鼠置于实验人员戴着手套的手中，用手掌温度提供适当保暖以促进恢复。或者，在母鼠所在的笼子下方放置加热垫，以帮助被注射的幼鼠升温。通常在注射伊文思蓝染料后，需对幼鼠实施安乐死。注射实验物质时，不应加入染料。
3. 将幼鼠放回原笼，并确保其身上沾有垫料和/或筑巢材料，以保证母鼠重新接受该幼鼠。
4. 每只幼鼠均应使用新的注射器和棉签，以维持无菌操作。

结果

在正确注射过程中，静脉应暂时变得透明或发白。若注射染料，幼鼠全身应在数秒内变蓝。若发生错误注射，常可见头部或颈部皮下出现集中的药液团块，且注射物可能从注射部位渗出。错误注射还可能导致咽喉周围出现瘀斑。接受皮下注射的幼鼠（即 注射未完全进入静脉的小鼠通常不会出现不良副作用，并且对治疗的反应与正确注射的小鼠一样正常。

根据所采用的治疗方式，成功的注射可实现向中枢神经系统及外周器官的广泛递送。当注射表达绿色荧光蛋白（GFP）的自互补腺相关病毒9型（scAAV9），其携带鸡β-肌动蛋白杂合启动子（CB）（合称为“scAAV9 CB GFP”）时，可在多个脑区以及脊髓中的胶质细胞和神经元中检测到外源基因的表达（图2A-2C）。通过血管内注射scAAV9 CB GFP也可在外周组织中实现广泛表达，在心脏和肝脏组织中尤为明显（图3A-3D）。

讨论

在新生小鼠疾病模型中，向中枢神经系统（CNS）或全身进行血管内给药具有较大难度。本文所述方案是一种快速、相对无创的静脉注射方法，可在设备需求最少的条件下对新生小鼠进行给药。尽管颞面部静脉肉眼可见，但在显微镜和光纤光源辅助下注射可提高准确性，尤其适用于缺乏经验的操作者。新生小鼠的血管内注射成功率较高¹²，即使部分药液被注入皮下，早期幼鼠中仍可观察到腺相关病毒（AAV）的转导效果。该注射操作对幼鼠耐受性良好，FVB/N 或 C57BL/6 背景的母鼠对幼鼠的操作也耐受良好。然而，极少数情况下母鼠可能毁弃整窝幼崽。本方法可在体重低至 0.8 g 至 1.6 g 的小鼠中成功实施。我们及其他研究者已发表过其他新生小鼠给药途径，包括眶后静脉、颈静脉及腹腔注射^10,15,22。我们更倾向于采用此处描述的注射途径，因其具有临床相关性，仅需单名实验人员操作且无需特殊设备，同时可容纳较宽范围的给药体积。

进行注射时常见的问题是难以观察到颞静脉，从而导致针头位置错误。使用光纤光源时，应将其置于小于<90°的角度，并向下照射头部，以获得最佳的静脉视野。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Thinpro 胰岛素注射器	Terumo	SS30M3009	3/10 cc，3/8" 针头，30 G，每只小鼠使用 1 支
伊文思蓝染料	Sigma-Aldrich	E2129	用 1× 磷酸盐缓冲液稀释至 1%
棉签	Fisher Scientific	23-400-101
光纤光源	Fisher Scientific	12-562-36
解剖显微镜