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通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白

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DOI：

10.3791/52042

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2015年1月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

本文内容

摘要

我们在此报告了在将mRNA注射到未受精卵母细胞后，荧光蛋白的稳定且高效的表达 Branchiostoma lanceolatum该微型注射技术在这一基础脊索动物中的建立，将为这一新兴模式系统带来深远的技术革新，包括 体内 成像与基因特异性操作

摘要

我们在此报道一种高效且稳健的方案，通过将 mRNA 注射到头索动物文昌鱼的未受精卵母细胞中，以表达荧光蛋白。 Branchiostoma lanceolatum我们采用了经过改造的、适用于文昌鱼密码子使用偏好和Kozak共识序列的膜定位和核定位mCherry及eGFP表达载体。本文描述了所用注射针的类型、未受精卵母细胞的固定方法以及整体注射装置的设置。该技术可产生荧光标记的胚胎，从而利用最新技术分析早期发育过程中细胞行为的动态变化 体内 成像策略。在该文昌鱼物种中建立显微注射技术，将能够实现对胚胎细胞行为的活体成像分析，以及基因特异性操作，包括基因过表达和基因敲降。总体而言，本方案将进一步确立头索动物文昌鱼作为研究胚胎发育机制及其演化问题的动物模型地位。

引言

在发育过程中，单个细胞通过高度复杂的过程产生整个生物体，该过程涉及细胞分裂和细胞运动。为了更深入地理解细胞行为动态背后的生物学原理，发育生物学家已开始采用基于荧光的技术 体内 成像技术。细胞的特定区室（如细胞膜）可通过荧光染料标记，但该方法受限于特异性不足和组织穿透能力差1或通过向胚胎中导入编码荧光蛋白的外源mRNA2. 可采用多种技术实现外源化合物（如mRNA）的有效递送，包括但不限于显微注射、电穿孔、微粒轰击、脂质体转染及转导3,4尽管所有这些方法均可用于将外源化合物导入正在发育的胚胎中，但只有显微注射能够向每个细胞施加预定义且精确的剂量。3微注射技术已针对所有主要的发育生物学模型系统进行了描述4 (例如，果蝇、线虫、斑马鱼、青蛙、小鼠）以及一些替代模型4，包括用于比较研究以理解发育机制进化的那些方法（例如海葵、环节蠕虫、海胆、尾索动物海鞘、头索动物文昌鱼

头索动物与尾索动物和脊椎动物共同构成了脊索动物门，是研究脊索动物演化以及脊椎动物从无脊椎动物祖先分化过程的理想模型5-8。头索动物谱系在脊索动物演化早期即已分离；现存的头索动物分为三个属（Branchiostoma、Asymmetron 和 Epigonichthys），在整体解剖结构和基因组架构方面均与脊椎动物相似5-8。迄今为止已描述的约30种头索动物中，有五种可用于胚胎学和发育研究6,9：Asymmetron lucayanum（巴哈马文昌鱼）、Branchiostoma floridae（佛罗里达文昌鱼）、Branchiostoma lanceolatum（欧洲文昌鱼）、Branchiostoma belcheri（中华文昌鱼）和 Branchiostoma japonicum（日本文昌鱼）。这五个物种中的三个（B. lanceolatum、B. belcheri 和 B. japonicum）在繁殖季节可通过人工诱导实现按需产卵10,11。此外，至少对于 B. lanceolatum 而言，也可在人工海水条件下有效诱导其产卵12，从而使该头索动物物种适用于无法获取天然海水的实验室。在 B. lanceolatum 中，胚胎获取便捷且稳定，并结合高效的递送方法（如显微注射）——迄今为止在文昌鱼（包括 B. floridae 和 B. belcheri）中唯一成功建立的递送技术13-15——将有助于开发一系列新的操作技术，包括谱系示踪和基于动态细胞行为的研究方法。

一种高效显微注射mRNA以表达荧光蛋白的实验方案 B. lanceolatum 胚胎因此得以发育。此外，为实现活体成像提供一套基础工具包 B. lanceolatum 胚胎中，开发了可实现荧光蛋白膜定位与核定位的载体系统。为实现膜靶向，将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）与人源HRAS CAAX盒融合；为实现mCherry和eGFP的核定位，将其与斑马鱼组蛋白2B（H2B）外显子融合。图1，补充文件1）。此外，为了优化蛋白质翻译，已对这些载体的Kozak序列和密码子进行修改，并调整为适用于 B. lanceolatum综上所述，本文所介绍的注射方法和表达载体将为头索动物的研究提供基础，尤其适用于基于最新荧光技术的分析实验 体内 成像技术

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方案

1. 仪器与试剂的准备

  1. 移液管的制备
    1. 通过在火焰上方以不同速度拉伸230 mm长的巴斯德移液管，制备一系列具有不同尖端直径的转移用巴斯德移液管。确保拉伸部分尽可能长，以便在吸取过程中实现平稳且精细的控制。
    2. 使用金刚石刻刀，在垂直于移液管长度的方向上划线。用双手沿移液管轴向拉断，形成钝性切口。迅速进行火焰抛光，但不要封闭尖端。
    3. 根据所操作卵母细胞或胚胎的发育阶段调整尖端直径：未受精卵母细胞（直径约150 µm）使用300–400 µm，受精卵（直径约500 µm）使用600 µm，孵化后的神经胚使用200–400 µm。使用连接有口控吸液管的移液管将卵母细胞/胚胎从一个培养皿转移到另一个培养皿。
  2. 注射针
    1. 操作毛细管时佩戴手套，以确保无RNase环境。使用含丝状结构的硼硅酸盐玻璃毛细管，规格为外径1.20 mm、内径0.94 mm、长度10 mm。
    2. 若使用材料清单中所述类型的加热丝式拉针仪，请采用以下参数：加热值600，拉力50，速度80，时间60，压力200或300。否则，应确保拉出的针头形状符合成功注射的关键要求，如图2所示，具备以下特征：尖端外径4–8 µm，锥形部分长度2 cm。
      注意：注射针可在产卵季节前预先拉制，并在整个季节中使用。
  3. 5%酚红储备液（4倍浓度）
    1. 每次产卵季节前新鲜配制。
    2. 在0.22 µm滤膜过滤管中称取25 mg酚红粉末。
    3. 向含有粉末的管中加入0.5 ml无DNase和RNase的水。
    4. 在室温下以18,000 × g离心3–5分钟，以过滤除菌并去除可能堵塞注射针的晶体。
    5. 4 °C保存，或分装成250 µl等份后于-20 °C保存。
  4. 0.25 mg/ml多聚赖氨酸溶液
    1. 每次产卵季节前新鲜配制。
    2. 将5 mg多聚-L-赖氨酸溶解于20 ml蒸馏水中。分装成5 ml等份后于-20 °C保存。
    3. 解冻后的等份溶液应立即使用且仅使用一次，以确保卵母细胞在多聚赖氨酸包被的培养皿上具有可重复且牢固的黏附性。
  5. mRNA合成
    1. 每次产卵季节前新鲜配制。
    2. 用适当的酶线性化5 µg目标DNA（通常在37 °C下反应2小时）。为检测消化是否完全，取消化混合物体积的2%在TBE缓冲液中进行1%琼脂糖-TBE凝胶电泳（150 W，20分钟）。
    3. 用25:24:1的酚（pH 8.0）:氯仿:异戊醇抽提线性化DNA。涡旋20秒，18,000 × g离心10分钟，收集水相（上层）。
    4. 再用24:1的氯仿:异戊醇抽提水相一次。涡旋20秒，18,000 × g离心10分钟，收集水相。
    5. 用线性化DNA:3 M乙酸钠（pH 5.2）:100%乙醇按100:10:300的比例，在-20 °C下过夜沉淀线性化DNA。
    6. 在4 °C下以18,000 × g离心20分钟。用70%乙醇清洗。
    7. 在4 °C下以18,000 × g离心10分钟。晾干后溶于无RNase的水中，终浓度为0.5 µg/µl。
    8. 根据制造商说明书，使用合适的mRNA合成试剂盒及相应的聚合酶，对1 µg线性化DNA进行体外转录。
    9. 使用试剂盒提供的pH 4.7酚:氯仿和乙酸铵终止液抽提mRNA。
    10. 涡旋20秒，18,000 × g离心10分钟，收集水相。
    11. 再用24:1的氯仿:异戊醇抽提水相一次。涡旋20秒，18,000 × g离心10分钟，收集水相。
    12. 用100%异丙醇在-20 °C下过夜沉淀mRNA。
    13. 在4 °C下以18,000 × g离心20分钟。用80%乙醇清洗。
    14. 在4 °C下以18,000 × g离心10分钟。将沉淀在室温下干燥不超过5–10分钟，以免难以重悬。用无DNase和RNase的水重悬，终浓度至少为2 µg/µl，以确保注射混合液中mRNA浓度足够高。
    15. 为检测转录产物的质量和大小，取0.5 µl mRNA样品在无RNase的1%琼脂糖-TBE凝胶中进行电泳（TBE缓冲液，150 W，20分钟）。分装2 µl等份后于-80 °C保存。
  6. 多聚赖氨酸包被的培养皿
    注意：多聚赖氨酸包被的培养皿用于在注射过程中固定卵母细胞。
    1. 对每个35 mm细胞培养培养皿（共5个），在培养皿底部加入1 ml解冻后的0.25 mg/ml多聚赖氨酸溶液，在室温下孵育5分钟。
    2. 对每个35 mm细胞培养培养皿（共5个），将0.25 mg/ml多聚赖氨酸溶液转移至另一个35 mm细胞培养培养皿中，在室温下再孵育5分钟。
    3. 弃去0.25 mg/ml多聚赖氨酸溶液。
    4. 将培养皿倒置于室温下干燥2小时。
    5. 将包被好的培养皿用塑料膜包裹后于4 °C保存，最多保存一周，以防污染。
  7. 琼脂糖包被的培养皿
    注意：用于培养注射后的胚胎。琼脂糖提供缓冲层，防止注射后的胚胎黏附在培养皿底部。
    1. 使用反渗透水配制人工海水（ASW），加入37–38 g/L商用盐和0.25 mM NaHCO3。
    2. 将琼脂糖加入经0.22 µm滤膜过滤的人工海水中，加热至1%浓度（可用微波炉加热溶解）。
    3. 迅速将温热的琼脂糖溶液从一个35 mm培养皿倒入另一个培养皿，以确保形成极薄的琼脂糖涂层。
    4. 将包被好的培养皿用保鲜膜包裹后于4 °C保存，最多保存一周，以防污染。
  8. 注射混合液的配制与注射针的装填
    1. 在开始注射前约2小时，用无RNase和DNase的水配制2 µl注射混合液，终浓度为mRNA 1–1.8 µg/µl、甘油15%、酚红1.25%。
      注意：酚红可使溶液着色，便于监测注射效率并识别成功注射的胚胎。甘油有助于mRNA在卵母细胞内的扩散。
    2. 以18,000 × g离心4分钟以沉淀晶体，之后置于冰上待用。
    3. 用10 µl移液器吸取0.5 µl注射混合液，避免吸取管底已沉淀晶体的部分。
    4. 通过将0.5 µl注射混合液滴加至注射针大口端的方式，回填至少两根注射针（以防其中一根在注射过程中断裂）。
    5. 将注射针安装于底部盛有液体的储存罐中，于4 °C保存，防止注射液蒸发。让注射液缓慢流向针尖至少1小时，以尽量减少气泡产生。
    6. 额外的注射混合液可分装后于-80 °C保存，最多再使用三次，之后mRNA质量会下降（数据未显示）。

2. 生物材料的采集、显微注射与胚胎培养

  1. 卵母细胞与精子采集
    注意：参见 Theodosiou 等12 有关诱导产卵和配子采集的详细方案。
    1. 在23 °C的ASW中对雄性和雌性进行24小时休克处理。
    2. 日落前一至两小时，将成体转移至含有人工海水（ASW）的单独容器中，温度保持在19 °C，因为大多数成体将在日落后1–2小时内产卵。
    3. 用过滤的人工海水冲洗35 mm培养皿，然后倒置晾干，以防止卵母细胞粘附在培养皿底部。
    4. 产卵后，立即使用1,000 µl移液器收集精子和卵子。
      1. 将精子和卵子与成年文昌鱼分开保存，因为接触会对配子健康产生不利影响（数据未显示）。
      2. 此外，应避免惊扰成体，以防其活动导致精子和卵细胞扩散而被稀释。为尽可能保持精子活性并提高受精率，应尽可能浓缩地收集精子。
    5. 将精子置于冰上，保存在1.5 ml离心管中。
    6. 将卵母细胞转移至已预洗的35 mm培养皿中的过滤人工海水（ASW）中。
    7. 使用预先拉制的300-400 µm转移巴斯德吸管，将100-500个卵母细胞转移至另一个35 mm培养皿中以进行显微注射。
    8. 将剩余的卵进行受精，作为精子和卵子质量的对照，或其他实验的对照。
  2. 卵母细胞注射
    1. 将注射针以相对于水平面50°的角度安装在显微操作器上。
      注意：角度小于50°时会推动培养皿中的卵母细胞移动，而角度大于50°则无法适当观察针头相对于卵母细胞的位置。
    2. 在25倍目镜的荧光解剖显微镜下，使用300–400 µm的转移巴斯德吸管，将30个卵母细胞转移至含过滤人工海水（ASW）的多聚赖氨酸包被培养皿中。
    3. 将卵母细胞沿一条直线放置，以便有序地进行注射，并区分已注射与未注射的卵母细胞。每次注射少量（30个卵母细胞），以尽量减少卵母细胞暴露于多聚赖氨酸的时间，因为多聚赖氨酸容易导致发育中的胚胎变形（数据未显示）。
    4. 使用暗视野照明，使卵母细胞尽可能呈现半透明状态。
    5. 使用显微操作仪的粗调移动旋钮，将注射针移至卵母细胞附近。
    6. 用精细镊子将针头在开始弯曲处剪开。通过脉冲式注射器操作，确认红色注射混合液确实从针头中流出。
    7. 在200倍放大倍数下，使用显微操作仪的微调旋钮，轻柔地将注射针移入卵母细胞的细胞核内。
      注意：若插入过浅，注射液将无法保留在卵母细胞内；若插入过深，卵母细胞将被破坏。
    8. 使用1-3次脉冲注射，每次持续120毫秒，压力为1-10 psi。若注射针足够细，可采用恒定压力下的连续流注射。确保注射体积相当于单个卵母细胞体积的1/5至1/3。
    9. 注射后迅速拔出针头，以避免卵母细胞泄漏。
    10. 验证注射液是否保留在卵母细胞内，并在数秒后扩散至整个卵母细胞。
    11. 继续处理下一个卵母细胞。
    12. 将每组中部分未注射的胚胎保留作为阴性对照，用于在扫描已注射胚胎时评估背景荧光。
  3. 受精、注射胚胎的筛选与胚胎培养
    1. 在完成一批卵母细胞的显微注射后，应立即进行受精。由于卵母细胞质量会随时间推移而下降，因此应在产卵后1小时内完成注射与受精操作。12.
    2. 根据精子浓度，向卵母细胞中加入1-5滴精子，并轻柔晃动培养皿。
      注意：受精膜应在受精后约1分钟内在胚胎上显现。
    3. 让胚胎从多聚赖氨酸包被的培养皿上脱落，同时注射另一批卵母细胞。
    4. 使用600 µm的转移巴斯德吸管将胚胎转移到琼脂糖包被的培养皿中。应尽快将胚胎从多聚赖氨酸包被的培养皿中移出，最好在2细胞期之前完成。
      注意：若胚胎长时间暴露于多聚赖氨酸中，易发育为致密的囊胚，且与培养皿底部接触的一侧趋于扁平。
    5. 在2细胞至4细胞阶段，使用配备DSR滤光片的荧光解剖显微镜筛选成功注射的胚胎， 即， 具有正常形态且表现出酚红衍生的红色荧光信号的细胞。
    6. 将胚胎置于经滤过的人工海水（ASW）中，在琼脂糖包被的培养皿中于19 °C条件下培养，直至达到所需发育阶段 体内 成像

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结果

上述方案为显微注射提供了基础 B. lanceolatum 卵母细胞，因此可用于导入发育中的 B. lanceolatum 编码荧光蛋白的 mRNA 胚胎 体内 成像。尽管该技术确实稳健且可靠，但采用本方案进行注射的成功率仍然存在差异（表1）。这一引人注目的现象最可能的解释在于卵母细胞批次之间存在极大的变异性：不同的卵母细胞批次在受到注射压力时确实表现出截然不同的行为。一些卵母细胞弹性较强，容易在培养皿底部压扁；而另一些则较为僵硬，注射后仍保持圆形。此外，某些批次的卵母细胞在注射时倾向于膨胀其卵膜，而另一些则直接发生裂解（数据未显示）。目前尚未在卵母细胞注射时的行为与其受精后的胚胎发育之间建立明显的相关性。因此，难以预测哪一类卵母细胞最适合显微注射。然而，在受精后，最早在卵裂阶段即可识别出正常发育的胚胎：当卵裂球之间的接触面较小时，2-细胞至4-细胞期胚胎可被视为正常；而卵裂期胚胎若出现紧密化现象，难以分辨单个细胞，则明确为异常。

在我们实验中，约有一半的卵母细胞无法存活于注射所造成的创伤，而存...

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讨论

本文首次提供了一种详细且可重复的注射操作方案 B. lanceolatum 卵母细胞，经过 B. floridae13,14 和 B. belcheri15因此，这是继前两种之后，第三种已描述过该技术的文昌鱼物种。重要的是，本文所述方案还包括适用于荧光蛋白表达的载体系统的描述。 B. lanceolatum 由注射的mRNA产生 体外 （如下所述）。这些新工具共同使得 体内 文昌鱼早期发育的成像，以及对胚胎最早期形态发生事件（如卵裂和原肠作用）中动态细胞行为的分析。

通常，显微注射技术的优点在于能够将特定化合物的预定义体积递送至靶细胞。然而，该技术的一个主要局限性是在单次实验中可注射的细胞数量有限。例如，本文所述的 B. lanceolatum 操作方案允许每次注射处理 100 至 120 枚卵，其中约一半能够成功标记（表3）。对于 B. floridae，每日可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢“Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette”在动物饲养方面提供的支持。本研究获得了法国国家研究署（ANR）基金（项目编号：ANR-09-BLAN-0262-02 和 ANR-11-JSV2-002-01）对 Michael Schubert 的资助，欧盟第六框架计划“Embryomics”项目资助，以及法国国家研究署（ANR）“ANR-10-BLAN-121801 Dev-Process”项目对 Jean-François Nicolas 和 Nadine Peyriéras 的资助。João Emanuel Carvalho 由葡萄牙科学技术基金会（FCT）博士奖学金（SFRH/BD/86878/2012）资助。

有关本文所述载体的申请可直接联系作者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
耗材
35 mm 培养皿Falcon353001经培养处理
过滤装置（Stericup 1 L）FisherW217190.22 μm
离心柱（Spin-X 管）Costar81600.22 μm
用于直径 1.2 mm 毛细管的针头储存罐WPIE212
巴斯德吸管230 mm 长
抽吸管Dutscher75056
注射针用毛细管SutterBF 120-94-10含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.20 mm，内径 0.94 mm，长度 10 mm
试剂
低熔点琼脂糖SigmaA9414
酚红Sigma114537
甘油SigmaG2025
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP9155
H2O，无 DNase/RNaseGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 转录试剂盒AmbionAM1340mRNA 合成试剂盒
酚，pH 8SigmaP4557
24:1 氯仿:异戊醇SigmaC0549
5:1 酚 pH 4.7:氯仿SigmaP1944
Reef Crystal 盐（200 kg）Europrix 商用盐
NaHCO3SigmaS6014
设备
荧光解剖显微镜，放大倍数 200XLeicaMZ16F25X 目镜，DSR 和 GFP2 滤光片
显微操作器MarzhauzerM-33
显微注射仪PicospritzerII 或 III 型
拉针仪SutterP97加热丝式拉针仪
精细镊子Fine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5

参考文献

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通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白
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