通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白

摘要

我们在此报告了在将mRNA注射到未受精卵母细胞后，荧光蛋白的稳定且高效的表达 Branchiostoma lanceolatum该微型注射技术在这一基础脊索动物中的建立，将为这一新兴模式系统带来深远的技术革新，包括 体内 成像与基因特异性操作

摘要

我们在此报道一种高效且稳健的方案，通过将 mRNA 注射到头索动物文昌鱼的未受精卵母细胞中，以表达荧光蛋白。 Branchiostoma lanceolatum我们采用了经过改造的、适用于文昌鱼密码子使用偏好和Kozak共识序列的膜定位和核定位mCherry及eGFP表达载体。本文描述了所用注射针的类型、未受精卵母细胞的固定方法以及整体注射装置的设置。该技术可产生荧光标记的胚胎，从而利用最新技术分析早期发育过程中细胞行为的动态变化 体内 成像策略。在该文昌鱼物种中建立显微注射技术，将能够实现对胚胎细胞行为的活体成像分析，以及基因特异性操作，包括基因过表达和基因敲降。总体而言，本方案将进一步确立头索动物文昌鱼作为研究胚胎发育机制及其演化问题的动物模型地位。

引言

在发育过程中，单个细胞通过高度复杂的过程产生整个生物体，该过程涉及细胞分裂和细胞运动。为了更深入地理解细胞行为动态背后的生物学原理，发育生物学家已开始采用基于荧光的技术 体内 成像技术。细胞的特定区室（如细胞膜）可通过荧光染料标记，但该方法受限于特异性不足和组织穿透能力差¹或通过向胚胎中导入编码荧光蛋白的外源mRNA². 可采用多种技术实现外源化合物（如mRNA）的有效递送，包括但不限于显微注射、电穿孔、微粒轰击、脂质体转染及转导^3,4尽管所有这些方法均可用于将外源化合物导入正在发育的胚胎中，但只有显微注射能够向每个细胞施加预定义且精确的剂量。³微注射技术已针对所有主要的发育生物学模型系统进行了描述⁴ (例如，果蝇、线虫、斑马鱼、青蛙、小鼠）以及一些替代模型⁴，包括用于比较研究以理解发育机制进化的那些方法（例如海葵、环节蠕虫、海胆、尾索动物海鞘、头索动物文昌鱼

头索动物与尾索动物和脊椎动物共同构成了脊索动物门，是研究脊索动物演化以及脊椎动物从无脊椎动物祖先分化过程的理想模型^5-8。头索动物谱系在脊索动物演化早期即已分离；现存的头索动物分为三个属（Branchiostoma、Asymmetron 和 Epigonichthys

方案

1. 仪器与试剂的准备

1. 移液管的制备
   1. 通过在火焰上方以不同速度拉伸230 mm长的巴斯德移液管，制备一系列具有不同尖端直径的转移用巴斯德移液管。确保拉伸部分尽可能长，以便在吸取过程中实现平稳且精细的控制。
   2. 使用金刚石刻刀，在垂直于移液管长度的方向上划线。用双手沿移液管轴向拉断，形成钝性切口。迅速进行火焰抛光，但不要封闭尖端。
   3. 根据所操作卵母细胞或胚胎的发育阶段调整尖端直径：未受精卵母细胞（直径约150 µm）使用300–400 µm，受精卵（直径约500 µm）使用600 µm，孵化后的神经胚使用200–400 µm。使用连接有口控吸液管的移液管将卵母细胞/胚胎从一个培养皿转移到另一个培养皿。
2. 注射针
   1. 操作毛细管时佩戴手套，以确保无RNase环境。使用含丝状结构的硼硅酸盐玻璃毛细管，规格为外径1.20 mm、内径0.94 mm、长度10 mm。
   2. 若使用材料清单中所述类型的加热丝式拉针仪，请采用以下参数：加热值600，拉力50，速度80，时间60，压力200或300。否则，应确保拉出的针头形状符合成功注射的关键要求，如图2所示，具备以下特征：尖端外径4–8 µm，锥形部分长度2 cm。
      注意：注射针可在产卵季节前预先拉制，并在整个季节中使用。

结果

上述方案为显微注射提供了基础 B. lanceolatum 卵母细胞，因此可用于导入发育中的 B. lanceolatum 编码荧光蛋白的 mRNA 胚胎 体内 成像。尽管该技术确实稳健且可靠，但采用本方案进行注射的成功率仍然存在差异（表1）。这一引人注目的现象最可能的解释在于卵母细胞批次之间存在极大的变异性：不同的卵母细胞批次在受到注射压力时确实表现出截然不同的行为。一些卵母细胞弹性较强，容易在培养皿底部压扁；而另一些则较为僵硬，注射后仍保持圆形。此外，某些批次的卵母细胞在注射时倾向于膨胀其卵膜，而另一些则直接发生裂解（数据未显示）。目前尚未在卵母细胞注射时的行为与其受精后的胚胎发育之间建立明显的相关性。因此，难以预测哪一类卵母细胞最适合显微注射。然而，在受精后，最早在卵裂阶段即可识别出正常发育的胚胎：当卵裂球之间的接触面较小时，2-细胞至4-细胞期胚胎可被视为正常；而卵裂期胚胎若出现紧密化现象，难以分辨单个细胞，则明确为异常。

在我们实验中，约有一半的卵母细胞无法存活于注射所造成的创伤，而存.......

讨论

本文首次提供了一种详细且可重复的注射操作方案 B. lanceolatum 卵母细胞，经过 B. floridae^13,14 和 B. belcheri¹⁵因此，这是继前两种之后，第三种已描述过该技术的文昌鱼物种。重要的是，本文所述方案还包括适用于荧光蛋白表达的载体系统的描述。 B. lanceolatum 由注射的mRNA产生 体外 （如下所述）。这些新工具共同使得 体内 文昌鱼早期发育的成像，以及对胚胎最早期形态发生事件（如卵裂和原肠作用）中动态细胞行为的分析。

通常，显微注射技术的优点在于能够将特定化合物的预定义体积递送至靶细胞。然而，该技术的一个主要局限性是在单次实验中可注射的细胞数量有限。例如，本文所述的 B. lanceolatum 操作方案允许每次注射处理 100 至 120 枚卵，其中约一半能够成功标记（表3）。对于 B. floridae，每日可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
耗材
35 mm 培养皿	Falcon	353001	经培养处理
过滤装置（Stericup 1 L）	Fisher	W21719	0.22 μm
离心柱（Spin-X 管）	Costar	8160	0.22 μm
用于直径 1.2 mm 毛细管的针头储存罐	WPI	E212
巴斯德吸管			230 mm 长
抽吸管	Dutscher	75056
注射针用毛细管	Sutter	BF 120-94-10	含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.20 mm，内径 0.94 mm，长度 10 mm
试剂
低熔点琼脂糖	Sigma	A9414
酚红	Sigma	114537
甘油	Sigma	G2025
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P9155
H2O，无 DNase/RNase	Gibco	10977-035
mMessage mMachine SP6 转录试剂盒	Ambion	AM1340	mRNA 合成试剂盒
酚，pH 8	Sigma	P4557
24:1 氯仿:异戊醇	Sigma	C0549
5:1 酚 pH 4.7:氯仿	Sigma	P1944
Reef Crystal 盐（200 kg）	Europrix		商用盐
NaHCO3	Sigma	S6014
设备
荧光解剖显微镜，放大倍数 200X	Leica	MZ16F	25X 目镜，DSR 和 GFP2 滤光片
显微操作器	Marzhauzer	M-33
显微注射仪	Picospritzer	II 或 III 型
拉针仪	Sutter	P97	加热丝式拉针仪
精细镊子	Fine Science Tools GmbH	11252-30	Dumont #5