Pseudomonas aeruginosa 诱导的肺损伤模型

摘要

我们通过气管内注射铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）建立了小鼠肺损伤模型。该模型模拟了肺炎期间的肺损伤，具有临床相关性。

摘要

为了研究人类急性肺损伤和肺炎，建立能够模拟该疾病多种病理特征的动物模型至关重要。在此，我们通过气管内注射细菌建立了小鼠肺损伤模型 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa 或PA）。利用该模型，我们能够在损伤早期观察到肺部炎症。此外，通过分析支气管肺泡灌洗液（BAL）发现肺泡上皮屏障通透性增加；通过Tunel检测对受损肺组织进行分析，观察到肺泡细胞死亡。在损伤后期，我们观察到修复过程所必需的细胞增殖。损伤在启动后7天得到解决。 P. aeruginosa 注射。该模型模拟了肺炎过程中肺部炎症、损伤与修复的相继发展过程。这一具有临床相关性的动物模型适用于研究急性肺损伤后的病理变化、修复机制，也可用于测试该疾病的潜在治疗药物。

引言

肺部暴露于环境病原体，易受炎症和损伤的影响^1-3。在肺炎或成人呼吸窘迫综合征（ARDS）等病理状态下，病原体以及白细胞释放的炎症因子可诱导肺泡细胞的损伤和死亡^1-3。建立急性肺损伤的动物模型对于研究损伤的病理过程以及修复机制具有重要意义。

目前，大多数研究人员使用高氧和博来霉素诱导的小鼠肺损伤模型⁴。然而，高氧所致损伤的机制与肺炎或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中常见的大多数肺损伤并不相同⁵。在临床实践中，博来霉素诱导的急性损伤较为罕见⁴。本文报道一种通过气管内注射P. aeruginosa^6,7建立的小鼠肺损伤模型。该模型具有临床相关性，可模拟肺炎发生后的病理过程⁸。

作为一种机会性医院内病原体，P. aeruginosa 通常感染免疫功能低下个体的肺部、泌尿道、烧伤创面、伤口，并可引起其他类型的血液感染⁶。该细菌会释放毒力因子外毒素A，大量增殖并引发免疫反应⁶。气管内给予P. aeruginosa 可模拟人类暴露于该细菌后引发肺炎的情况，其病理特征可能与近期报道的甲型H1N1流感病毒所致肺损伤模型有所不同⁹。由于P. aeruginosa 属于机会性病原体，相较于某些毒力更强的病原体，其操作相对安全。 本研究采用气管内注射方式给予细菌，因为我们观察到，与经口插入导管等其他方法相比，该方法可将更多细菌导入肺部远端肺泡区域。

与其他急性肺损伤模型相比，本文所述的P. aeruginosa模型适用于研究由细菌感染及过度炎症反应引起的肺损伤。与使用P. aeruginosa诱导败血症的其他动物模型^10,11不同，本研究采用气管内注射该细菌以诱导局部急性肺损伤。

方案

动物实验已获得芝加哥大学动物护理委员会和机构生物安全委员会的批准。

注意：所有涉及假单胞菌的操作均须采用生物安全二级（BSL2）防护措施，包括但不限于佩戴口罩、护目用具、防护服或连体服以及双层手套。应在经过认证的生物安全柜内进行操作。接触过细菌的仪器须使用漂白剂或基于二氧化氯的消毒剂处理。样本运输应使用密封盒。

1. P. aeruginosa 培养与生长

1. 将P. aeruginosa PA103 菌株以细菌冻存液形式保存于螺口冻存管中，并置于 -80 °C 保存。
2. 将冻存管放入装有经 70% 乙醇润湿的纸巾的盒子内的试管架中，转移至生物安全二级（BSL2）实验室。
3. 用接种环从冻存菌种中取菌，在绵羊血琼脂平板上划线，于 37 °C 培养箱中培养约 15 小时。
4. 在 BSL2 生物安全柜中，用接种环刮取平板上的菌落，并重悬于 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
5. 将菌液原液于 4 °C 保存，可保存长达 3 个月，但需每 2 周测定一次滴度。
6. 用 PBS 对菌液进行连续梯度稀释（通常为 1:10⁴ 至 1:10⁷），并将已知稀释倍数的菌液涂布于绵羊血琼脂平板上。
7. 将平板培养约 15 小时，计数菌落并计算菌落形成单位（CFU），以确定细菌浓度。
8. 将适当浓度的菌液（约 5 × 10³ CFU/µl）重悬于 0.5 ml PBS 中，分装至 1.5 ml 无菌螺口冻存管内。密封冻存管后，将其置于装有含消毒剂纸巾的带盖盒子内的冻存管架上。
9. 将盒子运送至 BSL2 动物实验设施，到达后在 BSL2 柜内打开盒子。

2. P. aeruginosa 接种

1. 无菌条件下进行存活手术（使用无菌手套、无菌器械和无菌技术）。使用无菌铺巾为无菌（经高压灭菌）手术器械提供操作表面。每次气管滴注操作之间，使用干热灭菌器对器械进行灭菌。
2. 在麻醉前称量小鼠体重。通过腹腔注射0.1–0.2 ml PBS配制的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）对小鼠进行麻醉。 （腹腔注射）通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏以防止眼睛干涩。
3. 在生物安全二级柜内的手术板上固定小鼠。
4. 确定手术切口区域，剃除该区域毛发，并使用酒精和聚维酮碘棉签交替擦拭3次进行皮肤准备。
5. 用局部麻醉剂（利多卡因）处理切口区域，因为此类麻醉足以满足气管切开等小型手术的需求。
6. 在颈部正中做一个小切口（约5 mm），用钝头镊子轻轻拨开肌肉以暴露气管。通过外科解剖分离暴露气管。
7. 用1 ml一次性注射器（带27 G针头）吸取细菌溶液。对每只小鼠，注射20–30 µl适当浓度的细菌溶液（最高达10⁵ 每只小鼠的菌落形成单位（CFU）
8. 将针头插入气管。缓慢将溶液注入气管。
9. 确保动物出现喘息，这通常表明溶液已进入肺部。
10. 在无菌条件下，使用无菌缝线（6-0 单股）缝合伤口。
11. 术后镇痛使用0.1 mg/kg剂量的丁丙诺啡，通过皮下注射给药，以控制术后疼痛。
12. 确保从麻醉诱导开始至切口闭合的总时间少于15分钟。
13. 注射后，应将注射器和针头丢弃至适当的生物危害锐器容器中。
14. 使用基于二氧化氯的消毒剂处理手术器械15分钟，冲洗后送回实验室进行灭菌，必要时重复使用。
15. 将小鼠单独饲养于清洁笼中，置于温暖环境中。
16. 每30分钟检查动物一次，直至其恢复意识并开始活动；术后前3天内，此后每12小时检查一次。
17. 在整个实验过程中，将小鼠饲养于动物生物安全二级（BSL2）设施中。确保离开动物生物安全二级（BSL2）设施的组织均置于密封容器内。若小鼠在实验期间出现任何濒死状态行为（定义为呼吸困难、嗜睡、对轻度刺激无行走反应），应采用二氧化碳（CO₂）实施安乐死。₂ 从瓶装气源吸入后行颈椎脱位处死。
18. 在麻醉状态下通过放血处死实验动物。
    1. 从安乐死的小鼠中采集肺组织。所有操作均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中进行。如需转移样本，应将密封管置于装有含消毒剂的纸巾的带盖容器内的试管架中，以进行后续处理。

结果

从24 - 72小时开始 P. aeruginosa 注射后，肺组织切片中观察到细胞数量增加（图1A-D）。肺组织从损伤后96小时开始恢复图1E。在接种后第7天 P. aeruginosa，肺泡的正常形态基本得以恢复（图1F）。采用制备于给药后24小时的肺组织切片进行TUNEL染色 P. aeruginosa 显示肺泡细胞出现细胞死亡（图1G-I）。为了研究该损伤模型中的修复过程，于损伤后3天向小鼠注射BrdU P. aeruginosa肺组织在注射BrdU后5小时被分离，并进行BrdU抗体染色处理。如图所示 图1J 和 K，BrdU 掺入细胞数量在给药后 72 小时显著增加 P. aeruginosa 提示过度增殖的给药反应。

为研究损伤后屏障通透性和炎症的变化，于损伤后不同时间点采集支气管...

讨论

我们在此描述的假单胞菌小鼠肺损伤模型模拟了急性肺损伤或肺炎后发生的整个炎症、肺损伤、修复及恢复过程。与其他几种损伤模型相比，该模型具有独特的优点，即临床相关性强，且相对安全、易于操作。

该操作的关键步骤在于，注射细菌溶液时必须非常缓慢。如果注射过快，小鼠很可能因窒息而死亡。成功注射后，小鼠通常会出现数次深呼吸和喘息，这有助于细菌颗粒进入肺部。

我们使用的菌株为 PA103⁶该模型的关键点之一是滴度 P. aeruginosa 需要严格控制。批次的 P. aeruginosa 即使在相同CFU下使用，不同来源的细菌也可能表现出不同程度的炎症和损伤。因此，建议对每一批新细菌进行致病效应测试（如炎症、细胞增殖） 等。），并相应调整所用菌落形成单位（CFU）的数量。若使用冷藏的菌种储备液导致实验结果不一致，可改用每次实验前从新鲜平板培养获得的菌种。此外，细菌的生长阶段及培养基的选择也可能影响其对宿主反应的作用。因此，应确保每次细菌接种均处于细菌生长周期的相同阶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉剂：氯胺酮、赛拉嗪、利多卡因、丁丙诺啡			药品级
27 G 针头	Fisher	1482648
注射器	Fisher	14823434	1 ml
剪刀	精细科学工具公司
镊子	精细科学工具公司
缝合线	Fisher	19-037-526
护目镜、手套、防护服
生物安全柜
基于二氧化氯的消毒剂			Clidox
羊血琼脂平板	Medex 供应公司	HL-1160