我们介绍一种制备云母支撑脂双层用于高分辨率显微镜观察的方法。云母在原子尺度上透明且平整，但由于操作困难而很少用于成像；我们的制备方法实现了云母片的均匀沉积，并减少了脂双层制备所需的材料用量。
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本文内容
摘要
摘要
支撑脂双层（SLB）被广泛用作研究膜特性（如相分离、聚集、动力学）及其与其他化合物（如药物或肽）相互作用的模型。然而，SLB的特性会因所使用的支撑材料不同而有所差异。
用于SLB成像和测量的常用技术包括单分子荧光显微镜、FCS以及原子力显微镜（AFM）。由于大多数光学成像研究是在玻璃基底上进行的，而AFM则需要极为平整的表面（通常为云母），因此这些技术所得结果无法直接比较，因为基底材料的电荷和表面平整度会显著影响扩散行为。遗憾的是，将云母薄片切割并粘接到玻璃载玻片上所需的高度手动操作技巧，成为在SLB制备中常规使用云母的一大障碍。尽管这种方法是理想选择，但如此制备的云母表面往往不平整（呈波浪状），难以成像，尤其是使用工作距离短、高数值孔径物镜时更为困难。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于制备适用于脂质囊泡沉积和SLB制备的薄而平整的云母表面。此外，我们自制的样品腔仅需极少量的囊泡即可实现SLB形成。该整体方案能够高效、简便且低成本地制备高质量的脂双层表面，其质量可与AFM研究中所使用的表面直接相比。
引言
本实验方案的总体目标是展示一种制备云母表面的方法，用于通过光学全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜对云母支撑的脂双层（SLBs）进行高分辨率成像，该方法也可与原子力显微镜（AFM）联用。
支撑脂双层（SLBs）被广泛用作研究脂质聚集、相分离、双层组分动力学或其与肽、蛋白质及其他化合物相互作用的模型系统1-5。根据研究性质的不同，可用于形成SLB的基底材料也有所不同（例如玻璃、云母、二氧化硅、聚合物）4,6-8。典型的膜研究依赖于基于显微镜的成像技术，如全内反射荧光显微镜（TIRFM）和原子力显微镜（AFM）。因此，对于TIRFM成像而言，通常选择玻璃表面，因为玻璃具有良好的透光性。玻璃的制备相对简便，实验结果的质量主要取决于脂质囊泡沉积前对表面的彻底清洁。由于AFM具有较高的轴向分辨率，通常需要使用云母表面。云母是一种硅酸盐矿物，具有近乎完美的基底解理特性，因此新鲜解理的云母表面在原子级别上是平坦的，能够实现对膜高度差异的观测，甚至达到亚纳米尺度9。
然而，使用荧光相关光谱（FCS）、单分子示踪（SMT）和光漂白后荧光恢复（FRAP）等方法进行的扩散研究表明，脂质膜的动力学行为在很大程度上取决于其沉积的表面类型，例如玻璃和云母可能导致显著不同的结果10,11。这些差异不仅体现在膜探针的扩散系数上，还包括检测到以不同速率扩散的多个粒子亚群，以及粒子可能在不同状态之间转换的现象。
因此，除非使用相同的表面（在本例中为云母），否则利用TIRFM和AFM技术获得的结果进行直接比较通常是困难的。尽管已有少数研究在相同的云母表面上同时进行了TIRFM和AFM双层成像12,13，但云母很少用于光学显微镜观察，主要原因是其操作上的困难。云母的制备需要手工将其切割成薄片，然后使用光学胶将其粘附到盖玻片上12。然而，该方法需要一定的操作经验才能获得理想的结果。此外，所获得的表面常常不平整且较厚，难以与工作距离短、数值孔径高的物镜配合使用。
按照本方案所述方法制备的云母表面非常薄（约220 μm，包括170 μm的盖玻片厚度），且极为平整，可避免“波浪形”形变，这对于成功实现高分辨率成像至关重要。这些表面可用于全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜系统。此外，同一样品可转移至原子力显微镜（AFM）进行检测，甚至可同时与TIRFM/共聚焦显微镜和AFM联用成像。结合这两种技术，可实现扩散行为与双层膜结构之间的直接关联14。由于云母表面是 freshly cleaved（新鲜解理）的，因此表面洁净，无需耗时、重复性差且潜在危险的清洗步骤（玻璃清洗方案通常涉及piranha溶液、硫酸、氢氧化钠/氢氧化钾等化学品）。本方案中所述的小型腔室的安装，可将有效形成双层膜所需的囊泡体积减少至不足50 μl。最后，整个表面组装过程耗时较短（制备时间少于30分钟），且不需要传统云母解理和粘附所要求的高难度手工操作技能。
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方案
1. 云母和 载玻片 准备
- 将1½号（0.17 mm）盖玻片放入染色架中。
- 在60 °C下，用2%去污剂超声处理30分钟。
- 用去离子水清洗20次。
- 用镊子取出载玻片，并用压缩空气或氮气吹干。
- 用剪刀或刀片将云母片切成10 × 10 mm的正方形小片。
- 用刀片将每片云母进一步切成2–3片更薄的云母薄片。
注意：此步骤需使用锋利的刀片。
2. 云母片组装与腔室安装
- 用乙醇清洁显微镜载玻片。
- 使用光学胶将步骤1.6中切割好的云母小片粘附到载玻片上。建议使用低粘度胶水，以便更好地铺展液滴并牢固粘合云母。
- 在紫外灯下固化，10分钟。
注意：该胶水通过紫外光固化，最大吸收波长范围为350至380 nm，完全固化所需的推荐能量为4.5 J/cm2。然而，此步骤也可使用不同的光源（参见胶水供应商提供的材料）。 - 用透明胶带剥离云母表面的最外几层，暴露出新鲜洁净的云母表面。
- 在云母表面放置一小滴（约20 μm）光学胶。
注意：此步骤建议使用高粘度且自荧光水平低的胶水。我们的经验表明，结合使用低粘度胶（步骤2.2）和高粘度胶可显著提高云母剥离的效果（步骤2.7）。 - 将 freshly cleaned 盖玻片轻轻放置在胶滴上，避免产生气泡，静置1分钟。
- 在紫外灯下固化，10分钟。
注意：此步骤完成后，由载玻片、云母和盖玻片组成的三明治结构可保存相对较长时间（长达数周）。请在实际进行SLB制备前再进行下一步操作，以确保云母表面新鲜。
注意：该胶水通过紫外光固化，最大吸收波长范围为350至380 nm，完全固化所需的推荐能量为4.5 J/cm2。然而，此步骤也可使用不同的光源（参见胶水供应商提供的材料）。 - 使用手术刀，如视频所示，从侧面轻轻拆下盖玻片。大多数情况下，一层薄而平整的云母会保留在盖玻片上。粘附在载玻片上的云母可重复使用（从步骤2.4开始重复操作）。
- 通过肉眼或解剖显微镜检查表面质量，确保云母层仍附着在盖玻片上，并未在步骤2.8的剥离过程中完全脱落。用镊子或解剖针划出轻微划痕有助于区分胶水与云母，因为胶水的质地明显不同于云母。
- 取下1.5 ml小瓶盖上的橡胶密封圈，将瓶盖倒置，用光学胶或指甲油将其粘附到表面，随后分别用紫外灯固化，或静置晾干10分钟。
注意：若样品需同时用于光学成像（如TIRFM或共聚焦显微镜）与AFM成像，1.5 ml小瓶盖可能过小，无法在显微镜载物台上安装AFM探头。此时可用直径更大的塑料O型圈替代该瓶盖，以适配AFM探头的安装。若实验过程中需要在不损伤云母表面的前提下移除盖子，可用硅脂代替胶水或指甲油。
3. 支持性脂质双层（SLB）的形成
- 将新制备的脂质体溶液加入含有表面的腔室中。形成支持性脂双层（SLB）所需的最小体积约为 30 μl。
注意：有关脂质体及支持性脂双层（SLB）形成的更多细节，请参考已发表的实验方案，例如 Bag et al., 201415。 - 按照所选实验方案进行支持性脂双层（SLB）的形成。在孵育和成像过程中，可将腔室置于加热块或加热显微镜载物台上，以维持所需温度，确保所用脂质始终高于其相变温度。
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结果
荧光脂质探针在支撑脂双层（SLB）中的扩散行为因基底材料的不同而有所差异。全内反射荧光显微镜（TIRFM）结合单分子示踪（SMT）技术是一种用于可视化颗粒运动并提取其扩散系数的有效方法。附带动画图展示了鞘磷脂-ATTO647N探针在玻璃和云母表面支撑的DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱）双层膜中扩散的单分子信号。云母表面按照本文所述方案进行制备。为评估光学像差，使用Mosaic 2D PSF Size ImageJ插件16,17测量并计算了20个点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM）平均值。测得玻璃和云母的FWHM分别为441 nm和464 nm（图1）。在玻璃和云母上成像时，分辨率之间22 nm的差异并不显著。在这两种情况下，均可在连续帧中定位每个单荧光分子的PSF质心，并利用Mosaic Particle Tracker ImageJ插件16,17将其连接成随时间变化的颗粒轨迹。图2展示了颗粒在两种基底支撑的双层膜中扩散的代表性轨迹。在玻璃和云母支撑的DOPC膜中扩散的荧光探针的均方...
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讨论
本方案描述了一种制备光滑且薄云母表面的方法，用于脂双层沉积和高分辨率成像。该技术所需的手动操作技能较少，主要涉及玻璃-云母-玻璃三明治结构的小心拆解（步骤2.8），这是获得高质量云母表面的关键步骤。在此阶段必须始终检查新解理的云母表面，因为云母有可能未发生解理而直接从光学胶上脱落，暴露出部分光学胶区域。这可能导致脂双层意外沉积在胶体上而非云母表面。根据我们获得的均匀高光学成像质量判断，采用本方法制备的云母表面在绝大多数情况下与盖玻片表面平行；因此我们认为无需额外验证。
安装腔室的最后一步可根据需要进行定制。视频教程中展示使用一个1.5 ml玻璃小瓶的塑料盖作为腔室，但也可替换为任何形状相似且尺寸合适的物体，例如在同时进行原子力显微镜-全内反射荧光显微镜/共聚焦显微镜（AFM-TIRFM/共聚焦）成像时，需确保样品及其支架能够放入AFM探头中。如果使用标准的35 mm金属细胞腔室进行成像，则可跳过定制腔室的安装步骤。但在此情况下，必须使用直径为25 mm的圆形盖玻片，并且需要更大体积的脂质体溶液以形成支持性脂双层（SLB）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 浴式超声仪 | Fisher Scientific | FB15051 | |
| 盖玻片 24 × 50 mm - 无 H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III（洗涤剂） | Hellma Analytics | 320.003 | |
| 云母 V-1 级 | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| 光学胶粘剂（高黏度） | Norland Products | NOA63 | |
| 光学胶粘剂（低黏度） | Norland Products | NOA60 | |
| 鞘磷脂-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| 紫外灯 | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | 将灯设置为100%功率 |
参考文献
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