用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

摘要

我们介绍一种制备云母支撑脂双层用于高分辨率显微镜观察的方法。云母在原子尺度上透明且平整，但由于操作困难而很少用于成像；我们的制备方法实现了云母片的均匀沉积，并减少了脂双层制备所需的材料用量。

摘要

支撑脂双层（SLB）被广泛用作研究膜特性（如相分离、聚集、动力学）及其与其他化合物（如药物或肽）相互作用的模型。然而，SLB的特性会因所使用的支撑材料不同而有所差异。

用于SLB成像和测量的常用技术包括单分子荧光显微镜、FCS以及原子力显微镜（AFM）。由于大多数光学成像研究是在玻璃基底上进行的，而AFM则需要极为平整的表面（通常为云母），因此这些技术所得结果无法直接比较，因为基底材料的电荷和表面平整度会显著影响扩散行为。遗憾的是，将云母薄片切割并粘接到玻璃载玻片上所需的高度手动操作技巧，成为在SLB制备中常规使用云母的一大障碍。尽管这种方法是理想选择，但如此制备的云母表面往往不平整（呈波浪状），难以成像，尤其是使用工作距离短、高数值孔径物镜时更为困难。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于制备适用于脂质囊泡沉积和SLB制备的薄而平整的云母表面。此外，我们自制的样品腔仅需极少量的囊泡即可实现SLB形成。该整体方案能够高效、简便且低成本地制备高质量的脂双层表面，其质量可与AFM研究中所使用的表面直接相比。

引言

本实验方案的总体目标是展示一种制备云母表面的方法，用于通过光学全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜对云母支撑的脂双层（SLBs）进行高分辨率成像，该方法也可与原子力显微镜（AFM）联用。

支撑脂双层（SLBs）被广泛用作研究脂质聚集、相分离、双层组分动力学或其与肽、蛋白质及其他化合物相互作用的模型系统^1-5。根据研究性质的不同，可用于形成SLB的基底材料也有所不同（例如玻璃、云母、二氧化硅、聚合物）^4,6-8。典型的膜研究依赖于基于显微镜的成像技术，如全内反射荧光显微镜（TIRFM）和原子力显微镜（AFM）。因此，对于TIRFM成像而言，通常选择玻璃表面，因为玻璃具有良好的透光性。玻璃的制备相对简便，实验结果的质量主要取决于脂质囊泡沉积前对表面的彻底清洁。由于AFM具有较高的轴向分辨率，通常需要使用云母表面。云母是一种硅酸盐矿物，具有近乎完美的基底解理特性，因此新鲜解理的云母表面在原子级别上是平坦的，能够实现对膜高度差异的观测，甚至达到亚纳米尺度⁹。

然而，使用荧光相关光谱（FCS）、单分子示踪（SMT）和光漂白后荧光恢复（FRAP）等方法进行的扩散研究表明，脂质膜的动力学行为在很大程度上取决于其沉积的表面类型，例如玻璃和云母可能导致显著不同的结果^10,11。这些差异不仅体现在膜探针的扩散系数上，还包括检测....

方案

1. 云母和 载玻片 准备

1. 将1½号（0.17 mm）盖玻片放入染色架中。
2. 在60 °C下，用2%去污剂超声处理30分钟。
3. 用去离子水清洗20次。
4. 用镊子取出载玻片，并用压缩空气或氮气吹干。
5. 用剪刀或刀片将云母片切成10 × 10 mm的正方形小片。
6. 用刀片将每片云母进一步切成2–3片更薄的云母薄片。
   注意：此步骤需使用锋利的刀片。

2. 云母片组装与腔室安装

1. 用乙醇清洁显微镜载玻片。
2. 使用光学胶将步骤1.6中切割好的云母小片粘附到载玻片上。建议使用低粘度胶水，以便更好地铺展液滴并牢固粘合云母。
3. 在紫外灯下固化，10分钟。
   注意：该胶水通过紫外光固化，最大吸收波长范围为350至380 nm，完全固化所需的推荐能量为4.5 J/cm²。然而，此步骤也可使用不同的光源（参见胶水供应商提供的材料）。
4. 用透明胶带剥离云母表面的最外几层，暴露出新鲜洁净的云母表面。
5. 在云母表面放置一小滴（约20 μm）光学胶。
   注意：此步骤建议使用高粘度且自荧光水平低的胶水。我们的经验表明，结合使用低粘度胶（步骤2.2）和高粘度胶可显著提高云母剥离的效果（步骤2.7）。
....

结果

荧光脂质探针在支撑脂双层（SLB）中的扩散行为因基底材料的不同而有所差异。全内反射荧光显微镜（TIRFM）结合单分子示踪（SMT）技术是一种用于可视化颗粒运动并提取其扩散系数的有效方法。附带动画图展示了鞘磷脂-ATTO647N探针在玻璃和云母表面支撑的DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱）双层膜中扩散的单分子信号。云母表面按照本文所述方案进行制备。为评估光学像差，使用Mosaic 2D PSF Size ImageJ插件^16,17测量并计算了20个点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM）平均值。测得玻璃和云母的FWHM分别为441 nm和464 nm（图1）。在玻璃和云母上成像时，分辨率之间22 nm的差异并不显著。在这两种情况下，均可在连续帧中定位每个单荧光分子的PSF质心，并利用Mosaic Particle Tracker ImageJ插件^16,17将其连接成随时间变化的颗粒轨迹。图2展示了颗粒在两种基底支撑的双层膜中扩散的代表性轨迹。在玻璃和云母支撑的DOPC膜中扩散的荧光探针的均方.......

讨论

本方案描述了一种制备光滑且薄云母表面的方法，用于脂双层沉积和高分辨率成像。该技术所需的手动操作技能较少，主要涉及玻璃-云母-玻璃三明治结构的小心拆解（步骤2.8），这是获得高质量云母表面的关键步骤。在此阶段必须始终检查新解理的云母表面，因为云母有可能未发生解理而直接从光学胶上脱落，暴露出部分光学胶区域。这可能导致脂双层意外沉积在胶体上而非云母表面。根据我们获得的均匀高光学成像质量判断，采用本方法制备的云母表面在绝大多数情况下与盖玻片表面平行；因此我们认为无需额外验证。

安装腔室的最后一步可根据需要进行定制。视频教程中展示使用一个1.5 ml玻璃小瓶的塑料盖作为腔室，但也可替换为任何形状相似且尺寸合适的物体，例如在同时进行原子力显微镜-全内反射荧光显微镜/共聚焦显微镜（AFM-TIRFM/共聚焦）成像时，需确保样品及其支架能够放入AFM探头中。如果使用标准的35 mm金属细胞腔室进行成像，则可跳过定制腔室的安装步骤。但在此情况下，必须使用直径为25 mm的圆形盖玻片，并且需要更大体积的脂质体溶液以形成支持性脂双层（SLB）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
浴式超声仪	Fisher Scientific	FB15051
盖玻片 24 × 50 mm - 无 H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III（洗涤剂）	Hellma Analytics	320.003
云母 V-1 级	SPI Suppliers	1872-CA
光学胶粘剂（高黏度）	Norland Products	NOA63
光学胶粘剂（低黏度）	Norland Products	NOA60
鞘磷脂-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
紫外灯	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	将灯设置为100%功率