应用荧光纳米颗粒研究细胞内细菌对内体-溶酶体系统的重塑

摘要

本文介绍了纳米颗粒（NPs）的合成及其荧光标记方法。这些纳米颗粒被用于脉冲-追踪实验，以标记真核细胞的内体-溶酶体系统。通过活细胞成像并进行定量分析，追踪了胞内病原体Salmonella enterica对内体-溶酶体系统的调控作用。

摘要

具有理想化学、光学和机械性能的荧光纳米颗粒（NPs）是标记细胞内细胞器的有力工具。本文介绍一种利用金-BSA-罗丹明纳米颗粒标记真核细胞内溶酶体系统，并监测胞内病原体对宿主细胞通路调控作用的方法 沙门氏菌肠炎亚种纳米颗粒被HeLa细胞迅速内化，并定位于晚期内体/溶酶体中。 沙门氏菌 感染诱导囊泡重排及纳米颗粒在其中的聚集 沙门氏菌-诱导膜结构。我们使用 Imaris 软件包对共聚焦显微镜图像进行定量分析。未感染细胞中的物体数量及其大小分布与感染细胞中的明显不同。 沙门氏菌-感染细胞，表明野生型病毒对内体-溶酶体系统造成了极度重塑 沙门氏菌.

引言

荧光纳米颗粒（NPs），包括金属纳米颗粒、量子点、聚合物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、碳点 等等。在过去的几十年中，引起了广泛关注^1,2与传统有机染料相比，荧光纳米颗粒表现出理想的化学、光学和机械性能，例如信号强度高、抗光漂白性强以及生物相容性高。^3,4这些优势使它们成为细胞内传感和活细胞成像的首选方法。此外，多种电子致密纳米颗粒在电子显微镜（EM）下可见，便于用于关联显微分析，从而可将活细胞示踪与光学显微镜（LM）相结合，并利用EM在超微结构水平上实现更高分辨率的观察⁵例如，金纳米颗粒长期以来被高效地用作活细胞中的生物传感器，以实现高灵敏度的诊断，同时也广泛应用于免疫标记领域。⁶近期研究表明，不同尺寸和形状的金纳米颗粒可被多种细胞系有效摄取，并常规通过内体途径转运，因此在细胞内囊泡运输示踪及内体-溶酶体系统标记方面具有巨大应用潜力^7,8.

微生物病原体，例如 鼠伤寒沙门氏菌, 志贺氏菌 flexneri 和 单核细胞增生李斯特菌，已进化出不同的机制以侵入非吞噬性宿主细胞⁹病原体被内化后，无论存在于细胞质中还是被隔离在膜结合区室内，都会与其宿主环境广泛相互作用，并调控这些环境以利于自身的存活。¹⁰例如， 肠道沙门氏菌 存在于并复制于一种称为胞内吞噬体区室的结构中 沙门氏菌含液泡（SCV）在感染过程中¹¹成熟的 SCV 向高尔基体运输，持续与内吞途径相互作用，并诱导形成广泛的管状结构，例如 沙门氏菌诱导的细丝（SIF）、分选连接蛋白小管 沙门氏菌诱导的分泌载体膜蛋白3（SCAMP3）小管， 等等。^12-14研究这些细菌病原体如何操控宿主细胞通路，对于理解传染病至关重要。

本研究中，采用金-牛血清白蛋白-罗丹明纳米颗粒（gold-BSA-rhodamine NPs）作为流体示踪剂标记宿主细胞的内体-溶酶体系统，并以人胃肠道病原体肠炎沙门氏菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium，简称Salmonella）作为模式细菌，研究该病原体与宿主内吞途径的相互作用。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对未感染细胞以及感染了野生型Salmonella或突变株的细胞中的胞内金-BSA-rhod明纳米颗粒进行成像。随后使用Imaris软件定量分析纳米颗粒的分布情况，结果表明Salmonella感染可诱导内体/溶酶体发生显著重排。在本方法描述的基础上，可设计类似实验以追踪内化纳米颗粒的长期命运，并探究各种外源物质或内源因子对真核细胞内吞途径的影响。

方案

1. 10 nm 金纳米颗粒（Gold NPs）的合成¹⁵

1. 制备溶液A：将2 ml 1%的氯化金水溶液加入160 ml Milli-Q水或重蒸馏水中。
2. 制备溶液B：将8 ml 1%的三钠柠檬酸盐·2H₂O溶液和160 µl 1%的单宁酸溶液加入32 ml Milli-Q水或重蒸馏水中。
3. 将溶液A和溶液B加热至60 °C，边搅拌边混合。立即观察到深蓝色，约15分钟后变为红色。随后升温至95 °C，保持5分钟，然后冷却至室温。
4. 将一滴纳米颗粒悬浮液滴加到碳支持膜载网上，空气中自然晾干。通过透射电子显微镜观察纳米颗粒的尺寸和形貌。

2. 采用牛血清白蛋白（BSA）包被金纳米颗粒并使用罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）进行标记¹⁶

1. 取900 μl金纳米颗粒（gold NPs）加入1.5 ml离心管中，在15,000 × g条件下离心30分钟。可选：可同时准备多个样品管。
2. 弃去上清液，将沉淀用900 μl灭菌的Milli-Q水重悬，并加入100 μl浓度为2 mg/ml的BSA/PBS溶液，在涡旋振荡器上以800 rpm混合30分钟。
3. 为去除过量BSA，将样品在15,000 × g条件下离心60分钟。
4. 弃去上清液，将金-BSA纳米颗粒用125 μl PBS重悬，再加入12.5 µl的1 M碳酸氢盐缓冲液。
5. 使用前立即配制10 mg/ml的罗丹明NHS/DMSO溶液，取30 µl该溶液加入1 ml金-BSA纳米颗粒悬液中。在室温下以800 rpm持续混合反应2小时（或过夜），避免光照。
6. 将金-BSA-罗丹明纳米颗粒在4 ºC条件下用PBS进行透析纯化，36–48小时内更换缓冲液5次。
7. 为稳定纳米颗粒，向每1 ml金-BSA-罗丹明纳米颗粒中加入10 μl浓度为200 mg/ml的BSA/PBS溶液。为去除游离或未结合的BSA-罗丹明，于15,000 × g离心60分钟。将沉淀重悬于2 mg/ml BSA/PBS溶液中，测定OD₅₂₀，并在4 °C避光保存。
8. 用Milli-Q水或双蒸水将纳米颗粒稀释10倍，取一滴样品滴加至碳支持膜铜网上，自然晾干。通过透射电子显微镜（TEM）检测纳米颗粒的粒径与形貌。
   注意：纳米颗粒制备过程中所用所有材料均经过灭菌处理，操作在细胞培养超净台内或火焰旁的实验台上进行。

3. 培养 HeLa 细胞

1. 表达 LAMP1-GFP 的 HeLa 细胞在含 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基中培养，并于含 5% CO₂ 的环境中 37 °C 培养。
2. 将细胞以每孔 50,000 的密度接种至 8 孔腔室载玻片（Ibidi）中，过夜培养。

4. 细菌培养

1. 使用 肠道沙门氏菌 血清型 鼠伤寒沙门菌 NCTC 12023 野生型（WT）菌株。作为对照，使用突变菌株 ΔssaV SPI2-T3SS 缺陷及 ΔsifA 缺乏SIF形成所需的关键效应蛋白SifA。使用含有质粒pFPV25.1的菌株以实现增强型GFP的组成型表达。
   注意：细菌菌株常规培养于添加50 µg/ml羧苄青霉素的Luria-Bertani培养基（LB）中（WT），或添加50 µg/ml羧苄青霉素和/或50 µg/ml卡那霉素的LB培养基中（ΔssaV，ΔsifA) 维持质粒所需。
2. 接种单个细菌菌落于含适当抗生素的3 ml LB培养基中，37 ºC、振荡条件下过夜培养以实现通气，然后按1:31比例转接至新鲜LB培养基中继续培养3.5小时。此时，菌液达到对数生长后期，细菌具有高度侵袭性。使用“滚筒式培养转盘”可方便地对试管培养物进行通气孵育。

5. 感染HeLa细胞 沙门氏菌 金-BSA-罗丹明纳米颗粒脉冲追踪标记（示意图见图1）

1. 测量继代培养细菌的OD₆₀₀，用1 ml PBS稀释至OD₆₀₀ = 0.2（约3 × 10⁸ cfu/ml），按感染复数（MOI）为100的比例将适量细菌加入8孔腔室载玻片中的HeLa细胞中。
2. 在细胞培养箱中孵育30分钟，用PBS洗涤3次以去除未被内化的细菌（此时间点定义为感染后0小时，即0 hr p.i.）。加入300 µl含100 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，继续孵育1小时。随后更换为含10 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，并在后续孵育期间维持该浓度。
3. 在含100 µg/ml庆大霉素的培养基中孵育1小时后，更换为成像培养基（不含FCS、L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠的Eagle's MEM，添加30 mM HEPES，pH 7.4），其中含10 µg/ml庆大霉素。向HeLa细胞中加入金-BSA-罗丹明纳米颗粒（Gold-BSA-rhodamine NPs），使其终浓度达到OD₅₂₀ = 0.1。
   注意：Gold-BSA-rhodamine NPs也可在感染前或感染后不同时间点加入细胞。
4. 孵育1小时后，移除培养基，用PBS洗涤3次，再加入300 µl含10% FCS和10 µg/ml庆大霉素的新鲜成像培养基，继续后续孵育。
   注意：孵育时间可根据纳米颗粒浓度和所用细胞系的不同而调整。对于RAW264.7巨噬细胞，我们观察到在OD₅₂₀ = 0.05的浓度下孵育30分钟即可实现充分的内化。

6. 成像

1. 使用共聚焦成像系统（如带有加湿环境腔室的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或转盘（SD）显微镜），在不同时间点进行高分辨率成像。
2. 开启温控系统，并等待其温度稳定。优化成像参数，如放大倍数、扫描速度、分辨率、Z轴步进等。针对GFP和金-BSA-罗丹明纳米颗粒（NPs），设置合适的激发/发射波长。本方案中，采用400 Hz的扫描速度、512 × 512像素的分辨率以及0.25 µm的Z轴步长。分别使用Ar激光器（488 nm）激发GFP，HeNe激光器（543 nm）激发金-BSA-罗丹明。同时加入明场（BF）通道以观察细胞形态。对于其他显微系统或感染条件，需相应调整参数。
   注意：使用相同的Ar激光器作为明场通道的光源，信号由光电倍增管（PMT）检测器接收。
3. 在指定的感染后时间点，将含有感染细胞的8孔腔室载玻片置于显微镜载物台上，采集图像。

7. 图像分析

1. 使用显微镜图像分析软件（参见 材料与设备表) 用于分析细胞内病原体对内体-溶酶体系统的重塑作用 沙门氏菌单击“打开”并选择文件以打开数据。
   注意：也可使用 ImageJ 或 FIJI 等开源软件包进行定量图像分析。
2. 在 Surpass 视图的对象工具栏中，单击图标 添加新的表面项。单击 （下一步）。
3. 为分析感兴趣区域（ROI），请选择并划分一个ROI。在查看区域中，图像上叠加的矩形边框部分表示该ROI。在对应的x、y和z字段中输入数值，或直接点击预览矩形中的箭头以调整ROI的大小和位置。然后点击 （下一步）。
4. 作为源通道，选择通道3（金-BSA-罗丹明纳米颗粒信号）。勾选平滑选项以设置结果区域的平滑程度。可手动定义数值，或接受系统自动生成的数值。在阈值设置中，选择绝对强度选项。
5. 对于阈值调整，选择手动选项并设置数值。在查看区域中，将以灰色显示表面阈值的预览。
6. 在“分类表面”选项卡中，可根据各种条件对生成的表面进行筛选。默认筛选条件为“体素数量” >10’，也可通过点击“添加”来加入其他筛选条件。如果无需筛选，则点击删除按钮移除所有筛选条件。点击 （下一步）。
7. 完成表面创建后，单击 （完成）。在对象列表中，取消勾选“Volume”项目，新创建的表面将显示在视图区域中。
8. 导出统计数据。现在，在Surpass视图中，受试者的颜色根据其面积从紫色到红色变化。而“Plot Numbers Area”表格则显示了统计信息（例如， ID 编号和对象面积）。单击将表面 1 的所有统计结果导出至 Excel 文件 （保存）。

结果

通过柠檬酸钠和单宁酸还原氯金酸这一成熟方法制备了金纳米颗粒（NPs）。如图2A所示，所合成的金纳米颗粒呈准球形，尺寸约为10 nm。BSA包覆和罗丹明标记未对其形貌或尺寸产生影响（图2B）。

已有报道称，金纳米颗粒（NPs）可被多种哺乳动物细胞迅速摄取，并最终进入内吞系统⁷。与先前研究一致，在HeLa细胞与金-BSA-罗丹明纳米颗粒共孵育1小时后，观察到明显的红色荧光信号（图3，WT 感染后5小时），表明纳米颗粒被细胞有效内化。大多数红色信号与绿色信号共定位，显示纳米颗粒被限制在晚期内体或溶酶体中。然而，与未感染细胞中纳米颗粒在晚期内体/溶酶体中的均匀分布不同（图3，模拟感染组），在野生型Salmonella感染的细胞中，其分布位置发生了显著重排。在感染早期（图3，WT 感染后5小时），Salmonella在SCV内复制，同时SIF发生快速延伸或收缩运动。在...

讨论

哺乳动物细胞的内体-溶酶体系统调控着多种重要的生理过程，包括营养吸收、激素介导的信号转导、免疫监视以及抗原呈递¹⁷。迄今为止，已有多种标记物被用于内吞途径的标记和示踪研究。例如，LysoTracker探针是由Molecular Probes（Life Technologies，美国）开发的一类荧光酸嗜性探针，可用于溶酶体标记，其能够在细胞内低pH区室中选择性积累，并在纳摩尔浓度下有效标记活细胞¹⁸。然而，LysoTracker探针与细胞长时间孵育可能引起溶酶体pH升高，从而导致溶酶体潜在的生理变化¹⁹。一些大分子生物分子，如荧光标记的葡聚糖，也常被用于内体/溶酶体的标记。但其光稳定性差、循环寿命短以及固定过程中保留效果不佳，限制了其在长期活细胞成像和相关显微镜研究中的应用^16,19。本研究中，采用金-BSA-罗丹明纳米颗粒（gold-BSA-rhodamine NPs）作为流体示踪剂来标记宿主细胞的内体-溶酶体系统，观察到高效的摄取效率和强烈的细胞内荧光信号。纳米颗粒与溶酶体相关膜蛋白LAMP1（在晚期内体/溶酶体膜上高度富集）几乎完全共定位，证实了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯金酸	Sigma-Aldrich	520918
单宁酸	Sigma-Aldrich	403040
三钠柠檬酸盐	Sigma	C8532
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
NHS-罗丹明	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
庆大霉素	Applichem	A1492
卡那霉素	Roth	T832
羧苄青霉素	Roth	6344
8孔细胞培养板	Ibidi	80826	经组织培养处理，无菌
Imaris 软件	Bitplane	version 7.6	提供多种配置