热切片法：生理温度下急性成年脑切片技术 关键词：脑切片，急性切片，生理温度，成年脑组织，电生理记录，神经元活性，组织活力，切片制备

摘要

本文介绍一种在生理温度下制备急性脑片的方法，该方法使用常规的生理溶液进行切割，无需对切割溶液进行特殊改良（例如添加蔗糖），且在制备脑片前无需对动物进行心脏灌注。

摘要

本文介绍了一种制备急性脑切片的实验方案。该步骤是膜片钳电生理实验中的关键环节，很大程度上决定了实验结果的质量。研究表明，在切片过程中省略冷却步骤有助于获得更健康的切片和细胞，尤其是在处理来自成年动物的高度髓鞘化脑区时。尽管升温如何支持神经细胞健康的精确机制尚不明确，只能进行推测，但合理推测是，只要条件允许，切片操作的温度应尽可能接近生理状态，以避免与温度相关的假象。该方法另一个重要优势在于操作简便，因而准备时间较短。本演示中使用成年小鼠，但该方法同样适用于幼龄小鼠以及大鼠。此外，后续膜片钳实验是在小脑水平切片上进行的，但该切片方法也可应用于其他切面以及其他脑后部区域。

引言

所介绍方法的目的是获得高质量的急性脑切片，用于 体外 电生理实验，尤其是在使用成年或老年动物时。

Skrede 和 Westgaard¹ 用两个简洁的句子描述的急性脑切片方法，已成为现代神经科学研究的基础之一，并在全球范围内被广泛采用，衍生出无数种变体。切片的质量体现在每片中存活神经元的数量、细胞保持其电生理和形态学特性的持续时间，以及组织结构的完整性。此外，稳定记录的最长时间也取决于切片的质量。因此，在过去的数十年中，各研究团队对原始切片方法进行了进一步改进，以提高切片切割后的恢复能力^2-10，这些改进通常涉及切割液或恢复液成分的复杂调整（例如添加抗坏血酸、硫脲甚至 H₂O₂），以及对动物进行心脏内预灌注低温生理溶液。

最近的研究表明¹¹，切片过程中维持生理温度似乎比降温更有利于神经元的健康；在使用成年（2–8个月）啮齿类动物时，这种改善尤为显著。避免剧烈的温度变化可防止因细胞内依赖温度的过程（如可塑性¹³和离子通道动力学^13,14）所导致的人为假象。这类变化可能影响膜电位和细胞内钙信号、动作电位阈值以及动作电位波形。

本文介绍的“热切”急性脑片制备方法是一种通用方案，可用于从大鼠和小鼠的任何脑区获取高质量的急性脑切片，包括小脑、大脑皮层和海马、脑干核团¹⁶以及嗅球。

值得注意的是，生理温度切片操作要求切割刀片几乎完全水平地振动，且不能有任何结构缺陷。这种精度在较旧的切片仪型号上可能难以实现；在此类情况下，我们建议在极低温条件下进行切片制备，因为低温似乎能使组织对机械损伤更具抵抗力，尽管这可能以代谢异常为代价。

方案

本方案中描述的所有实验操作均经希伯来大学动物护理与使用委员会批准。

1. 制备切片所需的溶液和工具

1. 配制含有表1所述离子的1 L标准生理溶液（SPS）。
   1. 提前配制储备液：将盐类（NaCl、KCl、KH₂PO₄ 和 MgSO₄）按最终浓度的10倍溶解于盛有1,000 ml去离子水（电导率为0.055 µS/cm）的储存玻璃瓶中，搅拌至完全溶解。将储备液储存于4 °C环境中。
   2. 在实验当天配制最终SPS溶液：取100 ml储备液加入700 ml纯化水中，使用磁力搅拌子溶解葡萄糖（3.6 g）和NaHCO₃（2.18 g），然后加纯化水定容至1 L。
   3. 用95% O₂ / 5% CO₂气体平衡溶液约20分钟，随后加入2 ml 1 M CaCl₂溶液。
2. 准备以下工具（图1）。
   1. 准备用于断头的大剪刀或其他工具、用于打开颅骨的小型手术剪、用于抬起颅骨以暴露脑组织的尖头镊子、带刀片的解剖刀用于切取所需脑区，以及用于操作已分离脑组织的小刮勺。
   2. 此外，准备若干小块滤纸用于吸除脑组织表面多余液体，两个小型培养皿用于盛放待解剖的脑组织，两个500 ml玻璃烧杯分别盛放温热的纯化水和SPS溶液，以及用于将脑组织固定在切片台上的氰基丙烯酸盐胶水。
   3. 准备一把小刷子用于切片过程中的组织操作，以及一支宽口玻璃巴斯德吸管用于将切片从切片浴槽转移至恢复室。对所有工具进行消毒以防止细菌在温热的切片浴中生长，并始终佩戴洁净的实验手套。
3. 准备一个如Gibb和Edwards¹⁵所述的浸没式切片恢复室。持续用95% O₂ / 5% CO₂气体对其中的SPS溶液进行通气，并维持温度在36 °C。确保通气过程中不会产生滞留在浴槽中的微小气泡，以免损伤切片。
4. 将约300 ml SPS溶液置于加热板（带磁力搅拌器）或水浴中加热至36 °C。若使用加热板，需注意防止溶液过热导致离子沉淀。一旦发生沉淀，应重新配制新鲜SPS溶液，而非冷却已沉淀的旧溶液。
5. 使用电热水壶将约500 ml纯化水煮沸，随后在烧杯中将其中300 ml与冷水混合，得到略高于切片温度的温水。此温水用于断头操作，剩余沸水则后续用于维持切片浴槽的生理温度。
6. 通过腹腔注射0.1 ml戊巴比妥钠（60 mg/ml）对小鼠进行麻醉。数分钟后检查动物是否对强烈的脚趾或尾部夹捏无反应，以确认其感觉丧失。

2. 解剖大脑

1. 使用大剪刀在颅骨后部附近剪断小鼠颈部，迅速将其头部离体，并让头部落入盛有温热纯化水的烧杯中，以冲洗掉多余的血液。
2. 在颈部肌肉和皮肤下方暴露枕骨大孔，必要时可用小剪刀去除更多颈部组织。
3. 牵拉颅顶皮肤，以便清晰观察颅骨缝线，为打开颅骨提供解剖引导。
4. 将小剪刀的下端尖部从枕骨大孔插入，立即转向侧方，沿顶骨外侧边缘轻轻剪开，直至眼球后方及额顶缝位置；随后转向颅骨中线，沿中线剪至对侧颅骨（见图2A中的绿色虚线）。
5. 使用尖头镊子从额顶缝角处抬起颅骨，以对角线方向向上并侧向牵拉，以暴露脑组织（见图2A中的黄色虚线箭头）。确保颅骨未与头部任何骨骼或皮肤相连，以便在抬起颅骨时脑组织保持原位。若脑组织随颅骨移动，应使用小剪刀剪断颅骨与脑之间的结缔组织。
6. 脑组织暴露后，应避免其干燥。因此，后续操作应在盛有温热、通氧的SPS溶液的培养皿中进行，保持颅骨和脑组织浸没其中。
7. 使用解剖刀和刮匙将用于实验的脑区从其余脑组织上分离。若使用小脑，则通过中脑和脑桥进行一次切割（沿图2B-D中的红线），将小脑与前脑分离，并将其转移至含有新鲜通氧SPS溶液的小培养皿中。
8. 去除脑干部分，以便在水平切片时为将脑组织粘附于切片台提供平整且宽阔的基底。将小脑短暂放置于湿润的滤纸片上，使从前脑分离的切面朝下。
   1. 使用解剖刀切除脑干以形成基底（如图2B中的蓝色线所示），然后将小脑放回SPS溶液中。若需进行其他切面方向的切片，则相应修剪小脑组织块（见图2C & D中的蓝色线）。

3. 脑组织切片

1. 在切片台上滴加少量超级胶水之前，确保切片台表面干燥。
2. 使用刮铲从SPS中取出脑组织块，确保正确的一面朝上，并用小块滤纸吸去脑组织表面多余的液体。然后，将脑组织从刮铲上一次性滑入切片台中央的胶滴上。
3. 为防止脑组织干燥以及胶水沿组织边缘爬升，用巴斯德移液管滴加数滴SPS，并将切片台放入切片室中。调整脑组织块的位置，使感兴趣区域（例如，小脑皮层）朝向刀片，从而在被切片前受到最小程度的机械压力。
4. 按照仪器制造商的说明进行切片，同时持续向切片室中的SPS通气，并将温度维持在34–37 °C。通过向切片机外部腔室中加入温热的纯化水，并在温度过低时及时更换，以保持切片室温度在此范围内。
   注意：切片参数需根据所研究的不同组织类型和神经元类型通过实验确定。使用Campden SMZ 700切片机配合陶瓷刀片对小脑高尔基细胞进行切片时，建议设置振动振幅为0.75 mm、频率为65 Hz、推进速度为0.05 mm/sec；而对于小脑核团神经元，则建议使用更高的振幅和频率（分别为1 mm和90 Hz）以及更慢的推进速度（0.01–0.02 mm/sec）。对于小脑高尔基细胞和小脑核团神经元，切片厚度均应为300 µm。
5. 切片过程中，应避免切片发生折叠。可通过使用软毛刷轻轻支撑切片来防止此情况，最好仅接触实验中不感兴趣的区域。注意避免毛刷触碰振动切片机的刀片；尤其是陶瓷刀片，即使轻微接触也可能造成损伤。
6. 使用宽口、火焰抛光的玻璃巴斯德移液管，将每一片切片从切片室转移至恢复/孵育室中。
7. 在开始实验前，让切片在孵育室中静置至少1小时。这有助于受损或正在死亡的组织和细胞降解，从而获得更清洁的切片表面。在最初1小时内，保持孵育室中SPS的温度在34–36 °C范围内；确保切片不接触气泡，以免损伤切片或导致其漂浮。

4. 实验

1. 1小时后，让恢复室温度降至室温（17–25 °C）。
   注意：这可能会通过减缓细菌生长以及细胞代谢来延长脑片的可用时间。该时间取决于脑区和细胞类型。例如，某些类型的高尔基细胞在切片后8小时仍可保持健康状态，而其他类型则仅能维持6小时。
2. 切片后1小时，即可使用脑片进行各种电生理学实验。

结果

以所述方式制备的脑片可用于多种电生理学和光遗传学实验。图3A和3C分别展示了在微分干涉（DIC）光学下观察到的代表性小脑水平切片和大脑皮层冠状切片。在小脑切片中，多种类型的小脑神经元可根据其位置和胞体形态被轻易识别，从而实现靶向电生理记录。图3B和3D展示了从小脑颗粒细胞层自发活跃的戈尔吉细胞（Golgi cell）和皮层锥体细胞进行全细胞膜片钳记录（电流钳模式）的示例轨迹。有关从热切脑片获得的电生理和光遗传记录质量的更多示例，可参见Huang和Uusisaari¹¹以及Lefler et al.¹⁶。

浓度 ...

讨论

我们展示了一种在生理温度而非冰冻温度下制备小鼠急性脑切片的方法。

已有研究表明¹¹，只要切片刀的垂直振动最小，温暖条件下获得的脑片质量优于低温条件下制备的脑片。在生理温度下进行切片可避免由低温引起的生理假象，例如与代谢过程改变相关的假象^17-19，这些改变可能表现为单细胞以及神经网络活动的异常。此外，尽管切片过程显然应避免不必要的延迟，但并无必要匆忙完成切片（这与在冰冻条件下切片不同，后者需在溶液温度升高前尽快完成切割，并防止组织长时间冷冻造成的损伤）。因此，可以采用较慢的切削速度，这对于切割非常精细的结构尤其有利。最后，省去对灌流液和脑组织的冷却步骤，可显著缩短实验所需时间并降低操作复杂性。将溶液冷却至冰冻温度比将其加热至生理温度大约多需40分钟 ，省去该步骤可为实验本身留出更多时间。

已有研究表明²⁰，在 GAD67-GFP 小鼠中，于 20 °C 下制备的脑片相比在 0 °C 下制备的脑片，其皮层神经元的荧光强度更强。这进一步支持了在冰冻温度下切...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	CTS	170066	浓度：60 mg/ml，溶于生理盐水中。
大剪刀	FST	14001-16	可用于断头的工具包括任何大型剪刀或具有足够锋利刃口的断头器
眼科剪	Prestige medical	48,148	可使用任何尖头精细剪刀，但剪刀刀刃长度不得超过1.5–2 cm
精细镊子	FST	11254-20
手术刀	FST	91003-12
11号手术刀片	FST	10011-00
小刮勺	Fisher	2350
滤纸			可使用任意实验室品牌的滤纸。
培养皿	Duroplan	Z231509-1
玻璃烧杯	SCHOT	10022846
巴斯德移液管	Maple Leaf Brand	14672-029
超级胶水	LOCTITE	4091361/1
切片机	Campden	7000-smz
陶瓷切片刀片	Campden	7550-1-C
磁力加热搅拌器			用于在操作过程中加热SPS溶液
电热水壶			用于加热水以实现温度控制
切片回收室 + 加热装置	Warner instruments	BSC-HT +  BSC-BUW	也可使用自制型号。
温度计			用于在解剖和切片过程中监测SPS的温度