人体大隐静脉操作步骤 离体 灌注与外部加固

摘要

导致内膜增生（IH）和静脉移植物失效的机制仍不甚清楚。本研究描述了一种在可控血流和压力条件下灌注人静脉的ex vivo系统，并进一步评估了外部网状加固限制IH发展的有效性。

摘要

目前治疗广泛闭塞性动脉疾病的主要手段是静脉旁路移植术。然而，其长期通畅性常受到内膜增生（IH）的威胁，最终导致血管闭塞和移植物失效。机械力，特别是低剪切应力和高血管壁张力，被认为会启动并维持这些细胞和分子层面的变化，但其确切作用机制仍有待阐明。为了选择性评估压力和剪切应力在IH生物学过程中的作用，研究人员建立了一种ex vivo灌注系统（EVPS），用于在动脉条件下（高剪切应力和高压力）灌注人隐静脉节段。进一步的技术改进使得同一根静脉的两个节段可同时进行灌注，其中一个节段外部加装网状支撑结构。静脉采用“无接触”技术获取后，立即转移至实验室并组装到EVPS中。其中一段新分离的静脉不进行灌注（对照组，第0天），另外两段则进行最多7天的灌注，其中一段完全包裹直径为4 mm的外部网状结构。压力、流速和脉搏频率被持续监测并调节，以模拟股动脉内的血流动力学环境。灌注结束后，取出静脉组织用于组织学和分子分析。在ex vivo条件下，高压力灌注（动脉压，平均值 = 100 mm Hg）足以诱导人静脉的内膜增生及血管重塑，而外部聚酯网状结构的存在可减轻这些改变。

引言

心血管疾病是西方国家发病率和死亡率的首要原因¹。尽管血管内治疗技术已取得进展，旁路手术仍是当前治疗的主要手段，因此在美国每年进行超过50万例静脉移植手术。然而，尽管已有数十年的研究，30%至60%的下肢静脉移植物在术后最初几年内发生失败，其主要原因为内膜增生（IH）²。机械力，特别是低剪切应力（SS）和高血管壁张力，在这一增生反应的启动和发展过程中起着关键作用^3,4。为解决这一问题，研究人员开发了一种ex vivo静脉灌注系统（EVPS），用于在严格控制的血流动力学条件（压力和剪切应力）下研究人隐静脉的行为。本研究发现，在植入类似动脉的循环环境后，高压（平均值 = 100 mm Hg）足以刺激平滑肌细胞增殖并迁移至内膜层，从而引发内膜增生（IH）⁵。

哺乳动物研究已表明，使用外部加固是一种有效的方法，可为“动脉化的静脉”提供支撑，并抵消静脉植入动脉环境后所面临的急性血流动力学变化。这种网状结构可防止静脉过度扩张，增加剪切应力，降低管壁张力，从而减少内膜增生^6-10。然而，其潜在机制以及在改善人体静脉旁路通畅性方面的适用性尚未完全阐明。本研究采用人静脉灌注系统（EVPS），在模拟静脉植入动脉环境后所经历的变化（高剪切应力和高压）条件下，比较了大隐静脉在有无外部多孔聚酯管状网状结构时的行为表现。通过抑制病理性重塑和内膜增生，该网状结构显示出其潜在临床有效性的证据¹¹。

本研究1）介绍了一种模型 ex 体内 在受控压力和剪切应力下人隐静脉灌注2）表明，外部大孔聚酯网可减轻内膜增生，并为其潜在的临床应用提供关键信息。

方案

洛桑大学伦理委员会批准了本实验，该实验符合1975年《赫尔辛基宣言》所规定的原则，并遵循1983年修订版关于人类组织使用的相关规定。

1. 人体大隐静脉采集

1. 从因缺血接受下肢旁路手术的患者身上获取非曲张的人类大隐静脉多余节段。在手术室中，用碘溶液对整个下肢进行消毒，并铺巾以暴露从腹股沟至足部的腿部区域。
2. 从腹股沟至膝盖做一条正中切口（保留间断的皮肤部分）。
3. 连同周围组织蒂一起采集大隐静脉（无触碰技术）。使用4-0丝线结扎静脉的侧支。立即保存至少一段长度不小于9 cm、外径为2.5–4 mm的大隐静脉多余节段，将其置于4 °C的含12.5%胎牛血清的RPMI-1640 Glutamax培养基中，并运送至实验室。

2. EVPS 设计

1. 组装 图1 所示的通用设备。对所有设备进行高压灭菌，并在无菌条件下保存所有组件。此外，确保系统防水，且不会将化学物质泄漏到培养基中。盖子使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA-GS），静脉支撑材料使用不锈钢（X5 Cr Ni 18 10）和聚甲醛塑料（POM）。
2. 根据所需几何形状设计灌注腔，以便放置静脉并实现连接。确保深度（或若采用圆柱形结构则为半径）至少为 2.5 cm，以允许血管最小程度的弯曲和扩张，同时确保培养基能够持续覆盖血管（图1）。密封是一个关键问题，因此采用矩形 PMMA-GS 结构。
3. 根据所需几何形状设计静脉支撑结构。为避免静脉扭曲或过度扩张，应通过推拉方式实现长度调节（不可使用螺钉，否则静脉会随螺钉旋转而扭曲）。
   注：此处使用一根完整的钢杆，通过两个滑动的 L 形部件连接，以支撑两个静脉圆筒（直径 5 mm，适配血管）及静脉本身（图1B 和 图2）。
4. 设计压力柱，使施加于系统的“静息压力”满足公式：p = 0-10 = h × ρ × g，其中 p 为压力（N/m²，Pa），h 为液柱高度（m），ρ 为液体密度（kg/m³），g 为重力常数（9.81 m/sec²）。设计四个从上至下的连接管道：用于施加压力、流出（来自静脉）、流入（进入静脉）以及更换培养基。
5. 准备培养基。根据先前研究^5,11-14，选择 RPMI-1640 培养基，添加 Glutamax、12.5% 胎牛血清和 1% 抗生素-抗真菌溶液（含 10,000 U/ml 青霉素 G、10 mg/ml 硫酸链霉素、25 mg/ml 两性霉素 B 和 0.5 μg/ml 庆大霉素）。剪切应力（SS）由公式 SS = 4μQ/πr³ 计算，其中 Q 为流速（ml/sec），r 为静脉段半径（cm），μ 为灌注培养基的黏度。
   1. 通过添加 70 kDa 右旋糖酐调节黏度以调控剪切应力。使用黏度计测量黏度。此处添加 8% 的 70 kDa 右旋糖酐，使 SS 达到 9–15 dyn/cm²。
6. 设置齿轮泵，产生每分钟 60 次脉冲、振幅恒定的心搏样脉动信号，生成 150 ± 15 ml/min 的单向流动，该流速独立于系统施加的压力，并由计算机控制。确保驱动软件集成对压力、流速、脉率和信号的持续采集与监测。如需要，可使用第二个泵（非同步）产生非层流、湍流状态。

3. EVPS 装配（图 1）

1. 开始前，确保所有设备均处于无菌状态。所有后续操作均须在超净工作台内无菌条件下进行。
2. 将血管置于盛有培养基的培养皿中，使用手术刀片将血管切成三个等长的节段。
3. 立即用 PBS 冲洗其中一个节段。将该节段再分为三部分：其中一份用福尔马林固定，用于形态学测量；其余两份分别冻存，用于定量转录本（RT-PCR）和蛋白质（Western blot）分析。将这些节段视为对照组，即未灌注的静脉组织。
4. 使用其余两个节段进行灌注。
   1. 非常轻柔地向静脉内注入培养基，以确定正常的血流方向；若存在瓣膜，则静脉方向为逆向。
   2. 静脉的密封对实验成功至关重要。检查是否存在侧支漏液，并使用6-0丝线缝合封闭任何漏点。
5. 将静脉节段逐端连接于两个金属圆筒之间（2.3，图1）。使用Ethibon 3-0缝线在圆筒的凹槽处固定圆筒（图1A和B）。
   1. 将整个静脉节段放入预先加满培养基的灌注腔室中。对第二个节段重复相同操作。
      注意：若静脉与圆筒之间密封不严，将导致漏液，需重新干预处理，并显著增加感染和实验失败的风险。
6. 为对第二个节段进行加固（加装网状支架），先将两个金属圆筒（连同附着的静脉）从L形部件上拆下（2.3和图1）。
   1. 操作需轻柔，避免任何器械接触静脉。先将网状支架滑过圆筒，再套入静脉。通过推拉抖动的方式将网状支架顺利套至静脉上。
   2. 待网状支架完全覆盖静脉表面后，使用Ethibon 3-0缝线将带套管的静脉固定于金属圆筒上。
   3. 将静脉-圆筒复合体重新安装至L形支架上，并转移至预先加满培养基的灌注腔室中。
7. 使用过氧化物处理过的硅胶管（内径3.2 mm），将每个金属圆筒（进液端和出液端）连接至Y型分流器。
8. 使用相同类型的管路将出液端分流器连接至第二个Y型分流器。从此Y型分流器中，使用一根管路测量两根血管的灌注压力；另一根管路则连接回柱体，形成闭合循环系统（图2）。
9. 在培养箱内，使用一根长管（一米长）将压力柱连接至泵头。
10. 通过另一根长管将泵头连接至进液端Y型分流器，完成整个装置的连接（图1）。

4. 静脉灌注

1. EVPS 装配完成后，向柱内加入培养基（液面保持在静脉流出道以下，以便补充培养基）。继续向柱内添加培养基，直至整个系统充满。将整个系统移入温度维持在 37 ± 0.1 °C、pH 值恒定在 7.40 ± 0.01（通过基于 Henderson-Hasselbalch 方程的 CO₂/pH 算法控制）的培养箱中。
2. 将齿轮泵头移出培养箱，并将其连接至齿轮泵驱动装置。拧紧固定杆以确保装配牢固。
3. 开启泵电源，确认驱动软件中已启动泵，使培养基在各腔室中均匀分布，持续 5 分钟。
4. 使用动脉压监测系统监测压力。将 EVPS 的压力输出端（对应于动脉导管）连接至与计算机相连的压力传感器。
   1. 确保导管内完全充满培养基且无气泡。通过“动脉导管”管路对培养系统进行除气（图 2）。注意观察显示器，确认出现振幅恒定、频率为每分钟 60 次的脉动心形信号。此时平均压力介于 0–10 mm Hg 之间。若压力< 0 且柱内液面逐渐下降，应检查是否存在泄漏（如静脉侧支或静脉与导管之间密封不严）。
5. 静脉测试时将最小压力设为 6 mm Hg，动脉测试时设为 90 mm Hg。在此条件下，空气加压装置会对柱和系统施加所需压力。
6. 通过连接至压力柱的管路每 2 天更换一次培养基。为防止因压力变化造成损伤，应先打开柱塞。

5. 灌注的完成

1. 灌注3天或7天后：将EVPS从培养箱中取出，拆卸静脉。弃去连接在设备上的近端和远端各5 mm的静脉组织。从剩余的静脉段中切取中央部位、厚度为5 mm的环状组织，用甲醛固定（用于形态计量学分析）。将剩余的组织片段冷冻并研磨成粉末，用于后续分子分析。

结果

EVPS 提供了一种有价值的工具，可独立评估血流动力学对人隐静脉移植物重塑和内膜增生的影响。

图1展示了灌流室和静脉支撑装置。图1A和B分别显示了静脉支撑装置在组装前（图1A）和组装后（图1B）的状态。该装置由上至下包括：一段长9 cm的普通不锈钢管，用作两个L形部件的支撑架，这两个部件可轻松地从左向右滑动，从而提供一种可靠的方法，以调节支撑装置的尺寸以适配静脉。每个L形部件均固定有一个POM圆盘，用于安装钢制圆柱体（静脉连接器），并通过内置螺钉（箭头所示）将其固定。图1C-D展示了单独的灌流室（C）以及插入静脉支撑装置后的状态（D）。在灌流室上设计有凹槽，用于固定静脉支撑装置（上方），并防止进出静脉的连接管发生扭曲（下方）。

图2展示了EVPS的实时图像（图2A

讨论

本研究揭示了一种 ex 体内 静脉灌注系统（EVPS）可用于在人静脉中进行广泛的血流动力学研究。该系统可在无循环细胞释放的加重性炎症因子和生长因子的情况下，按照定义的血流动力学参数对大隐静脉进行灌注。 体内因此，它有助于更深入地理解调控人静脉移植物中内膜增生（IH）的相关潜在通路^5,11,12,15.

可重复且可量化的血流动力学扰动在体内研究中受到限制。体内已报道多种复杂的小鼠显微外科手术方法。通过将供体小鼠的下腔静脉作为旁路移植段植入受体右颈总动脉，并额外实施流出道分支结扎、移植物中段或颈总动脉狭窄，可使血流和剪切应力（SS）急性降低，并促进内膜增生（IH）³。通过比较颈总动脉中段局灶性狭窄与远端狭窄，可进一步研究血管外向性与内向性重构的差异¹⁶。在大型动物（如绵羊、猪和狒狒）中，旁路移植术技术上更为简便，是测试临床前人尺寸器械（例如本研究中使用的网状装置）的有吸引力的方法^8-10。然而，其高昂成本以及缺乏经过验证的分子工具限制了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
青霉素/链霉素/两性霉素B（Fungizone）	Bioconcept	4-02F00-H
右旋糖酐（来自Leuconostoc spp.）500 g	Sigma-Aldrich	31390
PBS缓冲液 CHUV，pH 7.1–7.3，1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
冷冻切片包埋介质 - Tissue-Tek OCT 化合物	Fisher Scientific	14-373-65
硅胶管（过氧化物），L/S 16（96400-16），7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y型分流器	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm 培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon 管	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon 管	BD Bioscence	352098
齿轮泵 - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
泵头	Idex Health & Science GMBH	MI0008
TRANSPAC IV 监测套件	icumedical	011-0J736-01
20 ml 注射器	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
ProVena 网格，6–8 mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl：0.9% 氯化钠灌注液（100 ml）	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S 标准驱动器	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
数据采集卡	National Instruments	PCI-6024 E
流量计模块	Transonic Systems Inc.	TS410 和 T402
三通旋塞阀	BD Connexta Luerlock	394600
Millex 滤器	Milian	SE2M229I04