导致内膜增生（IH）和静脉移植物失效的机制仍不甚清楚。本研究描述了一种在可控血流和压力条件下灌注人静脉的ex vivo系统，并进一步评估了外部网状加固限制IH发展的有效性。
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摘要
摘要
目前治疗广泛闭塞性动脉疾病的主要手段是静脉旁路移植术。然而，其长期通畅性常受到内膜增生（IH）的威胁，最终导致血管闭塞和移植物失效。机械力，特别是低剪切应力和高血管壁张力，被认为会启动并维持这些细胞和分子层面的变化，但其确切作用机制仍有待阐明。为了选择性评估压力和剪切应力在IH生物学过程中的作用，研究人员建立了一种ex vivo灌注系统（EVPS），用于在动脉条件下（高剪切应力和高压力）灌注人隐静脉节段。进一步的技术改进使得同一根静脉的两个节段可同时进行灌注，其中一个节段外部加装网状支撑结构。静脉采用“无接触”技术获取后，立即转移至实验室并组装到EVPS中。其中一段新分离的静脉不进行灌注（对照组，第0天），另外两段则进行最多7天的灌注，其中一段完全包裹直径为4 mm的外部网状结构。压力、流速和脉搏频率被持续监测并调节，以模拟股动脉内的血流动力学环境。灌注结束后，取出静脉组织用于组织学和分子分析。在ex vivo条件下，高压力灌注（动脉压，平均值 = 100 mm Hg）足以诱导人静脉的内膜增生及血管重塑，而外部聚酯网状结构的存在可减轻这些改变。
引言
心血管疾病是西方国家发病率和死亡率的首要原因1。尽管血管内治疗技术已取得进展，旁路手术仍是当前治疗的主要手段，因此在美国每年进行超过50万例静脉移植手术。然而，尽管已有数十年的研究，30%至60%的下肢静脉移植物在术后最初几年内发生失败，其主要原因为内膜增生（IH）2。机械力，特别是低剪切应力（SS）和高血管壁张力，在这一增生反应的启动和发展过程中起着关键作用3,4。为解决这一问题，研究人员开发了一种ex vivo静脉灌注系统（EVPS），用于在严格控制的血流动力学条件（压力和剪切应力）下研究人隐静脉的行为。本研究发现，在植入类似动脉的循环环境后，高压（平均值 = 100 mm Hg）足以刺激平滑肌细胞增殖并迁移至内膜层，从而引发内膜增生（IH）5。
哺乳动物研究已表明，使用外部加固是一种有效的方法，可为“动脉化的静脉”提供支撑，并抵消静脉植入动脉环境后所面临的急性血流动力学变化。这种网状结构可防止静脉过度扩张，增加剪切应力，降低管壁张力，从而减少内膜增生6-10。然而，其潜在机制以及在改善人体静脉旁路通畅性方面的适用性尚未完全阐明。本研究采用人静脉灌注系统（EVPS），在模拟静脉植入动脉环境后所经历的变化（高剪切应力和高压）条件下，比较了大隐静脉在有无外部多孔聚酯管状网状结构时的行为表现。通过抑制病理性重塑和内膜增生，该网状结构显示出其潜....
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方案
洛桑大学伦理委员会批准了本实验，该实验符合1975年《赫尔辛基宣言》所规定的原则，并遵循1983年修订版关于人类组织使用的相关规定。
1. 人体大隐静脉采集
- 从因缺血接受下肢旁路手术的患者身上获取非曲张的人类大隐静脉多余节段。在手术室中，用碘溶液对整个下肢进行消毒，并铺巾以暴露从腹股沟至足部的腿部区域。
- 从腹股沟至膝盖做一条正中切口（保留间断的皮肤部分）。
- 连同周围组织蒂一起采集大隐静脉（无触碰技术）。使用4-0丝线结扎静脉的侧支。立即保存至少一段长度不小于9 cm、外径为2.5–4 mm的大隐静脉多余节段，将其置于4 °C的含12.5%胎牛血清的RPMI-1640 Glutamax培养基中，并运送至实验室。
2. EVPS 设计
- 组装 图1 所示的通用设备。对所有设备进行高压灭菌，并在无菌条件下保存所有组件。此外，确保系统防水，且不会将化学物质泄漏到培养基中。盖子使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA-GS），静脉支撑材料使用不锈钢（X5 Cr Ni 18 10）和聚甲醛塑料（POM）。
- 根据所需几何形状设计灌注腔，以便放置静脉并实现连接。确保深度（或若采用圆柱形结构则为半径）至少为 2.5 cm，以允许血管最小程度的弯曲和扩张，同时确保培养基能够持续覆盖血管（
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结果
EVPS 提供了一种有价值的工具，可独立评估血流动力学对人隐静脉移植物重塑和内膜增生的影响。
图1展示了灌流室和静脉支撑装置。图1A和B分别显示了静脉支撑装置在组装前（图1A）和组装后（图1B）的状态。该装置由上至下包括：一段长9 cm的普通不锈钢管，用作两个L形部件的支撑架，这两个部件可轻松地从左向右滑动，从而提供一种可靠的方法，以调节支撑装置的尺寸以适配静脉。每个L形部件均固定有一个POM圆盘，用于安装钢制圆柱体（静脉连接器），并通过内置螺钉（箭头所示）将其固定。图1C-D展示了单独的灌流室（C）以及插入静脉支撑装置后的状态（D）。在灌流室上设计有凹槽，用于固定静脉支撑装置（上方），并防止进出静脉的连接管发生扭曲（下方）。
图2展示了EVPS的实时图像（图2A
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讨论
本研究揭示了一种 ex 体内 静脉灌注系统（EVPS）可用于在人静脉中进行广泛的血流动力学研究。该系统可在无循环细胞释放的加重性炎症因子和生长因子的情况下，按照定义的血流动力学参数对大隐静脉进行灌注。 体内因此，它有助于更深入地理解调控人静脉移植物中内膜增生（IH）的相关潜在通路5,11,12,15.
可重复且可量化的血流动力学扰动在体内研究中受到限制。体内已报道多种复杂的小鼠显微外科手术方法。通过将供体小鼠的下腔静脉作为旁路移植段植入受体右颈总动脉，并额外实施流出道分支结扎、移植物中段或颈总动脉狭窄，可使血流和剪切应力（SS）急性降低，并促进内膜增生（IH）3。通过比较颈总动脉中段局灶性狭窄与远端狭窄，可进一步研究血管外向性与内向性重构的差异16。在大型动物（如绵羊、猪和狒狒）中，旁路移植术技术上更为简便，是测试临床前人尺寸器械（例如本研究中使用的网状装置）的有吸引力的方法8-10。然而，其高昂成本以及缺乏经过验证的分子工具限制了.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作获得了瑞士国家科学基金会（SNF [31003A-138528]）、Octav 与 Marcella Botnar 基金会、诺华基金会以及 Emma Muschamp 基金会资助。我们感谢 Martine Lambelet 和 Jean-Christophe Stehle 提供出色的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B（Fungizone） | Bioconcept | 4-02F00-H | |
| 右旋糖酐（来自Leuconostoc spp.）500 g | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| PBS缓冲液 CHUV，pH 7.1–7.3，1 L | Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG | 100 0 324 00 | |
| 冷冻切片包埋介质 - Tissue-Tek OCT 化合物 | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| 硅胶管（过氧化物），L/S 16（96400-16），7.5 m | Idex Health & Science GMBH | MF0037ST | |
| Y型分流器 | Idex Health & Science GMBH | Y-connector | |
| 35 mm 培养皿 | Sigma-Aldrich | CLS430165-100EA | |
| 15 ml Falcon 管 | BD Bioscence | 352096 | |
| 50 ml Falcon 管 | BD Bioscence | 352098 | |
| 齿轮泵 - Reglo-Z | Idex Health & Science GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| 泵头 | Idex Health & Science GMBH | MI0008 | |
| TRANSPAC IV 监测套件 | icumedical | 011-0J736-01 | |
| 20 ml 注射器 | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson&Johnson | EH7346H | |
| ProVena 网格，6–8 mm | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl：0.9% 氯化钠灌注液（100 ml） | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S 标准驱动器 | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| 数据采集卡 | National Instruments | PCI-6024 E | |
| 流量计模块 | Transonic Systems Inc. | TS410 和 T402 | |
| 三通旋塞阀 | BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex 滤器 | Milian | SE2M229I04 |
参考文献
- Sal Go, A., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
- Sal Conte, M., et al.
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重印与许可
