土壤采样及昆虫病原线虫的分离（Steine​​rnematidae，异小）

Summary

昆虫病原线虫是土栖线虫的寄生多种昆虫。我们展示了用于这些线虫使用两种技术的土壤隔离采样方式：昆虫引诱和修改后的白的陷阱，对于线虫的土壤样品和感染的昆虫尸体，分别回收。

Abstract

昆虫病原线虫（又名EPN）代表一组土栖线虫的寄生多种昆虫的。这些线虫属两个家庭：线虫和异。到现在为止，有超过70种已在Steine​​rnematidae描述，并有大约20种的异小。线虫有肠杆菌科细菌互利共生的伙伴关系和他们一起作为一个有效的杀虫复杂，杀灭多种昆虫种类。

在此，我们重点考虑从土壤中采集EPN中的最常用的技术。这个演讲的第二部分着重于昆虫引诱技术，为EPN从土壤样品中分离一种广泛使用的方法，以及用于这些线虫从感染虫的复苏修改白色陷阱技术。这些方法和技术是成功建立EPN邪教的关键步骤在实验室中，也URES形成的基础，即认为这些线虫作为模式生物的研究在其他生物学科等生物测定。在此演示文稿中显示的技术对应于那些由SP联合实验室成员，以及那些由不同的作者进行描述和/或设计。

Introduction

许多线虫与昆虫有关，其宿主相互作用的范围从有利到不利的。在此，我们专注于一组的线虫是昆虫病原体，也被称为昆虫病原线虫（或EPN）。两种线虫的家庭属于这个组线虫：线虫和异^11,13。其致病作用实际上是通过它们与兼性厌氧的肠道细菌（ 致病细菌与steinernematids和光杆状菌联想到heterorhabditids关联^）2相互作用所赋予的。该细菌通过唯一的自由生活线虫阶段，第三阶段的感染幼年（也称为永久性幼虫少年，感染幼年或IJ），它生活在土壤中的向量从一个昆虫宿主到另一个。一旦昆虫体内，线虫释放细菌进入昆虫的血淋巴，后者通过大规模败血症的昆虫宿主。此外，细菌还降低昆虫的组织，成为线虫的食物来源，使他们走向成熟和繁殖。通常，一个或两个世代成​​年线虫是昆虫的尸体内产生。最后成年一代重新关联一些细菌细胞中的后代一个更专业的方式比他们以前的营养关系，并培养这些细胞在它们的肠子，因为他们从昆虫尸体搬出到土壤中，他们将等待另一个昆虫寄生^6,11,14（ 图1）。

由于他们的发现于1927年，EPN被认为是有价值的替代化学杀虫剂，因为它们可以寄生在多种昆虫是农业害虫^3,4,5。然而，在过去的二十年里，这些线虫及其共生菌已被确认为研究宿主 - 微生物interactio的生物学，生态学和进化方面的可塑性模型系统NS ^14....

Protocol

1，土壤样品采集

1. 考虑覆盖的2的最小面积- 4 ^平方公尺的每个采样点。
2. 收集的土壤样品在一个深度至少为15厘米（ 图4）。
3. 至少需要5个随机样本在此区域内。
4. 取每个样品3子样本。根据研究的目的，无论是结合子样本，或让他们分开。
5. 将每个样品在一个塑料袋。考虑双套袋，以避免样品泄漏（ 图4）。
6. 标签样本具有防水标志。包括从每个采样点的以下信息：网站信息（包括本地/区域/网站名称和GPS坐标信息），日期，生地，相关的植被，温度，海拔等。
   注意：如果适用，收集和/或记录昆虫或与样品用于后续识别收集的其他无脊椎动物的存在。他们可能是潜在的自然色人EPN主机。
7. 通过用水充分洗涤和/或用70％乙醇或0.5％的漂白剂溶液消毒他们的样品之间干净的收集工具。
8. 运输到实验室中 - （15℃8）保持样品冷却器。
9. 对分析的土壤样品的一部分以获得对土壤成分，质地，水分，导电性或其它期望的土壤参数的信息。

2，从土壤样品线虫隔离：昆虫引诱技术

1. 取出所有碎片（ 即 。，岩石，木材或树皮，树叶等的作品。）收集与您的样品，以避免污染人工林则与微生物。
2. 加水以润湿土壤....

Results

土壤样品采集

EPN的第三阶段感染性幼虫是在这些线虫的生活周期（ 图1），其驻留在土壤中的唯一的自由生活阶段。因此，采集的土壤样品，是要收回这些线虫的一种非常有效的方法， 图4示出了表示在该样品应采取深处的土壤剖面。保存的样品的水分对于线虫的存活的关键因素。因此，要保持土壤样品中的塑料袋和过境实验室（ 图4）中维护它们在凉爽的温度是很重要的。

线虫恢复

在自然界中，发现昆虫通过EPN自然寄生的机会都小于3％，除非有发现一种流行病和昆虫与EPN为患更大的样本。因此，土壤样品与昆虫的引诱是一种方便的APPRoach以增强EPN从它们的天然生境中恢复图5描绘了土壤诱饵技术。在这种情况下，用螺丝顶的250毫升塑料容器中使用。约250g土壤被放置在容器中，5 - 10 G。蜡螟幼虫加到土壤的表面（ 图5

Discussion

该演示是第一次两个报告描述了若干常用于研究EPN及其共生菌技术。这些技术代表了成功建立EPN文化在实验室的关键步骤，也是形成的基础，雇用EPN作为模式生物用于研究其他生物测定。

EPN的各种土壤调查结果显示，他们的丰度和分布可以跨季节，生境和地理区域^4，5,9,15有所不同。因素如土壤质地，水分含量和温度，以及主机的可用性可能在它们的分布起着关键的作用。因此，至关重要的是，在这项统计调查的初步数据。一旦抽取样本，重要的是他们尽快处理。然而，如果这不是一个可能性，它们应该被存储在冷室或其它适当的温度控制单元。不同温度下可以是考虑用于存储昆虫诱饵容器取决于样品的起源。通常情况下，更低的温度（ 例如 ，15℃）被认为是温和的样本和样本的热带地区，温暖的温度（ 例如 ，30℃）对拟。

昆虫诱饵技术是最常用的方法从土壤样品恢复EPN的。这是一个方便的策略，允许EPN的在实验室中进行检索。大蜡螟末龄幼虫， 大蜡螟 （鳞翅目：螟蛾科）通常被认为是;然而，其他的昆虫.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	用于昆虫诱饵技术
滤纸，55 毫米 1 级纤维素	Whatman/VWR	28450-048	感染室和白色诱捕器组件
60 x 15 毫米 培养皿	VWR	25384-092	感染室和白色诱捕器组件
100 x 15 mm 培养皿	VWR	25384-088	感染室和白色陷阱组件
ZIPloc 塑料袋	Ace Hardware 或当地五金店		土壤采样
机械移液器 P1000， P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	感染室和白色陷阱组件
移液器吸头 1000 毫升、200 毫升	VWR	16466-004 ;53510	感染室和白色陷阱组件
漂白	Ace Hardware 或当地五金店		土壤采样、消毒
次氯酸钠	Ace Hardware 或当地五金店		土壤采样、消毒
70% 阿洛胆酸乙	AAPER	17212945	土壤采样、消毒
铲	Ace Hardware 或当地五金店	N/A	土壤采样
管状土壤采样器	Accuproducts		土壤采样
土壤探针，长柄	Nupla	PRB4T 69401 经典	土壤采样
卷尺	Ace Hardware 或当地五金店		土壤采样
标记胶带，各种颜色	Ace Hardware 或当地五金店		土壤采样
组织培养瓶	VWR	Falcon，29185-304	白陷阱，EPN 集合
洗瓶，聚乙烯，广口	VWR	16650-107	白色捕集阱，EPN 收集