我们描述了如何使用数字光学显微镜实时观察巨噬细胞与C. neoformans （Cn）之间的相互作用，特别关注非裂解性外排过程。利用该技术，可对单个感染的巨噬细胞进行研究，以确定该现象的各个方面。
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摘要
摘要
新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）感染巨噬细胞的许多方面已被广泛研究并得到明确定义。然而，其中一种尚不完全清楚的相互作用是非裂解性胞吐作用。在此过程中，酵母细胞通过一种尚未明确的机制被释放到细胞外空间，该过程使巨噬细胞和新型隐球菌（Cn）均保持存活状态。本文描述了如何通过延时显微镜技术，对大量单独感染的巨噬细胞进行长达24小时的感染过程追踪。感染后的巨噬细胞被置于与显微镜相连的加热培养室中，该培养室具有CO2气氛，可提供与细胞培养孵育箱相同的环境条件。活细胞数字显微镜能够提供宿主与病原体之间动态相互作用的信息，而这些信息无法从静态图像中获得。能够观察每一个感染细胞，有助于揭示巨噬细胞如何应对真菌感染，反之亦然。该技术是研究复杂现象背后动态过程的有力工具。
引言
隐球菌细胞与巨噬细胞之间真菌感染的各个阶段已有充分文献记载1-3。酵母细胞被巨噬细胞吞噬后，可能发生多种相互作用：巨噬细胞可能裂解，将其携带的真菌释放到细胞外环境，也可能通过将酵母细胞限制在细胞膜内来控制感染4。然而，数年前，两个研究团队独立描述了一种新的结果：非裂解性胞吐作用，即巨噬细胞将部分或全部隐球菌细胞排出至周围环境或邻近细胞，而宿主细胞与病原体均保持存活状态5-8。多项研究试图阐明这一相互作用背后的分子机制，但我们目前仍未能完全理解驱动该现象的因素。
实时捕获图像并随后分析多个感染巨噬细胞的能力，使得研究人员能够解答诸多关于非裂解性胞吐过程中时间、空间范围、形态变化以及真菌感染期间巨噬细胞应激状态等物理特性的科学问题。通过将细胞置于类似于培养箱的环境中进行观察，我们可以揭示巨噬细胞与真菌细胞相互作用的动态本质。研究人员已利用该技术探讨了这一过程的多个组分。通过荧光染色和肌动蛋白阻断剂的应用，吞噬体在此过程中的作用得以明确。 9而另一组研究人员利用该方法证明，在WASH成核蛋白结构域被敲除的细胞中，非裂解性胞吐作用受到阻断 10细胞因子信号传导的影响也已通过实时显微镜技术得以确定。 11此过程不仅限于 C. neoformans 正如在……中也观察到的那样 白色念珠菌， 另一种能够感染巨噬细胞的真菌病原体 12. 这些发现实例表明，该方法能够为一个我们知之甚少的领域提供大量信息。
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方案
所有动物实验均按照阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物研究研究所的规定和指南进行。
1. C. neoformans H99（血清型A）的培养条件
- 在沙保弱氏琼脂平板上培养单独的新型隐球菌（C. neoformans，Cn）菌落。
- 实验前一天，挑选一个菌落接种至10 ml沙保弱氏液体培养基中。
- 于37 °C、250 rpm振荡条件下培养过夜。
2. 从小鼠C57/Bl6中分离和制备原代骨巨噬细胞
- 将小鼠放入 CO2 室内，直至其停止呼吸，以实施安乐死。作为第二重措施，在开始解剖前进行颈椎脱位。用 70% 乙醇对整个动物体表进行消毒。
- 取出双侧股骨和胫骨，并将骨骼置于无菌 DMEM 中。
- 使用精细擦拭纸去除多余组织和肌肉，直至骨骼完全清洁。
- 仅将完整的骨骼放入含有 70% 乙醇的培养皿中，孵育 3 分钟以杀灭相关微生物。随后取出骨骼，转移至另一含有无菌 DMEM 的培养皿中。
- 小心剪去骨骼两端。将骨骼持于置于冰上的空 50 ml 锥形管上方，使用 25 G 针头将 10 ml 冷 DMEM 缓慢冲洗通过每根骨骼。
注意：每只小鼠可获得 4 根骨骼（2 根股骨，2 根胫骨）。因此，每只小鼠应可获得约 40 ml 细胞悬液。 - 在室温下以 650 × g 离心细胞悬液 10 分钟。
- 在离心过程中，配制并过滤除菌骨髓来源巨噬细胞培养基，其成分为：DMEM 添加 20% L929 条件培养基、10% 胎牛血清、10% NCTC-109、1% 青霉素-链霉素、1% HEPES、1% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸和 0.1% 2-巯基乙醇。
- 用 10 ml 培养基重悬所得细胞沉淀。将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛网，以分散细胞团块并去除大颗粒碎片。
- 将 1 ml 细胞悬液接种至含 10 ml 培养基的组织培养级培养皿中（共接种 10 个培养皿）。
- 将细胞置于 37 °C、10% CO2 条件下培养使其贴壁。第 3 天加入 5 ml 新鲜培养基。第 7 天完全更换培养基，此时巨噬细胞即可用于实验。
- 实验前一天，移除培养基，向培养皿中加入 5 ml 温和的细胞剥离试剂，使巨噬细胞从皿壁脱离。
- 在 37 °C 孵育 5–10 分钟，随后通过轻柔吹打回收巨噬细胞。
- 以 650 × g 离心 10 分钟收集细胞。
- 用 1 ml 培养基重悬细胞沉淀。取 10 µl 细胞悬液（按 1:20 稀释），使用血细胞计数板测定巨噬细胞浓度。
- 使用 14 mm 玻璃底培养皿，将浓度为 1 × 105 的巨噬细胞直接接种至内孔中（内孔最大容量为 200 µl），注意勿超过此体积，如 图 4 所示。
- 将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，使细胞贴附于玻璃表面。
- 加入 1–2 ml 含 LPS（1 mg/ml）和 IFNγ（500 u/ml）的培养基，继续孵育过夜。
3. 原代小鼠巨噬细胞与C. neoformans的共孵育
- 实验当天，取1 ml过夜接种的培养物，以420 × g离心5分钟，沉淀酵母细胞。
- 用无菌PBS洗涤细胞3次，以去除培养基及胞外隐球菌产物（如多糖葡糖醛酸木甘露聚糖，GXM），离心速度和时间同上。
- 将细胞沉淀重悬于1 ml无菌PBS中，并进行1:100稀释。取10 μl稀释液加入血细胞计数板，计数细胞。以感染复数（MOI）1:5加入酵母细胞。例如，若每孔含有1 × 105 个巨噬细胞，则配制浓度为5 × 106/ml的Cn细胞悬液，并加入100 µl该溶液，共加入5 × 105 个Cn细胞。
- 将计算好的隐球菌细胞悬液体积加入含10 μg/ml mAb 18B7抗体的1 ml培养基中，于室温孵育5分钟。
- 从玻璃底培养皿中移除培养基，用无菌PBS洗涤1次，然后直接向孔中加入100 μl经调理的Cn悬液。
- 将细胞在37 °C、10% CO2条件下孵育2小时。
- 共孵育后，通过显微镜检查确认巨噬细胞是否已内化Cn。若隐球菌细胞明显位于巨噬细胞内部，则视为已内化。
- 用无菌PBS洗涤培养皿3次，以去除所有胞外Cn。
- 加入1–2 ml不含mAb 18B7的培养基，并设置显微镜。
4. 利用数字光学显微镜实时观察非裂解性胞吐作用
注意：进行这些实验需要配备带有孵育腔的显微镜，孵育腔需包含 CO2 供给系统和加热装置。
- 实验前，将培养箱预热至少 30 分钟至 37 °C。确保实验开始时 CO2 浓度读数为 5%。
- 将玻璃底培养皿置于显微镜载物台上，盖上 CO2 专用盖，并关闭所有门以防止热量散失。
- 使用相差显微镜的 10X 物镜，对焦于一片清晰的感染巨噬细胞视野。根据实验需求，通过所需观察的巨噬细胞数量来确定所用物镜。
- 设置显微镜软件，每 4 分钟拍摄一张图像，持续 24 小时。
- 24 小时后，实验完成，共采集 361 张图像。以 5% 压缩率将这些图像导出为 .jpeg 格式。使用 Image J 软件以每秒 5 帧的速度将图像作为视觉堆栈播放。若需将视频用于发表或展示，请根据播放器兼容性将其保存为 .avi 或 .mov 文件。
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结果
该技术生成的图像可通过多种方式进行分析，以获取细胞吞噬新型隐球菌（C. neoformans）后所发生事件的相关信息。如图1所示，大约有100个巨噬细胞，其中部分已被感染，部分未被感染。每一个巨噬细胞都为研究者提供了在微观层面深入研究宿主-病原体相互作用的机会。如图2和图3所示，巨噬细胞与酵母细胞之间，甚至巨噬细胞与巨噬细胞之间，均可能发生不同的相互作用结果。可对巨噬细胞进行评分，判断其是否发生了非裂解性胞吐、细胞间转移或其他可能的细胞过程。此外，根据录像过程中设定的参数，还可确定这些事件在感染过程中的发生时间。
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讨论
本文介绍了一种可在24小时时间内实时记录和分析真菌-巨噬细胞相互作用的方法。本实验室已采用该方案研究了非裂解性胞吐过程中的多种时间动态特征，并将继续利用实时显微镜技术来确定与该过程相关的形态学组分。
为了使该技术获得理想结果，需对实验方案中的某些步骤给予特别关注。接种细胞的密度至关重要，因为细胞过多会导致成像画面无法使用，影响对单个细胞运动和相互作用的观察；而细胞过少则可能导致数据无显著性。目标是获得分布均匀的巨噬细胞视野，以便在整个感染期间持续追踪单个巨噬细胞。同样，洗去细胞外的新型隐球菌（Cn）是一个关键步骤，因为细胞外的Cn会随时间增殖，可能遮蔽视野，导致巨噬细胞难以观察。根据录像时长的不同，图像视野可能会偏离焦点，从而使图像无法用于研究，因此需要在感染过程中定期检查录像情况。
如上所述，该技术有多种修改方式，可适应其他实验的参数要求。可使用多种不同的荧光染料和标记物来突出显示膜和吞噬体的动态变化，但需注意光漂白现象及其可能对细胞活性造成的影响。也可采用多种不同类型的细胞，例如J774.1类巨噬细胞、单核细胞或阿米巴原虫...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目5T32AI07506、5R01AI033774、5R37AI033142、5R01AI052733的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 沙保葡萄糖琼脂 | BD | DF0109-17-1 | |
| 沙保葡萄糖肉汤 | BD | DF0382-17-9 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| 胎牛血清（FCS） | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES 缓冲液 | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| 非必需氨基酸 | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-巯基乙醇 | Invitrogen | 21985-023 | 有毒 |
| 3003 组织培养培养皿 | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek 玻底培养皿 | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| 小鼠 IFN-γ | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | 本实验室制备的非商业化抗体 | ||
| 带培养箱的 Axiovert 200M 显微镜 | Zeiss |
参考文献
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16(2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15(2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
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- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
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