我们介绍一种在现行药品生产质量管理规范（cGMP）指导下，使用无动物源性试剂分离和培养人羊膜上皮细胞（hAECs）的实验方案。
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摘要
摘要
来源于足月或早产羊膜的羊膜上皮细胞（hAECs）因其在再生医学中作为细胞来源的潜力而受到研究人员和临床医生的关注。这种关注的原因在于有证据表明，这些细胞具有高度的多向分化能力、低免疫原性以及抗炎功能。这些特性促使研究人员在多种疾病的临床前动物研究中成功探索了hAECs的治疗潜力。
人羊膜上皮细胞（hAECs）已被广泛应用于多种疾病和病症的治疗。hAECs潜在的临床应用包括中风、多发性硬化症、肝病、糖尿病以及急性和慢性肺部疾病的治疗。从临床前动物研究推进到临床试验，要求细胞治疗产品具备更高标准的质量控制和安全性。出于安全性和质量控制的考虑，优选采用无动物源成分试剂的细胞分离方案。
我们已开发出使用无动物源成分试剂分离、冻存和培养人羊膜上皮细胞（hAECs）的实验方案。该方法的优势在于，可在避免将潜在有害动物病原体传递给人类的前提下，实现细胞的分离、鉴定、冻存与培养，同时保持适当的细胞得率、存活率和增殖能力。对于从临床前动物研究转向临床试验的研究人员而言，这些方法将显著加快监管审批进程，降低风险，并提高其治疗用细胞群体的质量。
引言
来源于围产期组织的细胞，例如胎盘、胎盘膜、脐带和羊水，已引起研究人员和临床医生的关注，被视为再生医学领域潜在的细胞来源1,2。人们关注这些细胞的原因在于，它们均具备一定程度的可塑性和免疫调节能力3，而这些特性正是其在治疗应用中具有潜力的基础。
hAECs 是一种异质性的上皮细胞群体，可来源于足月或早产的羊膜4，提供了丰富的再生细胞材料来源。人羊膜上皮细胞（hAECs）作为细胞治疗手段具有多重优势，包括多向分化潜能、低免疫原性以及抗炎特性。研究表明，hAECs具有高度的多向分化潜能 体外 和 体内 可分化为中胚层谱系（心肌细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞）、内胚层谱系（胰腺细胞、肝细胞、肺细胞）和外胚层谱系（毛发、皮肤、神经细胞和星形胶质细胞）5-10.
令人欣慰的是，尽管人羊膜上皮细胞（hAECs）具有多向分化潜能，但在体内似乎既不会形成肿瘤，也不会促进肿瘤的发生。in vivo。此外，hAECs还具有免疫豁免特性，仅表达低水平的Ⅱ类人类白细胞抗原（HLAs）8。这一特性可能是其在异基因及异种移植后能够逃避免疫排斥反应的原因，这一点已在使用免疫功能健全的猴子、兔子、豚鼠、大鼠和猪的研究中得到证实11-13。hAECs表现出强大的免疫调节和免疫抑制特性，因此在自身免疫性疾病治疗的潜在临床应用中具有显著的实际优势。目前认为，hAECs可作用于先天性和适应性免疫系统，发挥免疫调节功能。其中一种被提出的作用机制是通过分泌免疫调节因子来实现的14。
人羊膜上皮细胞（hAECs）在临床前动物疾病模型中的应用包括治疗中风、多发性硬化症、肝病、糖尿病以及急性和慢性肺部疾病。由于hAECs具有独特的特性，研究人员对其用于治疗中风后脑部炎症表现出浓厚兴趣。已有证据表明，在神经系统疾病动物模型中，hAECs能够穿越血脑屏障，在脑内植入并存活长达60天，分化为神经元，减轻炎症反应，并促进受损中枢神经系统组织的再生15。
人羊膜上皮细胞（hAECs）具有靶向并逆转多发性硬化发生与发展过程中多种病理通路的能力。例如，临床前动物研究结果表明，hAECs具有显著的免疫抑制作用，可能诱导外周免疫耐受，并逆转正在进行的炎症反应。此外，研究已证实hAECs具有向神经细胞分化的潜能。 体内 并通过分泌大量神经营养因子促进内源性神经再生16.
人和啮齿类动物的羊膜上皮细胞已在动物模型中显示出对肝脏疾病的治疗效果。在四氯化碳诱导的肝损伤疾病模型中，人羊膜上皮细胞（hAEC）移植可导致有活力的hAEC在肝脏中成功植入，同时伴随肝细胞凋亡减少，以及肝部炎症和纤维化程度降低17。
人羊膜上皮细胞（hAECs）可被诱导表达胰腺相关因子，包括胰岛素和葡萄糖转运蛋白。多项研究已探讨了hAECs在糖尿病小鼠模型中恢复血糖水平的潜力18。在接受hAECs移植的小鼠中，动物体重和血糖水平在细胞注射后均下降至正常范围。这些研究为hAECs用于糖尿病治疗提供了有力证据。
人羊膜上皮细胞在成人和新生儿模型中对实验性急性和慢性肺损伤具有明确的预防和修复作用19这些研究发现，人羊膜上皮细胞（hAECs）可分化为 体外 分化为表达多种肺相关蛋白的功能性肺上皮细胞，包括囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR），即在囊性纤维化患者中发生突变的离子通道20此外，当人羊膜上皮细胞（hAECs）被递送至受损的成年及新生儿肺组织时，可通过调节宿主免疫细胞发挥修复作用，减少包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞在内的肺部白细胞募集。21-23.
鉴于人羊膜上皮细胞（hAECs）来源丰富、安全性良好，并已在多种疾病中展现出明确的临床应用前景，使用hAECs的临床试验势在必行。为了加速推动hAEC疗法进入临床试验阶段，我们建立了适用于临床试验的hAECs分离、冻存和培养方法，全程采用无动物源成分的试剂，并符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的要求。
本方案基于我们先前成功用于分离人羊膜上皮细胞（hAECs）的动物源性试剂方案6。我们对该原始方案进行了修改，以无动物源成分的试剂替代动物源性产品，并进一步优化了实验条件，以提高细胞得率、存活率和纯度。我们的目标是建立一种符合人类临床试验细胞制备监管标准的实验方案。
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方案
注意：胎盘应采集自单胎健康妊娠的孕妇，优先选择足月择期剖宫产。采集胎盘前应获得受试者书面的知情同意。所有人体组织的采集与使用均须经您所在的相关人类研究伦理委员会批准。
1. 羊膜上皮细胞的分离
- 将胎盘置于II级生物安全柜内的无菌表面上。
- 使用无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）尽可能清洗胎盘表面及膜上的血液。
- 将胎盘脐带朝上放置，机械分离羊膜和绒毛膜的外缘。
- 分离后，手动沿膜边缘向脐带方向剥离羊膜，使其与绒毛膜分离。
注意：务必清除羊膜上残留的任何绒毛膜碎片。 - 使用无菌剪刀，在距脐带基部约2 cm处剪下羊膜，并将其放入含有250 ml HBSS的500 ml密封容器中。
- 通过振荡装有羊膜的密封瓶进行充分清洗。
- 使用无菌镊子将羊膜从收集容器中取出，放入一个15 cm的培养皿中。
- 将羊膜剪成约5 cm长的片段（用镊子垂直夹持时），丢弃带血或撕裂的部分。
- 将羊膜片段放入500 ml密封容器中，用250 ml HBSS清洗约3–5次，直至羊膜变为半透明且无残留血液。
注意：残留血液可能降低酶消化液的效率。 - 将所有羊膜片段转移至含有50 ml酶消化液的容器中，注意尽量减少HBSS的带入。
- 将羊膜片段置于37 °C水浴或温室内，以轻柔振荡方式孵育15分钟 ，以去除任何残留血液。
- 将羊膜片段从酶消化液中取出，放入新的无菌容器中。
- 向羊膜中加入100 ml新鲜酶消化液，在37 °C水浴或温室内轻柔振荡孵育60分钟 （第一次消化）。
- 取出羊膜片段并转移至新容器中，注意让酶消化液从每一片膜上充分沥出。
注意：可通过将羊膜片段沿容器内壁拖动实现沥液。 - 向羊膜片段中加入100 ml新鲜酶消化液，在37 °C水浴或温室内轻柔振荡孵育60分钟 （第二次消化）。
- 将第1.14步所得细胞悬液通过70 µm滤网过滤，并在1,000 x g下离心10分钟。
- 移除并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4 ml含有1 mg/ml大豆来源酶抑制剂的HBSS中。使用1 ml移液器反复轻柔吹打，获得单细胞悬液。
注意：此阶段可将细胞置于冰上，直至第二次消化的细胞达到相同的处理阶段。 - 取出羊膜片段并转移至新容器中，注意让酶消化液从每一片膜上充分沥出。
注意：可通过将羊膜片段沿容器内壁拖动实现沥液。 - 将第1.18步所得细胞悬液通过70 µm滤网过滤，并在1,000 x g下离心10分钟。
- 移除并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4 ml 含有1 mg/ml 大豆来源酶抑制剂的HBSS中。使用1 ml移液器反复轻柔吹打，获得单细胞悬液。
- 合并两次消化所得的细胞，或在完成细胞计数前保持两次消化的细胞分离。
注意：此举可避免低活力细胞与高活力细胞混合。 - 加入HBSS至终体积为10–20 ml，使用台盼蓝染色进行细胞计数并测定细胞活力。
- 通过流式细胞术确认上皮细胞表型。在HBSS中配制适当的抗体混合液，包括抗-EpCAM-PE（1:2稀释）、抗-CD90-PeCy5（1:250）和抗-CD105-APC（1:100）。
- 将一次或两次消化所得的部分细胞重悬于抗体混合液中，浓度为25 x 106 个细胞/ml。
- 进行流式细胞术检测时，用含同型对照抗体的混合液（例如IgG1同型对照-PE + 抗-CD90-PeCy5 + 抗-CD105-APC）对1 x 106个细胞进行染色。保留约1 x 106个细胞不染色，用于流式细胞仪的仪器校准。
- 将细胞在4 °C下与抗体混合液孵育60分钟。
- 用HBSS洗涤细胞3次，重悬于每毫升500万至1000万个细胞的浓度，用于流式细胞术检测。
- 进行流式细胞术分析并记录结果。预期细胞分离物的纯度（EpCAM阳性且CD90/CD105阴性细胞的比例）分别为90–95%和<1%。
- 根据最终应用确定的质量控制或放行标准，预留适量细胞用于相应检测。
注意：检测项目可包括疾病/病毒筛查，或其他安全性或生物学指标。 - 对剩余细胞，按照冻存方案进行处理，或直接进入培养（直接进入第3.6步培养）。
2. 人羊膜上皮细胞的冷冻保存
- 使用流式细胞术数据或台盼蓝排斥法手动计数，确定细胞数量和存活率。
- 以 700 × g 离心 5 分钟。
- 用无动物源成分的冷冻保存培养基将细胞重悬，浓度为每毫升 1 至 1000 万个细胞。
- 将适量细胞悬液移入带 O 形圈的冷冻保存管中，并放入程序降温仪中，以大约 1°C/min 的速率降温至 -80°C 。
- 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
3. 冻存人羊膜上皮细胞的解冻与培养
- 从液氮中取出冻存管，置于冰上。
注意：仅用于转移——迅速进行下一步操作。 - 将冻存管在37 °C快速解冻，直至仅剩一小块冰（约5 mm × 5 mm）。
注意：细胞溶液不得升温，以降低冻存液中DMSO的毒性作用。 - 将冻存培养基用预冷（约 4 °C）的无血清培养基稀释 10 倍，逐滴加入适当大小的离心管或容器中。
- 700 × g 离心 5 分钟 室温下
- 用无血清培养基重悬细胞，浓度约为每毫升100万个细胞。使用自动或手动计数法结合台盼蓝染色排除法测定细胞数量和活率。复苏后的细胞活率预计比冻存前降低5-10%。
- 将细胞接种于标准细胞培养处理的塑料器皿上，或 alternatively 使用 I 型胶原涂布培养表面。
- I型胶原蛋白包被请遵循以下方案
- 从人胎盘制备酸溶性I型胶原（每25 ml去离子水中加入15 mg胶原和50 µl冰醋酸）。
- 用封口膜盖住烧杯，并在 37 °C 下适度搅拌，直至胶原纤维完全溶解。
- 使用 0.22 µm 滤器对胶原蛋白溶液进行无菌过滤。
- 将过滤后的胶原蛋白储备液用去离子水按1:10比例稀释。此稀释后的溶液为用于包被塑料和膜表面的工作浓度溶液。
- 在室温或37°C下孵育2小时，或在2–8°C下过夜，用胶原蛋白包被塑料、玻璃和膜表面。
- 去除涂覆表面的多余液体，并过夜干燥。
- 用无菌组织培养级水或HBSS在接种细胞和培养基前冲洗。
- 以 25,000 个细胞/cm² 的密度接种人羊膜上皮细胞2 在无血清培养基中孵育，使细胞贴壁 72-96 小时。
- 贴壁后，每2-3天小心吸除培养基，并更换为适量的无血清培养基。
- 使用以下方案传代细胞
- 吸弃细胞培养基，并用1倍体积的无菌HBSS洗涤
- 加入等体积的酶消化液，孵育5-15分钟，或直至观察到细胞从细胞培养表面脱落。
- 收集含有细胞的酶消化液，通过反复将酶消化液吹打至细胞培养表面，确保细胞从培养表面完全脱落
- 700 × g 离心 5 分钟。
- 将细胞沉淀重悬于适量含有1 mg/ml大豆来源酶抑制剂的HBSS中。用1 ml移液器轻轻反复吹打，获得单细胞悬液。
- 加入无血清培养基，使细胞浓度约为100万个细胞/毫升。使用自动或手动计数法结合台盼蓝排斥法测定细胞数量和活力。
- 以 25,000 个细胞/cm² 的密度接种人羊膜上皮细胞（hAECs）2 在无血清培养基中继续采用标准培养方法。
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结果
若操作正确，应可获得平均约1.2亿个hAECs，典型范围为8000万至1.6亿个细胞。由此产量预计细胞平均活力为83 ± 4%。临床级方法中较高的平均产量及略低的细胞活力，可能归因于胰蛋白酶活性高于动物来源产品，也可能与缺乏血清蛋白有关。分离所得hAECs的平均细胞表面表型中，EpCAM阳性细胞占92%。 <1% CD90、CD105 间充质标志物阳性细胞。选择这些标志物是因其对上皮细胞具有特异性24,25 和间充质26 谱系。此过程大约需要4-5小时完成（图1).
冻存所需时间取决于冻存管数量和最终细胞得率，通常为 20–60 分钟。我们此前测试了多种冻存培养基，发现许多无动物源成分的培养基均适用，但 DMSO 的最佳浓度约为 5–10%。通常情况下，解冻后细胞活力较冻存前降低 5–10%；对于操作经验不足的使用者，细胞活力损失可能显著更大（图 2）。
可对人羊膜上皮细胞（hAECs）进行细胞培养，以实现其表...
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讨论
该方法的成功受多个关键参数的显著影响。出于物流或时间安排的考虑，胎盘或羊膜在分离人羊膜上皮细胞（hAECs）前可保存最多3小时，但建议尽快处理组织。若需保存，建议在羊膜组织解剖和洗涤后进行。羊膜可在含抗生素的无菌HBSS中于4 °C保存，但长时间保存可能导致细胞活力下降。我们及其他研究者均发现细胞产量和活力存在差异，为尽量减少此类变异，建议从健康足月分娩的胎盘中采集样本，且优先选择剖宫产分娩的样本。
我们发现，羊膜受到血细胞污染会导致酶活性受到抑制，并降低细胞得率。因此，该实验方案中的一个关键步骤是彻底清洗胎盘和羊膜，建议进行充分洗涤。建议对羊膜组织进行洗涤直至其呈现白色或透明状，以避免对后续酶反应产生抑制作用。分离出相对均一的上皮细胞群体对于细胞的表征和质量控制检测至关重要。
如果出现细胞得率低、活力差或细胞产物中存在间充质细胞污染的情况，可进行多种改进以排除故障。如果细胞得率较低，可能是由于血液或血清污染抑制了酶的活性。可通过更彻底地增加洗涤步骤，和/或丢弃带血或受污染的羊膜组织片段来解决此问题。也可延长酶消化时间，但可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢维多利亚州政府运营基础设施支持计划提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 采集套件 | |||
| 剥片托盘 | Fisher Scientific | 13-361B | |
| 利比提尖头敷料钳，13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| 剪刀 - 尖头/钝头直剪 | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| 无菌乳胶手套 | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| 防护服 | |||
| 防护服（隔离衣） | U型线 | S-15374-M | |
| 隔离衣 | U型线 | S-15374-M | |
| 无菌乳胶手套 | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| 通用型面部口罩 | Cardinal Health | AT7511 | |
| 帽子 | Medline | CRI1001 | |
| 鞋套 | U形线 | S-7873W | |
| 培养基与试剂 | |||
| 汉克斯’ 平衡盐溶液（HBSS） | Life Technologies | 14175095 | 不含钙或镁 |
| TrypZean（动物源产品）–游离重组胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | T3449 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 1 g/50 mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| 台盼蓝试剂 | Life Technologies | 15250-061 | |
| 抗EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE同型对照 | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| 抗CD90-藻红蛋白-花青素5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-同型对照 | BD Pharmingen | 557224 | |
| 抗CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-同型对照 | BD Pharmingen | 340754 | |
| VI型胶原蛋白 | Sigma Aldrich | C7521 | |
| 耗材 | |||
| 50 ml 刻度吸管 | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml 刻度移液管 | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml 刻度移液管 | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml 离心管 | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml 离心管 | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm 培养皿 | 康宁 | 351058 | |
| 70 μm 滤膜 | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm 滤膜 | 默克密理博 | SLGV033RS | |
| 1 ml 移液器吸头 | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ移液器吸头 | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml 注射器 | BD/医疗 | 309661 | |
| 塑料刮刀 | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| 塑料称量舟 | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| 冻存管 | Nunc | 377267 | |
| 仪器设备 | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| 生物安全柜 |
参考文献
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