用于临床应用的人羊膜上皮细胞的分离、冷冻保存与培养

摘要

我们介绍一种在现行药品生产质量管理规范（cGMP）指导下，使用无动物源性试剂分离和培养人羊膜上皮细胞（hAECs）的实验方案。

摘要

来源于足月或早产羊膜的羊膜上皮细胞（hAECs）因其在再生医学中作为细胞来源的潜力而受到研究人员和临床医生的关注。这种关注的原因在于有证据表明，这些细胞具有高度的多向分化能力、低免疫原性以及抗炎功能。这些特性促使研究人员在多种疾病的临床前动物研究中成功探索了hAECs的治疗潜力。

人羊膜上皮细胞（hAECs）已被广泛应用于多种疾病和病症的治疗。hAECs潜在的临床应用包括中风、多发性硬化症、肝病、糖尿病以及急性和慢性肺部疾病的治疗。从临床前动物研究推进到临床试验，要求细胞治疗产品具备更高标准的质量控制和安全性。出于安全性和质量控制的考虑，优选采用无动物源成分试剂的细胞分离方案。

我们已开发出使用无动物源成分试剂分离、冻存和培养人羊膜上皮细胞（hAECs）的实验方案。该方法的优势在于，可在避免将潜在有害动物病原体传递给人类的前提下，实现细胞的分离、鉴定、冻存与培养，同时保持适当的细胞得率、存活率和增殖能力。对于从临床前动物研究转向临床试验的研究人员而言，这些方法将显著加快监管审批进程，降低风险，并提高其治疗用细胞群体的质量。

引言

来源于围产期组织的细胞，例如胎盘、胎盘膜、脐带和羊水，已引起研究人员和临床医生的关注，被视为再生医学领域潜在的细胞来源^1,2。人们关注这些细胞的原因在于，它们均具备一定程度的可塑性和免疫调节能力³，而这些特性正是其在治疗应用中具有潜力的基础。

hAECs 是一种异质性的上皮细胞群体，可来源于足月或早产的羊膜⁴，提供了丰富的再生细胞材料来源。人羊膜上皮细胞（hAECs）作为细胞治疗手段具有多重优势，包括多向分化潜能、低免疫原性以及抗炎特性。研究表明，hAECs具有高度的多向分化潜能 体外 和 体内 可分化为中胚层谱系（心肌细胞、肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞）、内胚层谱系（胰腺细胞、肝细胞、肺细胞）和外胚层谱系（毛发、皮肤、神经细胞和星形胶质细胞）^5-10.

令人欣慰的是，尽管人羊膜上皮细胞（hAECs）具有多向分化潜能，但在体内似乎既不会形成肿瘤，也不会促进肿瘤的发生。in vivo。此外，hAECs还具有免疫豁免特性，仅表达低水平的Ⅱ类人类白细胞抗原（HLAs）⁸。这一特性可能是其在异基因及异种移植后能够逃避免疫排斥反应的原因，这一点已在使用免疫功能健全的猴子、兔子、豚鼠、大鼠和猪的研究中得到证实^11-13。hAECs表现出强大的免疫调节和....

方案

注意：胎盘应采集自单胎健康妊娠的孕妇，优先选择足月择期剖宫产。采集胎盘前应获得受试者书面的知情同意。所有人体组织的采集与使用均须经您所在的相关人类研究伦理委员会批准。

1. 羊膜上皮细胞的分离

1. 将胎盘置于II级生物安全柜内的无菌表面上。
2. 使用无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）尽可能清洗胎盘表面及膜上的血液。
3. 将胎盘脐带朝上放置，机械分离羊膜和绒毛膜的外缘。
4. 分离后，手动沿膜边缘向脐带方向剥离羊膜，使其与绒毛膜分离。
   注意：务必清除羊膜上残留的任何绒毛膜碎片。
5. 使用无菌剪刀，在距脐带基部约2 cm处剪下羊膜，并将其放入含有250 ml HBSS的500 ml密封容器中。
6. 通过振荡装有羊膜的密封瓶进行充分清洗。
7. 使用无菌镊子将羊膜从收集容器中取出，放入一个15 cm的培养皿中。
8. 将羊膜剪成约5 cm长的片段（用镊子垂直夹持时），丢弃带血或撕裂的部分。
9. 将羊膜片段放入500 ml密封容器中，用250 ml HBSS清洗约3–5次，直至羊膜变为半透明且无残留血液。
   注意：残留血液可能降低酶消化液的效率。
10. 将所有羊膜片段转移至含有50 ml酶消化液的容器中，注意尽量减少HBSS的带入。
<....

结果

若操作正确，应可获得平均约1.2亿个hAECs，典型范围为8000万至1.6亿个细胞。由此产量预计细胞平均活力为83 ± 4%。临床级方法中较高的平均产量及略低的细胞活力，可能归因于胰蛋白酶活性高于动物来源产品，也可能与缺乏血清蛋白有关。分离所得hAECs的平均细胞表面表型中，EpCAM阳性细胞占92%。 <1% CD90、CD105 间充质标志物阳性细胞。选择这些标志物是因其对上皮细胞具有特异性^24,25 和间充质²⁶ 谱系。此过程大约需要4-5小时完成（图1).

冻存所需时间取决于冻存管数量和最终细胞得率，通常为 20–60 分钟。我们此前测试了多种冻存培养基，发现许多无动物源成分的培养基均适用，但 DMSO 的最佳浓度约为 5–10%。通常情况下，解冻后细胞活力较冻存前降低 5–10%；对于操作经验不足的使用者，细胞活力损失可能显著更大（图 2）。

可对人羊膜上皮细胞（hAECs）进行细胞培养，以实现其表.......

讨论

该方法的成功受多个关键参数的显著影响。出于物流或时间安排的考虑，胎盘或羊膜在分离人羊膜上皮细胞（hAECs）前可保存最多3小时，但建议尽快处理组织。若需保存，建议在羊膜组织解剖和洗涤后进行。羊膜可在含抗生素的无菌HBSS中于4 °C保存，但长时间保存可能导致细胞活力下降。我们及其他研究者均发现细胞产量和活力存在差异，为尽量减少此类变异，建议从健康足月分娩的胎盘中采集样本，且优先选择剖宫产分娩的样本。

我们发现，羊膜受到血细胞污染会导致酶活性受到抑制，并降低细胞得率。因此，该实验方案中的一个关键步骤是彻底清洗胎盘和羊膜，建议进行充分洗涤。建议对羊膜组织进行洗涤直至其呈现白色或透明状，以避免对后续酶反应产生抑制作用。分离出相对均一的上皮细胞群体对于细胞的表征和质量控制检测至关重要。

如果出现细胞得率低、活力差或细胞产物中存在间充质细胞污染的情况，可进行多种改进以排除故障。如果细胞得率较低，可能是由于血液或血清污染抑制了酶的活性。可通过更彻底地增加洗涤步骤，和/或丢弃带血或受污染的羊膜组织片段来解决此问题。也可延长酶消化时间，但可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
采集套件
剥片托盘	Fisher Scientific	13-361B
利比提尖头敷料钳，13 cm	Fisher Scientific	S17329
剪刀 - 尖头/钝头直剪	Fisher Scientific	NC0562592
无菌乳胶手套	Fisher Scientific	19-014-643
防护服
防护服（隔离衣）	U型线	S-15374-M
隔离衣	U型线	S-15374-M
无菌乳胶手套	Fisher Scientific	19-014-643
通用型面部口罩	Cardinal Health	AT7511
帽子	Medline	CRI1001
鞋套	U形线	S-7873W
培养基与试剂
汉克斯’ 平衡盐溶液（HBSS）	Life Technologies	14175095	不含钙或镁
TrypZean（动物源产品）–游离重组胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T3449
大豆胰蛋白酶抑制剂  1 g/50 mL	Sigma Aldrich	T6522
Cryostor CS5	BioLife Solutions	205102
台盼蓝试剂	Life Technologies	15250-061
抗EpCam-PE	Miltenyi Biotec	130 - 091-253
PE同型对照	Miltenyi Biotec	130-098-845
抗CD90-藻红蛋白-花青素5	BD Pharmingen	555597
PeCy5-同型对照	BD Pharmingen	557224
抗CD105-APC	BD Pharmingen	562408
APC-同型对照	BD Pharmingen	340754
VI型胶原蛋白	Sigma Aldrich	C7521
耗材
50 ml 刻度吸管	BD/Falcon	356550
10 ml 刻度移液管	BD/Falcon	356551
5 ml 刻度移液管	BD/Falcon	356543
50 ml 离心管	BD/Falcon	352070
15 ml 离心管	BD/Falcon	352096
15 cm 培养皿	康宁	351058
70 μm 滤膜	BD/Falcon	352350
0.22 μm 滤膜	默克密理博	SLGV033RS
1 ml 移液器吸头	Fisherbrand	02-707-401
200 μ移液器吸头	Fisherbrand	02-707-409
20 ml 注射器	BD/医疗	309661
塑料刮刀	Fisher Scientific	14-245-97
塑料称量舟	Fisher Scientific	02-202-102
冻存管	Nunc	377267
仪器设备
Mr Frosty	Fisher Scientific	A451-4
生物安全柜