利用酵母蛋白病变模型分离增强型Hsp104变体

摘要

酵母蛋白病变模型是评估与疾病相关的蛋白质毒性和聚集性的有力工具。本文介绍了筛选Hsp104变体文库中毒性抑制因子的方法。该方案可适用于在酵母中具有毒性的任何蛋白质，用于筛选任意蛋白文库中的毒性抑制因子。

摘要

许多蛋白质错误折叠疾病可以在出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 中进行建模。例如，与肌萎缩侧索硬化症相关的TDP-43和FUS，以及与帕金森病相关的α-突触核蛋白，在酵母中具有毒性并形成细胞质聚集体。这些特征重现了患有这些疾病的患者中观察到的蛋白质病理变化。因此，酵母是筛选蛋白质变异体文库中毒性抑制因子的理想平台。我们希望应用蛋白质去聚集酶来清除错误折叠的有毒蛋白质构象。具体而言，我们正在改造Hsp104——一种来自酵母的六聚体AAA+蛋白，它具有独特的能力，可溶解无序聚集体和淀粉样蛋白，并将蛋白质恢复至其天然构象。尽管Hsp104在真核生物和真细菌中高度保守，但在后生动物中尚无已知的同源物。Hsp104在清除与人类疾病相关的无序聚集体和淀粉样纤维方面能力有限。因此，我们的目标是改造Hsp104变体，以逆转神经退行性疾病中涉及的蛋白质错误折叠。我们已开发出方法，用于在酵母中筛选大量Hsp104变体文库，以发现对蛋白毒性具有抑制作用的候选物。由于酵母容易自发产生非特异性毒性抑制，我们建立了两步筛选流程以消除假阳性结果。利用这些方法，我们已鉴定出一系列增强型Hsp104变体，能够强效抑制TDP-43、FUS和α-突触核蛋白的毒性和聚集。本文描述了这一优化后的实验方案，该方案可被调整用于筛选基于任意蛋白质骨架构建的文库，以鉴定能够抑制任何在酵母中有毒的蛋白质的毒性变体。

引言

已开发出用于蛋白质错误折叠疾病的酵母蛋白病模型，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）^1-3。在ALS患者中发生错误折叠的TDP-43和FUS蛋白在酵母中表达时具有毒性，并错误定位形成细胞质聚集体^1,2。类似地，在PD中相关的α-突触核蛋白（α-syn）在酵母中表达时也具有毒性，并错误定位形成细胞质聚集体³。这些特征重现了患有这些疾病的患者的表型^4,5。因此，酵母模型为筛选能够预防或逆转这些表型的蛋白质或小分子提供了有用的平台^2,6-13。我们关注于开发能够逆转由TDP-43、FUS和α-syn引起的聚集和毒性的蛋白质。我们聚焦于Hsp104，这是一种来自酵母的AAA+蛋白，能够独特地从无定形聚集体和淀粉样蛋白中解聚蛋白质，但在人类中没有同源物^14,15。Hsp104经过精细调节以解聚内源性酵母朊病毒，但对人类神经退行性疾病中涉及的底物解聚能力有限，因为这些底物在其自然环境中从未出现过^16,17。因此，我们的目标是设计出增强型Hsp104变体，使其能够高效解聚这些人类底物。为此，我们利用易错PCR构建了大量Hsp104变体文库；这些文库可利用酵母蛋白病模型进行筛选¹⁷。由于Hsp104分子量较大，我们采用了基于结构域靶向的方法来构建和筛选文库¹⁷。我们最初聚焦于Hsp104的中间结构域（MD）¹⁷，但类似的方法也可用于筛选其他结构域。这些模型能够直接筛选解聚酶活性，而不同于诸如表面展示等仅限于监测结合的替代技术¹⁸。

我们的实验方案基于两个筛选步骤（图1）。首先，筛选能够在酵母中抑制疾病相关底物毒性的Hsp104突变体。为此，将Hsp104突变体与疾病相关底物共转化至∆hsp104酵母菌株中。我们采用∆hsp104酵母，以便在无野生型（WT）Hsp104存在的条件下探索Hsp104的序列空间¹⁷。重要的是，Hsp104的缺失不会影响α-突触核蛋白（α-syn）、FUS或TDP-43在酵母中的毒性，而表达Hsp104^WT仅能提供微弱的保护作用^1,13,17。随后将酵母接种于诱导培养基中，以诱导两种蛋白的表达。携带能够抑制疾病相关底物毒性的Hsp104突变体的酵母可形成菌落生长；而携带无抑制功能突变体的菌落则因毒性未被抑制而死亡。这些具有生长能力的菌落被选中进行后续分析。然而，该筛选过程中假阳性问题较为显著。TDP-43、FUS和α-syn的表达具有高度毒性，这会强烈选择出与所表达Hsp104突变体无关的自发性遗传抑制因子。因此，我们采用了一个通量相对较高的二次筛选步骤，以剔除这些非特异性毒性抑制因子¹⁷。在该二次筛选中，将选出的酵母菌株用5-氟乳清酸（5-FOA）处理，从而反向筛选丢失Hsp104质粒的菌株¹⁹。随后通过点种实验评估菌株中底物（TDP-43、FUS或α-syn）的毒性，以确认在丢失Hsp104质粒后底物毒性得以恢复。因此，在此二次筛选中毒性恢复的酵母菌株，其最初的毒性抑制很可能是由Hsp104突变体的存在所致。这类菌株被定义为“阳性结果”（‘hits’），应从中回收Hsp104质粒并进行测序，以鉴定Hsp104基因中的突变位点¹⁷（图1）。所有阳性结果均应通过定点诱变独立构建相应突变，并重新验证其毒性抑制能力，以进行复核确认。本实验方案具有广泛的应用前景。利用该方法，可对任意类型的蛋白文库进行筛选，以发现能够抑制任何在酵母中具有毒性的底物蛋白的突变体。

方案

1. 文库构建

1. 为了使用特定结构域的易错PCR构建Hsp104文库，首先使用易错DNA聚合酶扩增目标结构域²⁰。
2. 通过凝胶回收纯化PCR产物。
3. 采用标准的定点突变方案进行大引物延伸反应：在PCR缓冲液中加入50 ng模板质粒、250 ng大引物、200 μM dNTPs和高保真DNA聚合酶，用PCR级水稀释至总体积50 μl²⁰，运行标准PCR程序。
   注意：所用的具体引物将根据需要扩增的基因区域而有所不同。
   1. PCR完成后，在37 °C条件下用1 μl DpnI限制性内切酶消化亲本模板DNA，持续2小时。
4. 将文库通过电穿孔或其他方法转化至超感受态E. coli中，并通过质粒小提纯化。
   注意：文库的构建方法因具体实验目的而有显著差异。Hsp104是一种非常大的蛋白质，因此对整个基因进行随机化是不现实的，这就是我们采用特定结构域易错PCR的原因。此外，Hsp104的结构仍缺乏充分了解，使得定向文库的设计具有挑战性²¹。可通过定向或随机诱变方法构建文库，唯一的要求是模板质粒骨架应包含URA3基因，以便在含葡萄糖培养基上进行5-FOA反向筛选。

2. Hsp104 文库的转化

1. 使用标准的醋酸锂/PEG转化方案²²，将与疾病相关的底物整合到W303aΔhsp104酵母中。筛选单克隆并检测其毒性，以分离出对疾病相关底物具有高毒性的菌株²³。
   注意：使用整合型菌株并分离单克隆，以确保所有细胞中表达水平一致。将疾病底物克隆至一个允许在除尿嘧啶标记外的任意标记（我们使用组氨酸标记）下进行基因整合的质粒中，同时将Hsp104文库克隆至pAG416GAL质粒（尿嘧啶标记）²⁴。为实现5-FOA反向筛选，需确保文库表达所用质粒带有尿嘧啶标记。也可使用其他酵母菌株。我们已在W303a和BY4741酵母菌株中观察到类似的毒性抑制表型，无论其为野生型（WT）或Δhsp104背景（M.E.J. 和 J.S.，未发表观察结果）。
2. 使用相同的醋酸锂/PEG转化方案²²，将Hsp104文库转化至该菌株中。适当扩大转化规模，以维持文库的序列空间，并保持预期的文库大小。
3. 将转化混合物涂布于非诱导性选择性平板（例如 SD-His-Ura）上，使用足够数量的平板以确保大量菌落生长。使用大尺寸培养皿（150 mm）以减少所需平板数量。通过平板回收转化子可评估转化效率。
4. 平行转化Hsp104^WT及空载体阴性对照。

3. 蛋白毒性抑制的筛选

1. 使用添加棉子糖的缺陷培养基将菌落从平板上洗脱下来（例如 SRaff-His-Ura）。使用血清移液管和无菌木制涂布棒将菌落从平板上轻轻刮下。将洗液转移至50 ml锥形离心管中，充分涡旋震荡以分散细胞团块。稀释至略微浑浊的菌液状态，OD₆₀₀ ~0.025.
   注意：此处棉子糖用于解除葡萄糖对诱导作用的抑制，从而使细胞为半乳糖介导的诱导做好准备。
2. 在30 ºC、摇床条件下，将稀释后的培养物于棉子糖缺失培养基中过夜培养。培养Hsp104^WT 并行设置载体对照。
3. 次日早晨，将一系列浓度的样品分别接种到含半乳糖的培养板上例如 SGal-His-Ura 平板（1 μl 至 2 ml 浓缩培养物，总体积为 400 μl）。铺板时应涵盖较宽的浓度范围，以确保获得单菌落。实际所需浓度取决于目标疾病底物的毒性。
4. 标准化向量和 Hsp104^野生型 培养物的 OD₆₀₀ 将文库与对照组等体积点样，以比较文库相对于对照组的生长情况。
5. 为评估筛选严格性，将文库接种于葡萄糖（抑制性）培养基平板上。在 30 ºC 条件下培养 2–3 天，直至菌落出现（图2). 观察并评估形成的菌落，与对照组进行比较。
   注意：通常会获得大小不同的菌落，但菌落大小与活性之间无相关性。使用5-FOA对抗筛选技术（步骤4）对这些潜在阳性克隆进行筛选，以减少带入测序阶段的假阳性结果。

4. 5-FOA 反向筛选与点样法以消除假阳性

1. 将单菌落平行划线接种至双缺和单缺培养基上（例如 SD-His-Ura 和 SD-His 平板）并在 30 ºC 过夜培养。用载体和 Hsp104 重复上述步骤。^WT 对照组。在接种至5-FOA之前先在SD-His培养基上铺板，可提高5-FOA步骤的效率，因为这增加了细胞在接种到5-FOA时已丢失Hsp104质粒的可能性。
2. 为防止平板干燥，在进行5-FOA筛选时用封口膜包裹SD-His-Ura平板，并于4 ºC保存。这些平板后续将用于测序。
3. 将SD-His平板上的菌落划线接种至5-FOA平板（YPD培养基 + 1 g/L 5-FOA），在30 °C培养1–2天，直至出现单菌落。此处，含有URA3基因的细胞会将5-FOA转化为有毒产物（5-氟脱氧尿苷）。因此，任何仍携带Hsp104质粒的细胞将死亡。
4. 将5-FOA平板上的单菌落平行划线接种至SD-Ura和SD-His平板。每个阳性克隆选取3个菌落进行检测，以提高每个阳性克隆中至少有一个菌落丢失Hsp104质粒的可能性。30 °C培养1–2天。丢失Hsp104质粒的菌落在SD-His平板上生长，但在SD-Ura平板上不生长。
5. 培养已丢失 Hsp104 质粒的菌株用于点板实验。将菌株在棉子糖缺失培养基中培养至饱和状态（例如 在30 ºC、振荡条件下，将SRaff-His）接种于96孔深孔板（每孔2 ml）中过夜培养。务必包含经5-FOA处理的对照菌株。
6. 准备用于点板实验的平板。使用多通道移液器，将200 µl棉子糖缺失培养基（raffinose dropout media）分装至各孔中。例如 在96孔板的每个孔中加入SRaff-His），将第1列和第7列保留用于纯培养物。将每种16种饱和培养物各250 µl分装至该板的第1列和第7列中。
7. 将培养物在每列中进行5倍系列稀释，使用多通道移液器充分混匀。从第6列和第12列中各移除50 µl稀释后的培养物，以确保每个孔的终体积为200 µl。此步骤对于实现均匀点样至关重要。
8. 使用96孔复制接种工具（frogger），将培养物以复孔形式点接到SD-His和SGal-His平板上。于30 °C培养2至3天。
9. 选择在 SGal-His 平板上表现出与对照相似毒性的菌株进行测序。将毒性弱于对照的菌株视为假阳性并弃去。5-FOA 本身也常具有毒性，因此若菌株在 SD-His 平板上表现出生长缺陷，或其毒性显著强于疾病底物单独作用时的水平，应予以弃去。图3).

5. 通过菌落PCR对Hsp104变体进行测序

1. 从 SD-His-Ura 平板上刮取约 10 μl 酵母至含有 3 μl 20 mM NaOH 的 PCR 条形管中，通过冻融法裂解细胞。将条形管置于 -80 ºC 冰箱中 10 分钟或液氮中冷冻，随后在热循环仪中 99 ºC 孵育 10 分钟。用 PCR 级水将菌株稀释至 100 µl。
2. 配制 PCR 反应体系：5 μl PCR 模板，每种引物各 0.5 μl（100 μM），0.5 μl 10 mM dNTPs，0.25 μl DNA 聚合酶（溶于 PCR 缓冲液中），用 PCR 级水补足至总体积 25 μl。设计引物以扩增随机化区域及其两端各约 100 bp 的序列。应尽量缩小扩增区域的大小，以提高扩增成功的可能性。运行标准 PCR 程序。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析样品，确认是否扩增出正确大小的 PCR 产物。若无产物，则需重复 PCR。
   注意：PCR 失败通常是因为步骤 5.1 中使用的酵母量过多。
4. 准备用于 DNA 测序的样品。可通过 PCR 纯化或使用 PCR 产物纯化试剂（如 Exonuclease I 与虾碱性磷酸酶酶混合物，ExoSAP-IT）去除 PCR 引物，以降解单链 DNA。该试剂可酶促降解未掺入的引物和 dNTPs，从而实现更高通量的测序准备。
5. 对 PCR 产物进行测序。务必仔细分析测序色谱图中的突变。由于酵母通常含有多个质粒，因此在特定位点可能观察到两种核苷酸的混合信号（图 4）。

结果

我们构建了一个在中间结构域随机突变的Hsp104变异体文库，并筛选其对TDP-43毒性的抑制作用。将该文库转化后分别涂布于葡萄糖和半乳糖平板上（图2），以评估筛选的严格性。挑选单菌落，随后利用5-FOA对菌株进行反向筛选，以消除Hsp104质粒。然后对这些菌株进行检测，以确认毒性仅由TDP-43引起，而不受Hsp104变异体的影响。对初筛中选出的部分变异体进行点种实验，结果显示，在挑选的4个菌落中，有2个表现出Hsp104介导的TDP-43毒性抑制作用，1个为假阳性，1个在5-FOA处理后毒性增强（图3）。对2个真实阳性克隆通过菌落PCR测序，确定其中间结构域的突变位点（图4）。在明确这些突变后，通过定点突变技术在亲本Hsp104质粒中重新构建Hsp104突变，以验证其对毒性的抑制作用。利用这些方法筛选出的变异体后续被证实可在酵母中抑制蛋白聚集，在生化实验中清除预先形成的聚集体，并在帕金森病的C. elegans模型中抑制多巴胺能神经元的退行性变¹⁷。

讨论

本文介绍了我们利用酵母蛋白质病变模型分离出能够抑制疾病相关底物毒性的增强型Hsp104变体的方法。通过该方法，可对大量变体文库进行高通量筛选，唯一的限制因素是通过5-FOA二次筛选的变体数量。通过在96孔板中进行这些步骤，我们通常可在1至2周内每次筛选多达200个阳性克隆进入5-FOA筛选阶段。初始筛选步骤中获得的阳性克隆数量在很大程度上取决于底物的毒性以及各个文库的具体组成。在对阳性克隆进行测序时，必须仔细分析所有测序色谱图，因为每个细胞中通常含有多种质粒的混合物。

我们有时发现，有较大部分的 Hsp104^WT 被鉴定为“阳性结果”，这可能是由于存在自发性遗传抑制子或活性极弱所致。为避免这一问题，我们发现，在较高温度下（例如 34 °C）进行筛选可降低 Hsp104^WT 作为“阳性结果”的比例。此外，对任何经测序获得的阳性结果，必须重新克隆，以独立评估新变体的活性，并确保质粒的纯度。一旦鉴定出新的阳性结果，即可在酵母中评估其对聚集的抑制作用，并进行生化表征。

我们...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GeneMorphII EZClone 定点突变试剂盒	Agilent	200552
150 mm 培养皿	Falcon	351058
5-氟乳清酸	Research Products International	f10501-5.0
96深孔2 ml板	Eppendorf	0030 502.302
96针高密度复制工具	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200