本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。
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本文内容
摘要
摘要
单个纳米颗粒中结合磁性与等离子体特性，可在多种生物医学应用中产生协同效应，包括在新型磁驱成像模式中增强对比度、同时捕获 和检测循环肿瘤细胞（CTCs）， 以及结合光热治疗的多模态分子成像。这些应用激发了人们对开发具有近红外（NIR）区光学吸收性和强磁矩的磁等离子体纳米颗粒合成方案的广泛兴趣。本文介绍一种基于水包油微乳液法的新型杂化纳米颗粒合成方案。本方案的独特之处在于，利用同样具备磁等离子体特性的初级结构单元，合成出不同尺寸的磁等离子体纳米颗粒。该方法获得的纳米颗粒具有高密度的磁性和等离子体功能单元，且在纳米颗粒体积内均匀分布。通过Fc片段将抗体连接至杂化纳米颗粒，可轻松实现功能化，同时保留负责抗原结合的Fab区域，用于靶向识别。
引言
由具有不同理化性质的多种材料组成的杂化纳米颗粒可在生物医学应用中开辟新的机遇，包括多模态分子成像、治疗递送与监测、新型筛选与诊断检测方法1-3。将等离子体与磁性特性集于单一纳米颗粒中尤其引人关注，因为它兼具等离子体共振相关的强光散射与吸收截面，以及对外加磁场的响应能力。 例如，磁-等离子体纳米颗粒已被用于通过外部电磁铁施加时间信号调制，从而增强标记细胞暗场成像中的对比度3-5。最近，类似原理已被应用于一种新型成像技术——磁-光声成像的开发中，其中磁-等离子体纳米颗粒显著提升了 对比度和信背比6,7。已有研究证明，此类杂化纳米颗粒可用于全血及体内循环肿瘤细胞的同步捕获与检测8,9。 此外，磁-等离子体纳米颗粒是一类极具前景的诊疗一体化试剂，可实现分子特异性光学与磁共振成像，并结合光热治疗用于癌细胞的靶向治疗10。
已探索多种方法用于合成磁等离子体纳米颗粒。例如，Yu 等 利用了Fe(CO)的分解与氧化5 开启 金纳米颗粒形成哑铃状双功能Au–Fe3O4 纳米颗粒11. Wang 等 已通过热分解法制备了金包覆的氧化铁纳米颗粒12一些其他方法依赖于将聚合物或胺功能分子包覆在磁性核纳米颗粒上，随后在聚合物表面沉积金壳，以制备杂化颗粒7,13此外，通过静电相互作用或化学反应将氧化铁纳米颗粒连接到金纳米棒上14,15尽管这些方法能够制备出磁-等离激元纳米结构，但在一定程度上会牺牲该复合结构的某些关键性能，例如近红外（NIR）窗口内的光学吸收能力或强磁矩，而这些特性在生物医学应用中极为重要。例如， 哑铃形金-铁3O4 纳米颗粒在520 nm处具有等离子体共振峰，这限制了其应用范围 体内 由于该光谱范围内组织浑浊度较高。此外，所制备的磁等离子体纳米颗粒 现有方案仅限于一种11 或少数（少于10个）14,15 超顺磁性基团（例如，其包含的氧化铁纳米颗粒数量远低于致密排列的纳米结构所能达到的水平。例如，一个紧密堆积的直径为60 nm的球形纳米颗粒，可容纳约一千个直径为6 nm的超顺磁性纳米颗粒。因此，这类杂化纳米颗粒的磁学性能仍有很大的提升空间。此外，前述部分已有报道的制备方法相对复杂，且在合成过程中需要精细优化，以避免颗粒发生聚集。14,15.
在此，我们描述了一种合成具有强磁矩和强近红外吸收性能的磁等离子体纳米颗粒的方案，该方案克服了现有技术的主要局限性。该合成方法源于油包水微乳液法。16基于将更小的初级粒子组装成所需尺寸的纳米粒子。该方法已成功用于由单一材料（如金、氧化铁和半导体初级粒子）制备纳米结构。16我们将其拓展应用于磁-等离子体纳米粒子的合成，首先制备直径为6 nm的金壳/氧化铁核颗粒，然后将这些初级杂化颗粒组装成最终的球形纳米结构。将初级颗粒组装成纳米簇不仅能够增强其组成纳米粒子的性能，例如在保持超顺磁性的同时获得更强的磁矩，还能利用各个纳米粒子之间的相互作用，从而 创建 在近红外窗口具有强烈光学吸收等原始组分纳米粒子所不具备的新特性。该方案可制备出具有高密度磁性和等离激元功能的杂化纳米粒子。在完成初级粒子的合成后，本方法本质上为一个简单的单釜反应。整体等离激元共振强度和磁矩由以下因素决定 初级粒子的数量，因此可根据具体应用轻松优化。此外，我们还开发了一种将抗体偶联到杂化纳米粒子的方案，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。抗体通过其Fc片段连接，从而保留负责抗原结合的Fab区域用于靶向。
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方案
1. 仪器与玻璃器皿的准备
- 穿戴适当的防护装备， 即实验服、一次性手套和护目用具。
- 将圆底烧瓶连接至冷凝管，并将其浸入硅油浴中，通过温度计监测油浴温度。放置热源（例如， 热板）置于油浴下方（图1使用能够测量高于260 °C温度的温度计。
2. 一次杂化磁等离子体纳米颗粒的合成
- 制备磁性核纳米颗粒
- 将353.2 mg（1 mmol）乙酰丙酮铁(III)、1 ml（2 mmol）油酸、1 ml（2 mmol）油胺、1.292 g（5 mmol）1,2-十六烷二醇和10 ml苯基醚加入圆底烧瓶中。
- 使用磁力搅拌子剧烈搅拌混合物，并在回流条件下加热至250–260 °C，持续1小时。随后，等待溶液冷却至室温。确保温度低于260 °C，以防止苯基醚沸腾，避免反应混合物从圆底烧瓶喷溅至冷凝管。
注意：反应混合物温度极高，化学品可能引起刺激。必须在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备。确保油浴具有足够的通风。
备注：在磁性纳米颗粒合成过程中，油浴需保持在250–260 ºC温度下持续1 小时。原则上可使用Pyrex玻璃皿实现该目的。然而，根据供应商信息，Pyrex玻璃的最高持续使用温度约为260 ºC。因此，金属容器是更安全的选择，因其可耐受更高温度，并在多次使用中具有更长的使用寿命。
- 在磁性核纳米颗粒上沉积金壳
- 将411.5 mg（1.1 mmol）乙酸金、0.25 ml（0.75 mmol）油酸、1.5 ml（3.0 mmol）油胺、775.3 mg（3 mmol）1,2-十六烷二醇和15 ml苯基醚加入圆底烧瓶中。
- 加入5 ml来自步骤2.1的磁性纳米颗粒悬浮液。将反应混合物加热至180 °C，并在回流条件下保持1小时。等待溶液冷却至室温。
- 加入50 ml乙醇以沉淀杂化初级纳米颗粒，随后在3,250 × g条件下离心15分钟。
- 使用水浴超声仪将沉淀物重悬于25 ml正己烷中。加入25 ml乙醇以再次沉淀初级杂化纳米颗粒。在3,250 x g条件下离心15分钟，并将沉淀物重新悬浮于正己烷中。重复此步骤三次。
- 将沉淀的初级杂化纳米颗粒在真空干燥器中过夜干燥。确认颗粒已完全干燥。
3. 杂化磁等离子体纳米簇的合成与尺寸分离
- 使用水浴超声仪将5 mg干燥的初级杂化纳米颗粒溶于1 ml正己烷中。超声处理纳米颗粒悬浮液，直至无可见沉淀物。
- 将步骤3.1所得溶液逐滴加入含有10 ml十二烷基硫酸钠水溶液（2.8 mg/ml）的20 ml带盖玻璃小瓶中。逐滴加入初级杂化纳米颗粒悬浮液，以避免在下一步操作前两相过早混合。
- 将两相混合液在水浴超声仪中超声处理2小时，随后在80 °C水浴中加热10分钟。待溶液冷却至室温。
- 将水加至超声仪工作液位线处。将玻璃小瓶置于超声仪中心位置。两相之间立即形成乳液。超声开始后用手轻轻摇动两相溶液，以促进含初级杂化纳米颗粒的相与下层水相之间的混合。
注意：超声仪连续运行2小时后会产生热量，请注意。
- 将水加至超声仪工作液位线处。将玻璃小瓶置于超声仪中心位置。两相之间立即形成乳液。超声开始后用手轻轻摇动两相溶液，以促进含初级杂化纳米颗粒的相与下层水相之间的混合。
- 将杂化纳米团簇悬浮液在100 x g条件下离心30分钟。收集沉淀和上清液。将沉淀在0.1 mM柠檬酸钠溶液中重新悬浮，并进行10分钟超声处理。所得纳米团簇的预期直径约为180 nm。
- 将步骤3.3所得上清液转移至新的锥形管中。
- 将步骤3.4所得悬浮液在400 x g条件下离心30分钟。收集沉淀和上清液。将沉淀在0.1 mM柠檬酸钠溶液中重新悬浮，并进行10分钟超声处理。所得纳米团簇的预期直径约为130 nm。
- 将步骤3.5所得上清液转移至新的锥形管中。
- 将步骤3.6所得悬浮液在1,500 x g条件下离心30分钟。收集沉淀，并在0.1 mM柠檬酸钠溶液中重新悬浮，进行10分钟超声处理。所得纳米团簇的预期直径约为90 nm。
- 取300 μl纳米团簇悬浮液加入96孔微孔板，用于测定UV-Vis-NIR吸收光谱。取10 μl纳米团簇悬浮液滴加于碳支持膜铜网上，用于透射电子显微镜（TEM）成像。
4. 单克隆抗体与纳米簇的偶联
- 在 PBS（pH 7.2）中配制 100 μl 单克隆抗体溶液（1 mg/ml） 例如，抗表皮生长因子受体2（HER2）抗体或抗表皮生长因子受体1（EGFR）抗体。
- 将步骤 4.1 中的抗体溶液加入 3.9 ml 4 mM HEPES（pH 7.2）中。将溶液通过 10 k MWCO 离心滤膜，在 3,250 x g，20 分钟，8 °C。用 4 mM HEPES（pH 7.2）将抗体重悬至终体积 100 μl。
注意：此步骤旨在用 HEPES 缓冲液替换抗体溶液中的原始培养基。 - 加入10 μl 100 mM NaIO4 加入100 μl抗体溶液。用铝箔包裹反应管，在室温下使用旋转摇床混匀30分钟。
- 通过加入 500 μl 的 1x PBS 终止反应。
- 加入 2 μl 的 46.5 mM 连接剂溶液（二硫代芳基 PEG6-CONHNH）2将步骤 4.4 中的抗体溶液加入并室温振荡孵育 1 小时。
- 使用10 k MWCO离心过滤器在3,250 x g条件下过滤溶液 8 °C下离心20分钟。用1×PBS重悬抗体至终体积100 μl，得到抗体浓度约为1 mg/ml。
- 将100 μl O.D. ~1.0的纳米簇悬液与1 μl来自步骤4.6的修饰抗体（1 mg/ml）在室温下混合孵育120分钟。
- 加入10 μl的10-3 5 kDa 巯基 PEG，室温下振荡 15 分钟。
- 将溶液在830 x g下离心 离心3分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于100 μl含2%（w/v）5 kDa PEG的PBS（pH 7.2）中。
- 测量抗体偶联纳米簇的吸光度谱，并与未修饰纳米簇的吸光度谱进行比较。偶联后预期出现数纳米的红移。
- 如果纳米颗粒发生聚集，表现为红光至近红外区域吸光度（O.D.）显著升高，则将巯基聚乙二醇（thiol PEG）的浓度提高至5倍 10-3 M。此外，将巯基PEG的孵育时间延长至30分钟，并将离心速度降低至200 × g 克增量。
- 用于癌细胞标记检测时，将步骤4.9中获得的抗体偶联纳米颗粒加入癌细胞悬液中，悬液可为培养基或1×PBS（1 ml约含10⁶细胞）。6 细胞）并混匀60分钟。
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结果
一种免疫靶向磁-等离子体纳米簇合成方案如图所示 图2首先，使用磁性Fe3O4 氧化铁纳米颗粒通过热分解法制备。随后，包被一层薄薄的 约 通过热分解法在氧化铁核颗粒上沉积1 nm的金壳。初级 约 6 nm杂化纳米颗粒作为种子，通过水包油微乳液法构建磁等离子体纳米簇。该纳米簇经单克隆抗体功能化修饰，实现分子特异性靶向。
合成的氧化铁核纳米颗粒的尺寸约为5 nm直径。在磁性核上沉积金壳后，氧化铁核/金壳初级纳米颗粒的尺寸增大至约6 nm直径。胶体颜色从氧化铁纳米颗粒的棕色变为沉积金壳后的红紫色，最终在初级颗粒组装成直径约180 nm的球形纳米簇后，呈现紫灰色（图3）。紫外-可见光谱显示，氧化铁核/金壳初级纳米颗粒在530 nm处具有明显的共振峰，而未包覆的氧化铁颗粒则无此峰（图4）。在形成簇结构后，光谱发生显著变化，并表现出强烈的宽近红外吸收（图4）。
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讨论
成功合成磁等离子体纳米簇的关键步骤包括制备高度单分散的金壳/氧化铁核初级纳米颗粒，以及引导这些初级颗粒自组装形成纳米簇。初级颗粒与表面活性剂之间的摩尔比在决定纳米簇尺寸分布方面起着重要作用。初级纳米颗粒尺寸分布不均可能导致在磁等离子体纳米簇组装过程中形成大的聚集体。此外，纳米簇形成的微乳液方法依赖于两亲性表面活性剂：疏水尾基将初级纳米颗粒聚集在一起，而亲水头基则在水溶液中稳定纳米簇。表面活性剂的浓度决定了纳米簇的组装行为：高浓度会导致形成较小的纳米簇或单个初级颗粒，而低浓度则会引起颗粒聚集。
新合成的纳米簇具有较宽的尺寸分布，范围从 约 50 nm 到 约 300 nm，需要额外的分离步骤。按照上述方案中逐渐增加离心速度的方式进行离心，可获得良好的分离效果，所得各组分的粒径分布分别为 90 ± 18 nm、130 ± 26 nm 和 180 ± 39 nm。若需进一步实现更精细的分离以获得更窄的粒径分布，可采用尺寸排阻色谱法。还应注意，这些纳米簇在红光至近红外区域具有宽广的吸收特性，因而可利用该范围内的任意光源激发其表面等离子体共振 约 ...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R01 EB008101和R01 CA103830的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PYREX 50 ml 短颈圆底烧瓶 & 24/40 [ST] 关节 | 康宁 | 4320A-50 | 热分解反应 |
| PYREX 41 x 300 mm 五球阿林冷凝管，外/内接口为 24/40 [ST] | 康宁 | 2480-300 | 热分解反应 |
| 硅油 | Fisher | S159-500 | 油浴 |
| 加热磁力搅拌器 | 康宁 | PC-351 | 在搅拌条件下加热反应 |
| 温度计 | ThermoWorks | 221-092 | 测量温度 |
| 乙酰丙酮铁(III) | Fisher | AC11913-0250 | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 油酸 99% | Fisher | A195-500 | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 乙酸金(III) | Fisher | AA3974206 | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 己烷 | Fisher | H292-1 | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 苯醚 99% | Fisher | AC13060-0025 | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 1,2-十六烷二醇 90% | Sigma | 213748-50G | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 油胺 70% | Sigma | O7805-100G | 初级杂化纳米颗粒合成材料 |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher | BP166-100 | 团簇合成 |
| 柠檬酸钠二水合物 | Sigma | W302600 | 团簇合成 |
| 单克隆抗EGF受体抗体 | Sigma | E2156 | 细胞标记特异性检测 |
| 单克隆抗HER2抗体 | Sigma | AMAB90627 | 细胞标记特异性检测 |
| 高碘酸钠 | Sigma | 311448 | 氧化抗体的 Fc 区域 |
| 二硫代芳香族 PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | 用于抗体与纳米簇偶联的双功能连接剂 |
| 甲氧基-聚乙二醇-硫醇，5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | 抗体偶联后钝化剩余的金表面 |
| Amicon Ultra-4 离心滤过装置（Ultracel-10 膜） | Millipore | UFC801008 | 蛋白质纯化 |
| HEPES | Sigma | H3375 | 缓冲液 |
| PBS，1×溶液 | Fisher | BP2438-20 | 缓冲液 |
| 紫外-可见光谱法 | BioTek | Synergy HT | 获取光谱 |
| 离心 | Eppendorf | 5810R | 分离 |
| 透射电子显微镜 | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | 获取纳米结构的形貌 |
| 直立显微镜 | Leica | DM6000 | 获取暗场图像 |
| 超声波破碎仪 | 布拉森 | 1510 | 超声处理 |
| 碳支持膜300目铜网 | EMS | CF300-Cu | 透射电子显微镜成像 |
| 96孔板 | 康宁 | 09-761-145 | 紫外-可见光读板仪 |
参考文献
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重印与许可
