需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量

11.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52095

⸱

2014年11月18日

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

本文内容

摘要

microRNA（miRNA）是一类广泛保守的调控分子。本文介绍一种miRNA克隆方法，该方法依赖于两个高效的连接步骤，随后进行高通量测序。本方法可实现miRNA的全基因组范围内精确量化。

摘要

miRNA克隆与高通量测序，简称miR-Seq，是一种能够以单核苷酸分辨率对miRNA进行全转录组定量的独特方法。该技术通过将3’和5’寡核苷酸接头连接到miRNA分子上，从而实现对miRNA的捕获，并允许后续的扩增与高通量测序分析。 从头合成 miRNA 发现。miR-Seq 与强大的下一代测序平台相结合，已在 miRNA 生物学研究中发挥关键作用。然而，由于寡核苷酸连接步骤引入的显著偏差，miR-Seq 尚无法被用作精确的定量工具。先前的研究表明，现有 miR-Seq 方法中的偏差常导致 miRNA 定量不准确，某些 miRNA 的误差可达 1,000 倍1,2为了解决RNA连接所引入的这些偏差，我们开发了一种小RNA连接方法，该方法在3′和5′连接步骤中的连接效率均超过95%。通过等摩尔或不同比例混合的合成miRNA对这一改进的文库构建方法进行基准测试，测序读段数量与预期值之间的偏差始终小于两倍。此外，这种高效率的miR-Seq方法能够实现准确的全基因组范围miRNA表达谱分析 体内 总RNA样品2.

引言

近年来，基于高通量测序的方法已被广泛应用于多种生物样本，极大地拓展了我们对生物系统分子复杂性的理解3,4。然而，用于高通量测序的RNA样本制备过程常常引入与所采用方法相关的特异性偏差，限制了这些强大技术的潜在应用价值。这些方法特异性的偏差在基于连接的小RNA文库构建过程中已有充分报道1,2,5,6。这些偏差可导致等摩尔合成的miRNA在测序读数上出现高达1000倍的差异，使得从测序数据中推断miRNA丰度的结果极不稳定且容易出错。

针对噬菌体来源的T4 RNA连接酶特性的研究已表明，这些酶具有基于核苷酸的偏好性7，在高通量测序实验中表现为文库的序列偏好性偏差1,2,8。为了最大限度地减少RNA连接酶带来的偏差，已采用多种策略：大分子拥挤效应9、在靠近连接位点的接头端随机化核苷酸序列6，以及使用高浓度的连接接头2。通过结合上述三种方法，我们建立了一种适用于高通量测序的小RNA文库无偏制备流程（图1）。如需对现有方案与我们优化后的方法进行直接比较，请参见我们近期的报告2。该优化方法在3’和5’连接步骤中的连接效率均超过95%，并可实现对合成样本和生物样本中小RNA分子的无偏连接2。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：整个操作过程中必须保持无RNase的环境。

1. 3’ 连接子的腺苷酸化

  1. 将用于 3’ 连接反应的 DNA 寡核苷酸稀释至 100 μ无核酸酶水中的 M2O.
    注意：寡核苷酸应在5’端具有磷酸基团、5’端起始处含有随机二核苷酸，并在3’端带有双脱氧胞苷。5’磷酸基团是该反应所必需的 Mth 高效 5’ 腺苷酰化酶10磷酸基团可通过多核苷酸激酶对寡核苷酸进行预处理来添加，也可直接订购带有该修饰的序列。5’端的随机二核苷酸对于最小化RNA连接酶在不同末端连接反应中的序列偏好性至关重要。63’-双脱氧胞苷在寡核苷酸的3’端引入一个阻断元件，以抑制后续连接步骤中接头-接头串联体的形成，同时也能阻断3’连接反应结束时生成的miRNA-接头分子的3’端11用于无偏倚miR-Seq方法的寡核苷酸接头序列为： 5’PO4NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-二脱氧C3’
  2. 组装以下腺苷酸化反应：200 pmol 3’接头寡核苷酸，4 μl 10x 5’ DNA 腺苷酸化缓冲液，4 μl 1 mM ATP，4 μl Mth 无核酸酶 RNA 连接酶 H2O 至终体积 40 μl.
  3. 在 65 ℃ 下孵育反应 °C 反应1小时。通过加热至85℃终止反应 °C，持续5分钟。
  4. 加入2.5倍体积的100%乙醇和1/3体积的10 M醋酸铵，使腺苷化接头沉淀，以去除残留的ATP，并防止后续反应中发生意外连接。
    1. 简而言之，将酒精、盐和寡核苷酸溶液混合均匀，在4℃下以微型离心机全速离心（约15,000 × g） °C下孵育20分钟。用70%乙醇洗涤沉淀，空气干燥，然后重悬于适量体积的无核酸酶水（nuclease-free H₂O）中。2O 以产生 50-100 μ腺苷酸化寡核苷酸的摩尔浓度
  5. 通过运行18%聚丙烯酰胺凝胶确认腺苷酸化。
    1. 将以下成分混合以制备凝胶：6.3 g 尿素、6.75 ml 40% 丙烯酰胺和 1.5 ml 10x TBE。加入H20 至 15 毫升。
    2. 混匀直至尿素完全溶解，然后加入150 µl 10% (w/v) 过硫酸铵（APS）和 15 µ四甲基乙二胺（TEMED）
    3. 凝胶完全凝固后，用1×电泳缓冲液以每厘米凝胶宽度24 V的电压预电泳30分钟 室温下的TBE电泳缓冲液。30分钟后，用运行缓冲液冲洗加样孔。
    4. 将 5 pmol 腺苷酸化寡核苷酸与等体积的 2x 混合 变性RNA上样缓冲液（95% (v/v) 甲酰胺，0.02% (w/v) SDS，0.02% (w/v) 溴酚蓝，0.01% (w/v) 二甲苯蓝，1.0 mM EDTA），短暂加热至75℃ °C，并在冰上快速冷却。将全部样品加入凝胶孔中。同时加入等量的非腺苷酸化对照品以及低分子量大小标准品。
    5. 以 24 V/cm 的电压电泳，直至溴酚蓝迁移至所需位置 ¾ 至凝胶底部约三分之二处。拆卸装置，用1x染色液对凝胶进行染色 1× SYBR Gold 溶液 TBE 缓冲液，并在紫外透射仪上观察图2).
      注意：如果“无输入RNA”对照组相比含有输入RNA的样本产生大量PCR产物，请参照上述方法对腺苷酸化寡核苷酸进行凝胶纯化。

2. 将接头连接至miRNA的3’端

  1. 3’ 连接
    1. 在冰上按以下顺序组装组分：1.0 μl 50% (w/v) PEG 8000, 0.5 μl 10x RNA连接酶缓冲液（500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl₂）2，10 mM DTT），1.0 μl 腺苷酸化 3’ 连接子（100 μM），0.5 μl RNase抑制剂，0.5-8.0 μg 总RNA，0.5 μ无核酸酶 T4 RNA 连接酶 22O 至终体积 5 μl.
    2. 使用移液器吹打混匀反应液，由于PEG 8000浓度较高，溶液黏稠，无法通过涡旋振荡混匀。充分混匀后，将反应体系置于带有加热盖的PCR仪中，将模块温度设定为16 °C，孵育4小时。
      注意：该反应可按比例放大至最终体积20 μ连接效率无任何损失。反应4小时 在室温下或4℃过夜 °C，以获得基本相同的连接效率。
  2. 凝胶纯化
    1. 3’连接后，将反应物与等体积的2x混合 RNA上样缓冲液。70℃加热 °5分钟，然后在冰上迅速冷却。
    2. 在15%聚丙烯酰胺凝胶上进行样品电泳，用于PAGE纯化。
      1. 制备含有7 M尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶，方法与之前步骤1.5中所述类似。
      2. 以每厘米凝胶宽度24 V的电压预电泳至少30分钟。关闭电源，冲洗加样孔，加入样品后在与预电泳相同的电压下进行电泳。
      3. 上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），直至溴酚蓝刚好移出凝胶。目标产物的迁移位置接近二甲苯氰醇。
  3. 染色、可视化与切除
    1. 拆卸凝胶装置，将凝胶放入盛有1x缓冲液的洁净托盘中 TBE电泳缓冲液（1×） SYBR Gold，振荡15分钟。
    2. 从染色皿中取出凝胶，在覆盖有干净塑料膜的紫外透射仪上观察。连接产物的长度应约为45个核苷酸。
    3. 用洁净的剃须刀片切下含有连接产物的区域，并放入0.5 ml微量离心管中。
  4. 产物分离与沉淀
    1. 用30 G针头刺穿0.5 ml微量离心管底部 用针头穿刺管壁，并将穿刺后的管子放入另一个干净的低吸附性1.5 ml微量离心管中。在约15,000 x g条件下离心5分钟。
    2. 目视确认整个胶块已通过内管上的孔洞。如有必要，可用干净的移液枪头将部分胶块碎片推近孔洞。
    3. 弃去空的0.5 ml离心管，加入400 μ加入 l 高盐柱缓冲液（HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% SDS）至丙烯酰胺悬浮液中。4 ℃下轻轻摇动管子 °C 过夜。
    4. 使用宽口移液器吸头将浆液转移至0.22微米醋酸纤维素旋转柱中。室温下于约15,000 × g离心3分钟，以完全收集脱离丙烯酰胺凝胶基质的液体。
    5. 将液体转移至含有1的洁净低吸附性1.5 ml离心管中 μ20 mg/ml 甘氨酸溶液。加入等体积异丙醇和 1/10 体积th 醋酸钠体积。通过反复倒置离心管混匀溶液，并在-80℃下沉淀 °C 冷冻箱中冷冻 20 分钟。
    6. 在4℃下以最大速度离心 °在4°C下离心20分钟以沉淀核酸。弃上清，用70%乙醇洗涤。室温下空气干燥沉淀10分钟，随后直接进行5’连接步骤。

3. 将接头连接至miRNA-3'接头杂交体的5'端

  1. 向核酸沉淀中加入以下组分：2 µl PEG 8000（50% w/v）、0.5 µl 10x RNA连接酶缓冲液、0.5 µl ATP（10 mM）、0.5 µl NN-RNA寡核苷酸（100 µM），以及H2O补足至终体积4 µl。
    注意：“NN-RNA寡核苷酸”的序列为5’-倒置双脱氧-TCUACAGUCCGACGAUCNN3’，由生产商通过HPLC纯化。
  2. 通过反复吹打混匀该样品。持续操作一段时间（最长5分钟），以确保沉淀完全重新溶解。若溶解困难，可将样品短暂加热（3–5分钟）至37 °C，然后继续吹打混匀。
  3. 待沉淀完全溶解后，将溶液转移至含有1 μl RNase抑制剂与T4 RNA连接酶1（5单位）1:1混合液的洁净PCR管中。再次通过吹打上下混匀。
  4. 在PCR仪中于37 °C孵育反应体系4小时。随后立即进行cDNA合成。

4. 逆转录/cDNA 合成

  1. 向5’连接反应中加入以下组分：2 µl 5x RT缓冲液、0.75 µl 100 mM DTT、1 µl Illumina RT引物5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（1 µM）以及0.5 µl dNTPs（10 mM）。
  2. 用移液器混匀，65 °C加热5分钟，然后在实验台上缓慢冷却。
  3. 待反应冷却至室温后，将离心管置于冰上，各加入0.5 μl逆转录酶和RNase抑制剂。用移液器混匀后，放入热循环仪中，按照制造商说明书进行延伸步骤。
  4. 反应完成后，加入5 μl无核酸酶的H2O，使cDNA文库的终体积达到15 μl。

5. 文库构建

  1. 对于索引PCR，在冰上配制以下反应体系：6 µl 5x Phusion缓冲液，1 µl dNTPs（10 mM），0.9 µl DMSO，0.75 µl 5’ 引物（25 µM），0.75 µl 3’ 引物（25 µM), 3 µl cDNA文库（浓度可变，取决于投入量），0.5 µPhusion 聚合酶（1 单位），无核酸酶 H2O 至终体积 30 μl. 选择引物序列，以确保其与模板及所选测序平台的兼容性。
    1. 使用以下条件运行PCR反应：98℃预变性 °C，3分钟，前4个循环，变性98 °C，50℃退火15秒 °C，15 秒；72℃ 延伸 °15 秒，温度为 C
      注意：根据起始材料的量调整总PCR循环次数。通常情况下，当起始量为1-2时 µ总RNA量为g时，进行13个完整的PCR循环足以构建miR-Seq文库。
    2. 进行后续循环， 例如， 循环5-12，采用两步法，其中退火和延伸步骤合并，在70℃下进行 °30 秒，温度为 C 变性温度再次为98 °15 秒，温度为 C
      注意：反应体系体积为 30 μl 以允许暂停PCR程序并取出10 μ在预定的循环数下取等分试样，以监测目标产物的出现情况。通常从总RNA样本中选择第10、13和16个循环进行检测。
  2. 配制8%非变性丙烯酰胺凝胶：混合2 ml 40%丙烯酰胺溶液与1 ml 10x TBE缓冲液， TBE 和 H20 至 10 毫升。然后加入 100 μ10% APS 和 10 μL μl TEMED。倒入凝胶，静置使其凝固。
    1. 以每厘米凝胶宽度12 V的电压预电泳30分钟。冲洗加样孔。加入1 μ10x 的升 上样缓冲液（15% Ficoll-400，66 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1% (w/v) SDS，0.01% (w/v) 溴酚蓝），加入10 μ将样品加入每个尺寸为 5 mm × 1 mm × 15 mm 的孔中。通常，每个孔最多可加载 30 μL μ样品的凝胶在1x缓冲液中以每厘米凝胶宽度10 V的电压运行 TBE 缓冲液电泳至溴酚蓝染料刚好从凝胶底部流出为止。
    2. 按照步骤2.3中所述对凝胶进行染色和观察。
    3. 切下146 bp条带，用0.25 ml HSCB以类似于2.4节所述的方法过夜洗脱。加入等体积异丙醇和1/10体积th 用醋酸钠定容。用70%乙醇洗涤沉淀，然后重悬于TE缓冲液中。
    4. 根据制造商的建议，使用PicoGreen对文库进行定量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

对于前述方法，预期结果应首先观察到经 Mth RNA 连接酶进行腺苷酸化修饰的 DNA 寡核苷酸出现单个核苷酸的大小偏移（增加）（图 2）。在 3’ 连接反应后，聚丙烯酰胺凝胶的成像结果显示（见 图 3），凝胶的 100–300 个核苷酸区域出现清晰的高分子量条带，表明所用总 RNA 样品质量较高（未降解）。其次，应在凝胶的 25 个核苷酸区域观察到一条非常明亮的信号，对应于过量的未连接 3’ 接头。此外，在 3’ 连接反应中加入无 RNA 输入的阴性对照可能有助于分析。该对照可用于评估 3’ 接头的纯度，并可继续进行至 PCR 步骤，以判断非特异性信号开始出现时的循环数。目前尚无针对 5’ 连接反应的明确诊断性指标，但 图 4 展示了一个与前述方法相同的实验，使用放射性标记 RNA 进行，结果表明所采用的高浓度 PEG8000 具有重要作用。最后，在 PCR 扩增及天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）后，可观察到一条长度为 146 个碱基对的 DNA 产物，其大小与接头序列、miRNA 插入片段以及延伸 ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方法利用多个关键变量以最大化连接效率，主要包括高浓度的聚乙二醇（PEG）、使用随机接头以及高浓度的接头分子2,6,9。该方法可从总RNA样本中稳定地构建定量测序文库2。我们已对输入RNA量进行了多次滴定实验，结果表明上述方法最适合用于1–8 μg范围内的总RNA量（数据未显示）。当使用10–500 ng范围的RNA量时，测序读段中大部分被接头串联体及用于纯化RNA连接酶的细菌序列所占据。然而值得注意的是，在这些低输入量实验中，尽管miR物种的读段数较低，但其相对丰度仍能真实反映与高输入量样本相比较的实际含量。为了确保从总RNA样本中获得的miR表达谱能够真实反映实际分子丰度，并实现不同样本间的交叉比较，我们常规加入三种合成校准RNA的10倍系列稀释液12。我们发现，加入0.1:0.01:0.001 pmol的不同校准RNA可产生足够数量的测序读段，用于验证该检测方法的定量特性。

如图1所示（见星号标记），合成的寡核苷酸常含有与所订购序列大小不同的异常分子。如果这些产物能够与m...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Yi 实验室成员，特别是 Zhaojie Zhang，在连接子设计和连接效率方面的有益讨论；同时感谢美国癌症协会通过博士后奖学金（编号 #125209）对 J.E.L. 的资助。本研究工作还获得了美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助（资助号 R01AR059697，授予 R.Y.）以及来自 Linda Crnic 唐氏综合征研究所的研究基金支持。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3' 连接子（5' 磷酸化，3' 封闭）Integrated DNA Technologies定制
5' 连接子Integrated DNA Technologies定制5' 封闭，HPLC 纯化
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351S专用于连接预腺苷酸化的 DNA 接头
10x 连接反应缓冲液（不含 ATP）New England Biolabs随 M0351S 提供
10x 连接反应缓冲液（含 ATP）New England Biolabs随 M0204L 提供
RNaseOUTInvitrogen10777-019
聚乙二醇（分子量 8,000）New England Biolabs随 M0204L 提供
无核酸酶水AmbionAM9937我们发现蒸馏装置收集的水具有同等质量。
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III 反转录试剂盒Invitrogen18080-051 
Phusion PCR 试剂盒New England BiolabsM0530S
Illumina RP1 引物Integrated DNA Technologies定制序列信息可从 Illumina 获取
Illumina RT 引物Integrated DNA Technologies定制序列信息可从 Illumina 获取
Illumina index 引物Integrated DNA Technologies定制序列信息可从 Illumina 获取
40% 丙烯酰胺Fisher ScientificBP14081
尿素Sigma AldrichU6504
过硫酸铵Sigma AldrichA3678
四甲基乙二胺（TEMED）Sigma AldrichT9281
2x 变性 RNA 上样缓冲液New England Biolabs随 M0351S 提供
剃刀刀片VWR55411-050
SpinX Centricon 离心浓缩管CostarCLS8161
低吸附微量离心管Fisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
腺苷酸化试剂盒New England BiolabsE2610L

参考文献

  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109(2013).
  3. Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
  4. Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
  6. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).
  7. McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
  8. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).
  9. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
  10. Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
  11. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  12. Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
  13. Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

小RNA连接寡核苷酸接头miR-Seq方法RNA连接效率凝胶纯化cDNA合成聚合酶链式反应合成miRNA
小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。