小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量

摘要

microRNA（miRNA）是一类广泛保守的调控分子。本文介绍一种miRNA克隆方法，该方法依赖于两个高效的连接步骤，随后进行高通量测序。本方法可实现miRNA的全基因组范围内精确量化。

摘要

miRNA克隆与高通量测序，简称miR-Seq，是一种能够以单核苷酸分辨率对miRNA进行全转录组定量的独特方法。该技术通过将3’和5’寡核苷酸接头连接到miRNA分子上，从而实现对miRNA的捕获，并允许后续的扩增与高通量测序分析。 从头合成 miRNA 发现。miR-Seq 与强大的下一代测序平台相结合，已在 miRNA 生物学研究中发挥关键作用。然而，由于寡核苷酸连接步骤引入的显著偏差，miR-Seq 尚无法被用作精确的定量工具。先前的研究表明，现有 miR-Seq 方法中的偏差常导致 miRNA 定量不准确，某些 miRNA 的误差可达 1,000 倍^1,2为了解决RNA连接所引入的这些偏差，我们开发了一种小RNA连接方法，该方法在3′和5′连接步骤中的连接效率均超过95%。通过等摩尔或不同比例混合的合成miRNA对这一改进的文库构建方法进行基准测试，测序读段数量与预期值之间的偏差始终小于两倍。此外，这种高效率的miR-Seq方法能够实现准确的全基因组范围miRNA表达谱分析 体内 总RNA样品².

引言

近年来，基于高通量测序的方法已被广泛应用于多种生物样本，极大地拓展了我们对生物系统分子复杂性的理解^3,4。然而，用于高通量测序的RNA样本制备过程常常引入与所采用方法相关的特异性偏差，限制了这些强大技术的潜在应用价值。这些方法特异性的偏差在基于连接的小RNA文库构建过程中已有充分报道^1,2,5,6。这些偏差可导致等摩尔合成的miRNA在测序读数上出现高达1000倍的差异，使得从测序数据中推断miRNA丰度的结果极不稳定且容易出错。

针对噬菌体来源的T4 RNA连接酶特性的研究已表明，这些酶具有基于核苷酸的偏好性⁷，在高通量测序实验中表现为文库的序列偏好性偏差^1,2,8。为了最大限度地减少RNA连接酶带来的偏差，已采用多种策略：大分子拥挤效应⁹、在靠近连接位点的接头端随机化核苷酸序列⁶，以及使用高浓度的连接接头²。通过结合上述三种方法，我们建立了一种适用于高通量测序的小RNA文库无偏制备流程（图1）。如需对现有方案与我们优化后的方法进行直接比较，请参见我们近期的报告²。该优化方法在3’和5’连接步骤中的连接效率均超过95%，并可实现对合成样本和生物样本中小RNA分子的无偏连接²。

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方案

注意：整个操作过程中必须保持无RNase的环境。

1. 3’ 连接子的腺苷酸化

1. 将用于 3’ 连接反应的 DNA 寡核苷酸稀释至 100 μ无核酸酶水中的 M₂O.
   注意：寡核苷酸应在5’端具有磷酸基团、5’端起始处含有随机二核苷酸，并在3’端带有双脱氧胞苷。5’磷酸基团是该反应所必需的 Mth 高效 5’ 腺苷酰化酶¹⁰磷酸基团可通过多核苷酸激酶对寡核苷酸进行预处理来添加，也可直接订购带有该修饰的序列。5’端的随机二核苷酸对于最小化RNA连接酶在不同末端连接反应中的序列偏好性至关重要。⁶3’-双脱氧胞苷在寡核苷酸的3’端引入一个阻断元件，以抑制后续连接步骤中接头-接头串联体的形成，同时也能阻断3’连接反应结束时生成的miRNA-接头分子的3’端¹¹用于无偏倚miR-Seq方法的寡核苷酸接头序列为： 5’PO₄NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-二脱氧C3’
2. 组装以下腺苷酸化反应：200 pmol 3’接头寡核苷酸，4 μl 10x 5’ DNA 腺苷酸化缓冲液，4 μl 1 mM ATP，4 μl Mth 无核酸酶 RNA 连接酶 H₂O 至终体积 40 μl.<....

结果

对于前述方法，预期结果应首先观察到经 Mth RNA 连接酶进行腺苷酸化修饰的 DNA 寡核苷酸出现单个核苷酸的大小偏移（增加）（图 2）。在完成 3’ 连接后，聚丙烯酰胺凝胶的成像显示（见 图 3），凝胶的 100–300 个核苷酸区域出现清晰的高分子量条带，这表明所用的总 RNA 样品质量较高（未发生降解）。其次，应在凝胶的 25 个核苷酸区域观察到一个非常明亮的信号，该信号对应于过量的未连接的 3’ 接头。在 3’ 连接反应中加入无 RNA 输入的对照也可能有所帮助，这可用于评估 3’ 接头的纯度，并可继续进行至 PCR 步骤，以判断非特异性信号开始出现时的循环数。目前尚无针对 5’ 连接反应的明确诊断性指标，但 图 4 展示了一个与前述方法完全相同的实验，其中使用了放射性标记的 RNA，结果表明所采用的高浓度 PEG8000 具有重要作用。最后，在完成 PCR 及天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后，可观察到一条长度为 146 个碱基对的 DNA 产物，其大小与接头序列、miRNA 插入片段以及延伸 PCR 引.......

讨论

本文所述方法利用多个关键变量以最大化连接效率，主要包括高浓度的聚乙二醇（PEG）、使用随机接头以及高浓度的接头分子^2,6,9。该方法可从总RNA样本中稳定地构建定量测序文库²。我们已对输入RNA量进行了多次滴定实验，结果表明上述方法最适合用于1–8 μg范围内的总RNA量（数据未显示）。当使用10–500 ng范围的RNA量时，测序读段中大部分被接头串联体及用于纯化RNA连接酶的细菌序列所占据。然而值得注意的是，在这些低输入量实验中，尽管miR物种的读段数较低，但其相对丰度仍能真实反映与高输入量样本相比较的实际含量。为了确保从总RNA样本中获得的miR表达谱能够真实反映实际分子丰度，并实现不同样本间的交叉比较，我们常规加入三种合成校准RNA的10倍系列稀释液¹²。我们发现，加入0.1:0.01:0.001 pmol的不同校准RNA可产生足够数量的测序读段，用于验证该检测方法的定量特性。

如图1所示（见星号标记），合成的寡核苷酸常含有与所订购序列大小不同的异常分子。如果这些产物能够与m.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3' 连接子（5' 磷酸化，3' 封闭）	Integrated DNA Technologies	定制
5' 连接子	Integrated DNA Technologies	定制	5' 封闭，HPLC 纯化
T4RNL2 (1-249 K227Q)	New England Biolabs	M0351S	专用于连接预腺苷酸化的 DNA 接头
10x 连接反应缓冲液（不含 ATP）	New England Biolabs	随 M0351S 提供
10x 连接反应缓冲液（含 ATP）	New England Biolabs	随 M0204L 提供
RNaseOUT	Invitrogen	10777-019
聚乙二醇（分子量 8,000）	New England Biolabs	随 M0204L 提供
无核酸酶水	Ambion	AM9937	我们发现蒸馏装置收集的水具有同等质量。
T4RNL1	New England Biolabs	M0204L
Superscript III 反转录试剂盒	Invitrogen	18080-051
Phusion PCR 试剂盒	New England Biolabs	M0530S
Illumina RP1 引物	Integrated DNA Technologies	定制	序列信息可从 Illumina 获取
Illumina RT 引物	Integrated DNA Technologies	定制	序列信息可从 Illumina 获取
Illumina index 引物	Integrated DNA Technologies	定制	序列信息可从 Illumina 获取
40% 丙烯酰胺	Fisher Scientific	BP14081
尿素	Sigma Aldrich	U6504
过硫酸铵	Sigma Aldrich	A3678
四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma Aldrich	T9281
2x 变性 RNA 上样缓冲液	New England Biolabs	随 M0351S 提供
剃刀刀片	VWR	55411-050
SpinX Centricon 离心浓缩管	Costar	CLS8161
低吸附微量离心管	Fisher Scientific	02-681-320
Sybr Gold	Invitrogen	S-11494
腺苷酸化试剂盒	New England Biolabs	E2610L