通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

摘要

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。

摘要

造血干细胞（HSCs）在临床上用于移植治疗，以重建白血病和淋巴瘤等多种疾病患者的造血系统。阐明调控HSC自我更新与分化的机制，对于HSC在科研和临床应用中的发展具有重要意义。然而，由于HSC无法大量增殖，难以获得足量的HSCs 体外为克服这一难题，本研究采用小鼠骨髓来源的 EML（红系、髓系和淋巴系）细胞系作为模型系统。

RNA测序（RNA-Seq）已越来越多地用于取代基因芯片进行基因表达研究。本文报道了一种利用RNA-Seq技术研究调控EML细胞自我更新与分化潜在关键因子的详细方法。本论文提供的实验方案分为三个部分。第一部分介绍如何培养EML细胞并分离Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞。第二部分提供了总RNA提取及后续高通量测序文库构建的详细步骤。最后一部分描述了RNA-Seq数据分析方法，并解释如何利用这些数据鉴定Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞之间差异表达的转录因子。其中显著差异表达的转录因子被鉴定为可能调控EML细胞自我更新与分化的关键调控因子。在本文的讨论部分，我们重点强调了实验成功实施的关键步骤。

综上所述，本文提供了一种利用RNA-Seq技术鉴定EML细胞自我更新与分化潜在调控因子的方法。所鉴定的关键因子将进行下游功能分析。 体外 和 体内.

引言

造血干细胞是一类稀有的血细胞，主要存在于成体骨髓微环境中，负责生成补充血液系统和免疫系统所需的各类细胞。¹作为一类干细胞，HSCs 具备自我更新和分化的能力。阐明调控 HSCs 命运抉择（即自我更新或分化）的机制，将为 HSCs 在血液疾病研究和临床应用中的操控提供有价值的指导。²研究人员面临的一个问题是，造血干细胞（HSCs）可以在体外维持和扩增 体外 在极有限的程度上；其绝大多数子代在培养过程中仅部分分化².

为了在全基因组范围内鉴定调控自我更新和分化过程的关键调节因子，我们采用小鼠原始造血祖细胞系 EML 作为模型系统。该细胞系来源于小鼠骨髓^3,4。在不同生长因子的作用下，EML 细胞可在体外分化为红系、髓系和淋巴系细胞in vitro⁵。重要的是，该细胞系可在含有干细胞因子（SCF）的培养基中大量扩增，并仍保持其多向分化潜能。根据表面标志物 CD34 和 SCA 的表达，EML 细胞可分离为具有自我更新能力的 Lin-SCA+CD34+ 亚群和部分分化的 Lin-SCA-CD34- 亚群⁶。与短期造血干细胞类似，SCA+CD34+ 细胞具有自我更新能力。在 SCF 处理下，Lin-SCA+CD34+ 细胞可快速再生出混合的 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞群体，并持续增殖....

方案

1. 使用磁性细胞分选系统和荧光激活细胞分选法培养EML细胞并分离Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞

1. 用于干细胞因子收集的幼仓鼠肾（BHK）细胞培养基的制备：
   1. 在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基在25 cm²培养瓶（表1）中培养BHK细胞。
   2. 当细胞生长至80–90%融合度时，用10 ml PBS洗涤细胞一次。向单层细胞中加入5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温（RT）孵育1–5分钟，直至细胞脱落。
   3. 轻轻吹打溶液以分散细胞团块。向培养瓶中加入5 ml完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶活性。在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。
   4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜BHK细胞培养基中。
   5. 从步骤1.1.4中取2 ml细胞悬液转移至新的75 cm²培养瓶中，并向瓶中加入48 ml新鲜BHK细胞培养基。
   6. 继续培养BHK细胞两天后收集培养上清液。经0.45 μm滤膜过滤后，于-20 °C保存备用。
2. EML细胞培养：
   1. 在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下，将EML....

结果

为了分析 Lin-CD34+ 和 Lin-CD34- EML 细胞中差异表达的基因，我们采用了 RNA-Seq 技术。图 1 展示了实验流程。通过磁珠细胞分选法分离出谱系阴性细胞后，我们使用 FACS Aria 分选出 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞。谱系富集的 EML 细胞用抗 CD34、抗 Sca1 及谱系混合抗体进行染色。仅对 Lin- 细胞设门，以分析 Sca1 和 CD34 的表达。通过 FACS 分析可观察到两个细胞群（SCA+CD34+ 和 SCA-CD34- EML 细胞）（图 2）⁶。

细胞分离后，我们分别从CD34+和CD34-细胞中提取总RNA，并分析RNA的质量。RNA-Seq数据的准确性在很大程度上依赖于RNA-Seq文库的质量，而总RNA的质量对于构建高质量文库至关重要。高质量的RNA样品其OD 260/280值应在1.8至2.0之间。除了使用分光光度计外，还利用Bioanalyzer更精确地评估RNA质量。图3

讨论

哺乳动物转录组非常复杂^34-38RNA-Seq 技术在转录组分析、新转录本检测和单核苷酸变异发现的研究中正发挥着日益重要的作用 等等。 与其他基因表达分析方法相比，它具有多种优势。如引言中所述，该方法克服了微阵列的杂交假象问题，并可用于鉴定新转录本 从头合成RNA测序的一个局限性在于其读长相对较短，与桑格测序相比尤其如此。然而，随着测序技术的快速进步，读长正在持续增加。本文提供了利用该技术鉴定小鼠EML细胞自我更新与分化过程中潜在关键调控因子的详细方法。

本方案的第一个关键步骤是 EML 细胞培养。尽管 EML 是一种造血前体细胞系，可在干细胞因子（SCF）存在下大量扩增，但其培养条件相比常规永生化细胞系需要更加细致的控制。细胞应定期换液并传代，操作需轻柔；否则细胞的自我更新与分化特性可能发生改变，并出现细胞死亡。在收集到足够数量的细胞后，我们首先利用磁性激活细胞分选系统分离出谱系阴性细胞，随后通过荧光激活细胞分选法将 CD34+ 与 CD34- 细胞分开。通常在用于 RNA 提取前，EML 细胞传代不应超过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素	Invitrogen	15240-062	BHK 细胞培养
抗小鼠 CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	FACS 分选
抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	FACS 分选
APC 小鼠谱系抗体混合物	BD Biosciences	558074	FACS 分选
BD FACSAria 细胞分选仪	BD Biosciences	Special offer sysmtem	FACS 分选
Corning™ 细胞培养处理培养瓶 75 cm2	Corning incorporated	430641	细胞培养
Corning™ 细胞培养处理培养瓶 25 cm2	Corning incorporated	430639	细胞培养
脱氧核糖核酸酶 I，扩增级	Invitrogen	18068-015	文库制备
DMEM	Invitrogen	11965-092	BHK 细胞培养
DPBS	Gibco	14190	细胞培养
热灭活胎牛血清	Invitrogen	16140071	BHK 细胞培养
马血清	Invitrogen	16050-122	EML 细胞培养
IMDM	HyClone	SH30228.02	EML 细胞培养
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	细胞培养
谱系细胞耗竭试剂盒，小鼠	Miltenyi Biotec	130-090-858	谱系阴性细胞的分离
NanoVue Plus 分光光度计	GE Healthcare	28-9569-62	质量控制
Thermo Scientific™ Napco™ 8000 水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific	15-497-002	细胞培养
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122	EML 细胞培养
TRIzol® 试剂	Invitrogen	15596-018	RNA 提取
TruSeq™ RNA 样本制备试剂盒 v2 - B 套装（48 次反应）	Illumina	RS-122-2002	文库制备
2100 电泳生物分析仪	Agilent	G2939AA	质量控制
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200	细胞培养
0.45 µm 注射器滤器	Nalgene	190-2545	细胞培养