通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

摘要

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。

摘要

造血干细胞（HSCs）在临床上用于移植治疗，以重建白血病和淋巴瘤等多种疾病患者的造血系统。阐明调控HSC自我更新与分化的机制，对于HSC在科研和临床应用中的发展具有重要意义。然而，由于HSC无法大量增殖，难以获得足量的HSCs 体外为克服这一难题，本研究采用小鼠骨髓来源的 EML（红系、髓系和淋巴系）细胞系作为模型系统。

RNA测序（RNA-Seq）已越来越多地用于取代基因芯片进行基因表达研究。本文报道了一种利用RNA-Seq技术研究调控EML细胞自我更新与分化潜在关键因子的详细方法。本论文提供的实验方案分为三个部分。第一部分介绍如何培养EML细胞并分离Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞。第二部分提供了总RNA提取及后续高通量测序文库构建的详细步骤。最后一部分描述了RNA-Seq数据分析方法，并解释如何利用这些数据鉴定Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞之间差异表达的转录因子。其中显著差异表达的转录因子被鉴定为可能调控EML细胞自我更新与分化的关键调控因子。在本文的讨论部分，我们重点强调了实验成功实施的关键步骤。

综上所述，本文提供了一种利用RNA-Seq技术鉴定EML细胞自我更新与分化潜在调控因子的方法。所鉴定的关键因子将进行下游功能分析。 体外 和 体内.

引言

造血干细胞是一类稀有的血细胞，主要存在于成体骨髓微环境中，负责生成补充血液系统和免疫系统所需的各类细胞。¹作为一类干细胞，HSCs 具备自我更新和分化的能力。阐明调控 HSCs 命运抉择（即自我更新或分化）的机制，将为 HSCs 在血液疾病研究和临床应用中的操控提供有价值的指导。²研究人员面临的一个问题是，造血干细胞（HSCs）可以在体外维持和扩增 体外 在极有限的程度上；其绝大多数子代在培养过程中仅部分分化².

为了在全基因组范围内鉴定调控自我更新和分化过程的关键调节因子，我们采用小鼠原始造血祖细胞系 EML 作为模型系统。该细胞系来源于小鼠骨髓^3,4。在不同生长因子的作用下，EML 细胞可在体外分化为红系、髓系和淋巴系细胞in vitro⁵。重要的是，该细胞系可在含有干细胞因子（SCF）的培养基中大量扩增，并仍保持其多向分化潜能。根据表面标志物 CD34 和 SCA 的表达，EML 细胞可分离为具有自我更新能力的 Lin-SCA+CD34+ 亚群和部分分化的 Lin-SCA-CD34- 亚群⁶。与短期造血干细胞类似，SCA+CD34+ 细胞具有自我更新能力。在 SCF 处理下，Lin-SCA+CD34+ 细胞可快速再生出混合的 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞群体，并持续增殖⁶。这两个细胞群体在形态上相似，且 c-kit mRNA 和蛋白水平相近⁶。Lin-SCA-CD34- 细胞则可在含有 IL-3 而非 SCF 的培养基中传代扩增³。揭示 EML 细胞命运决定过程中的关键调控因子，将有助于深入理解造血过程中早期发育转变的细胞与分子机制。

为了研究具有自我更新能力的 Lin-SCA+CD34+ 细胞与部分分化的 Lin-SCA-CD34- 细胞之间潜在的分子差异，我们采用 RNA-Seq 技术来鉴定差异表达基因。特别是我们关注转录因子，因为转录因子在决定细胞命运中起着关键作用。RNA-Seq 是一种近期发展起来的方法，利用下一代测序（NGS）技术的能力对基因组转录出的 RNA 进行定性和定量分析^7,8。简而言之，首先将总 RNA 进行 poly-A 筛选并打断，作为初始模板。随后，利用逆转录酶将 RNA 模板转化为 cDNA。为了准确比对全长 RNA 转录本，构建 cDNA 文库时使用完整且未降解的 RNA 至关重要。为进行测序，需在 cDNA 的两端连接特定的接头序列。随后，在大多数情况下，通过 PCR 扩增 cDNA 分子，并以高通量方式测序。

测序完成后，可将获得的序列读段比对至参考基因组和转录组数据库。通过统计比对到参考基因的读段数量，可利用该信息估算基因表达水平。此外，这些读段还可进行拼接组装。 从头合成 在缺乏参考基因组的情况下，实现对非模式生物转录组的研究⁹RNA-seq 技术也已用于检测剪接异构体^10-12，新转录本¹³ 和基因融合¹⁴除了检测蛋白质编码基因外，RNA-Seq 还可用于检测新发现的非编码 RNA 并分析其转录水平，例如长链非编码 RNA^15,16，microRNA¹⁷，siRNA 等等。¹⁸由于该方法的高准确性，已被用于单核苷酸变异的检测^19,20.

在RNA-Seq技术出现之前，基因表达谱分析主要采用微阵列（microarray）方法。预先设计的探针被合成并固定在固相表面，制成微阵列芯片²¹。提取mRNA并将其反转录为cDNA。在反转录过程中，荧光标记的核苷酸被掺入cDNA，随后该cDNA可与微阵列芯片上的探针杂交。特定点位所采集信号的强度取决于结合到该点位特异性探针上的cDNA量²¹。与RNA-Seq技术相比，微阵列存在若干局限性。首先，微阵列依赖于已有的基因注释信息，而RNA-Seq技术能够检测新转录本，但其相对较高的背景水平限制了在低表达基因检测中的应用。此外，RNA-Seq技术的检测动态范围更大（可达8,000倍）⁷，而微阵列由于信号背景和饱和效应，对高表达和低表达基因的检测准确性均受限^7,22。最后，微阵列探针的杂交效率各不相同，导致在同一份样本中比较不同转录本的相对表达水平时结果可靠性降低²³。尽管RNA-Seq相比微阵列具有诸多优势，但其数据分析较为复杂，这也是目前仍有许多研究人员选择使用微阵列而非RNA-Seq的原因之一。RNA-Seq的数据处理与分析需要使用多种生物信息学工具²⁴。

在多种下一代测序（NGS）平台中，454、Illumina、SOLID 和 Ion Torrent 是目前应用最广泛的平台。454 是首个商业化的 NGS 平台。与其他测序平台（如 Illumina 和 SOLID）相比，454 平台可产生更长的读长（平均读长为 700 个碱基）²⁵。由于其更高的组装效率，较长的读长更适用于转录组的初步表征²⁵。454 平台的主要缺点是每兆碱基序列的测序成本较高。Illumina 和 SOLID 平台则产生数量更多但长度较短的读段，每兆碱基序列的测序成本远低于 454 平台。由于 Illumina 和 SOLID 平台产生的短读段数量庞大，数据分析所需的计算资源显著增加。Ion Torrent 平台的测序仪器和试剂价格较低，测序时间也更短²⁵。然而，其错误率和每兆碱基序列的测序成本相较于 Illumina 和 SOLID 平台更高。不同平台各有优缺点，且需要不同的数据分析方法。应根据测序目的和资金可用性选择合适的平台。

本文以Illumina RNA-Seq平台为例，采用EML细胞作为模型系统，研究EML细胞自我更新与分化过程中的关键调控因子，并提供了RNA-Seq文库构建及数据分析的详细方法，用于基因表达水平的计算和新转录本的检测。我们此前的研究已表明，在EML模型系统中结合功能验证实验（例如 shRNA敲低）进行RNA-seq研究²，是解析造血分化早期阶段分子机制的有力手段，也可作为细胞自我更新与分化研究的通用模型。

方案

1. 使用磁性细胞分选系统和荧光激活细胞分选法培养EML细胞并分离Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞

1. 用于干细胞因子收集的幼仓鼠肾（BHK）细胞培养基的制备：
   1. 在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在25 cm²培养瓶（表1）中培养BHK细胞。
   2. 当细胞生长至80–90%融合度时，用10 ml PBS洗涤细胞一次。向单层细胞中加入5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温（RT）下孵育1–5分钟，直至细胞脱落。
   3. 轻轻吹打溶液以分散细胞团块。向培养瓶中加入5 ml完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶活性。在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。
   4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜BHK细胞培养基中。
   5. 从步骤1.1.4中取2 ml细胞悬液转移至新的75 cm²培养瓶中，并向瓶中加入48 ml新鲜BHK细胞培养基。
   6. 继续培养BHK细胞两天后收集培养基。使用0.45 μm滤膜过滤培养基。将滤过的培养基储存于-20 °C，待后续使用。
2. EML细胞培养：
   1. 在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下，将EML细胞（悬浮生长）培养于含有BHK细胞培养基的EML基础培养基中（表1）。
   2. 维持EML细胞在较低细胞密度（0.5–5 × 10⁵ 个细胞/ml），最高密度不超过6 × 10⁵ 个细胞/ml。每2–3天以1:5比例传代一次。传代操作应轻柔进行，且在传代超过10代后弃用细胞系。
3. 去除谱系阳性细胞：
   1. 以200 × g离心5分钟收集EML细胞，并用PBS洗涤一次。再次以200 × g离心5分钟收集细胞。
   2. 用PBS重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。根据细胞数量确定后续细胞分离步骤中的抗体浓度（请参考细胞分离系统供应商提供的说明书）。
   3. 使用谱系抗体混合物（包含生物素标记的单克隆抗体CD5、CD45R（B220）、CD11b、抗Gr-1（Ly-6G/C）、7-4和Ter-119）及磁性激活细胞分选系统，按照制造商说明分离谱系阴性（Lin-）细胞。
4. 分离Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞：
   1. 将来自步骤1.3.3的Lin-细胞以200 × g离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
   2. 用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次以200 × g离心5分钟收集细胞。
   3. 标记五个1.5 ml微量离心管，分别编号为1、2、3、4、5。按每10⁶个细胞加入100 µl FACS缓冲液的比例重悬细胞（每管含10⁶个细胞）。
   4. 向1号和2号管中各加入1 µg Anti-Mouse CD34 FITC抗体，并轻轻混匀。
   5. 将所有管置于4 °C避光孵育1小时。
   6. 向1号管中加入0.25 µg PE标记的Anti-Sca1抗体和20 µl APC标记的谱系抗体混合物，向3号管中加入0.25 µg PE标记的Anti-Sca1抗体，向4号管中加入20 µl APC标记的谱系抗体混合物。
   7. 轻轻混匀所有管，继续在4 °C避光孵育30分钟。
   8. 向各管中加入300 µl FACS缓冲液，以200 × g离心5分钟收集细胞。
   9. 用500 µl FACS缓冲液洗涤细胞三次。
   10. 将细胞沉淀重悬于500 µl FACS缓冲液中。
   11. 使用2、3、4、5号管中的细胞设置补偿。利用FACS Aria仪器从1号管中分选Lin-SCA+CD34+和Lin-SCA-CD34-细胞。

2. 高通量测序的RNA制备与文库构建

1. RNA的分离、质量分析与定量：
   1. 使用TRIzol试剂，按照生产商提供的操作说明，分别从Lin-CD34+ 和 Lin-CD34- 细胞中提取总RNA。
   2. 使用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）去除污染的DNA，操作遵循生产商说明书。可选：在此步骤后将RNA样品于-80 °C保存以备后续使用。
   3. 根据供应商提供的操作说明，使用Bioanalyzer评估总RNA的质量。选择RNA完整性数值（RIN）大于9的RNA样品。
2. 文库构建与高通量测序：
   注意：本实验方案描述的是基于Illumina平台的RNA-Seq。对于其他测序平台，需采用不同的文库制备方法。
   1. 每份样品使用0.1–4 µg高质量的总RNA进行文库制备。通常情况下，从10⁵个EML细胞中可提取约2 µg总RNA。
   2. 使用RNA测序文库制备系统，按照供应商提供的详细标准操作流程，进行RNA纯化与片段化、第一链和第二链cDNA合成、末端修复、3'端腺苷酸化、接头连接以及PCR扩增。
      1. 使用寡聚dT（oligo-dT）磁珠富集PolyA mRNA，并对mRNA进行片段化。
      2. 使用随机引物进行逆转录以获得cDNA，随后合成第二链cDNA，生成双链cDNA（dscDNA）。
      3. 利用DNA聚合酶去除3'突出端并填补5'突出端。对3'端进行腺苷酸化，防止cDNA片段相互连接。
      4. 在双链cDNA两端连接带有索引（indexing）的接头，并通过PCR扩增富集DNA片段。
   3. 使用分光光度计测定A260/A280比值，以获取文库浓度信息。
   4. 使用Bioanalyzer评估文库质量，并测定DNA片段的大小范围。

3. 数据分析

有关本部分所用软件的参考信息，请参见（表2）。

1. 用于下游分析的数据文件处理：
   1. 使用 CASAVA 软件（Illumina，版本 1.8.2）将 .bcl（碱基识别文件）转换为 .fastq 文件。
      1. 在 Linux 系统中启动“终端”，进入包含来自 Illumina HiSeq2000 测序仪数据文件的文件夹。假设结果文件夹为“NASboy1/JiaqianLabData/HiSeq_RUN/2013_07_11/130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX/”，在 图 S1A 中输入命令，并进入该数据文件夹。
      2. 在 Linux 系统中安装 CASAVA 1.8.2。假设输出文件夹为“Unaligned”，使用 图 S1B 中的命令准备用于转换的配置文件。使用选项 --fastq-cluster-count 0 以确保每个样本仅生成一个 .fastq 文件。生成的 .fastq 文件为 .gz 格式，需解压以用于下游分析（图 S1B）。
      3. 在“Unaligned”文件夹生成后，进入该文件夹（图 S1C）。
      4. 使用 图 S1D 中的命令开始转换过程。“-j”参数指定将使用的 CPU 数量。
      5. 系统完成转换过程后，进入“Unaligned”文件夹下的结果文件夹（图 S1E）。
      6. 使用 图 S1F 中的命令将每个样本文件夹下的 .fastq.gz 文件解压为 .fastq 文件。
2. 使用 Tuxedo Suite²⁶ 检测新转录本并评估表达水平：
   1. 使用 Tophat 软件（版本 1.3.3）²⁷ 将成对末端 RNA-Seq 读段比对至小鼠参考基因组（UCSC 版本 mm9，来自 http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html），该软件采用 Bowtie 读段比对器（版本 0.12.7）²⁸。Tophat 使用“-no-novel-juncs”选项以提高表达水平估计的准确性。
      1. 将 .fastq 文件放入将要执行比对过程的文件夹中。假设有两个 .fastq 文件（重命名为 Example1.read1、Example1.read2）用于一个成对末端测序样本，使用 图 S2 中的命令进行比对（根据系统设置调整参数）。“-p”参数指定将使用的 CPU 数量。“–r”和“–mate-std-dev”参数可从文库质控数据中获得，或从部分比对读段中推断（图 S2）。
   2. 使用 Cufflinks 软件（版本 1.3.0）²⁹ 将比对后的读段组装为 RNA 转录本。运行 Cufflinks 时使用已知基因的注释文件（与 Tophat 使用的相同 .gtf 文件）以及 Tophat 生成的 .bam 文件。
      1. Tophat 运行完成后，在同一文件夹中使用 图 S3A 中的命令运行 cufflinks，以构建转录组并估计转录本表达水平。“mm9_repeatMasker.gtf”文件及“GenomeSeqMM9”文件夹中的基因组序列文件可从 UCSC 基因组浏览器获取。
      2. 生成的 genes.expr 和 transcripts.expr 文件包含基因和转录本（异构体）的表达值。将文件内容复制粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格软件进行处理（图 S3B）。
      3. 使用 图 S3C 中的命令将生成的“transcripts.gtf”文件与参考“mm9_genes.gtf”文件进行比较，以识别新转录本。
      4. 生成的 .tmap 文件包含比较结果。将文件内容复制粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格软件进行处理。与提供的参考 .gtf 文件相比，类别代码为“u”的转录本可视为“新转录本”（图 S3D）。
         注意：为便于下游分析，若 FPKM 值低于 0.1，则将其设为 0.1。
         注意：步骤 3.2.3 - 3.2.6 为可选步骤，适用于希望提高新转录本表达量估计准确性的用户。此过程耗时较长，因为比对和转录组构建需运行多次。
   3. 使用默认参数运行 Tophat，然后使用 图 S3E 中的命令运行 cufflinks 以生成 .gtf 文件。
   4. 使用 图 S3F 中的命令将生成的 .gtf 文件与参考基因组 .gtf 文件进行比较。
   5. 如 步骤 3.2.2.4 所述解析生成的 .tmap 文件。将文件内容复制粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格软件进行处理。与提供的参考 .gtf 文件相比，类别代码为“u”的转录本可视为“新转录本”。
   6. 在完成 步骤 3.2.5 后，文件夹中将生成一个 .combined.gtf 文件，可用作参考 .gtf 文件。可按照 步骤 3.2.1 和 步骤 3.2.2 所述再次运行 Tophat 和 cufflinks，以获得更准确的新转录本 FPKM 估计值。
3. 使用 DESeq 软件包³⁰ 检测差异表达基因。
   1. DESeq 的输入为原始读段计数表。为获得该表，使用随 HTSeq Python 软件包分发的 htseq-count 脚本，该软件包可从 HTSeq 网站下载（http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html）。
      1. 确保系统中已安装 samtools、python 和 htseq-count 程序。使用 图 S4A 中的命令从 tophat 输出中获取原始读段计数值。
      2. 使用 Excel 准备“Raw_Count_Table.txt”和“ExperimentDesign.txt”文件。将内容复制并以 .txt 格式保存，供 DESeq R 软件包使用（图 S4B）。
      3. 在系统中安装 R 程序。在终端中输入“R”并按回车键，屏幕将显示如 图 S4C 所示的消息。
      4. 使用 图 S4D 中的命令将“Raw_Count_Table.txt”和“ExperimentDesign.txt”读入 R。
      5. 使用 图 S4E 中的命令加载 DESeq 软件包。
      6. 在 R 中对实验条件进行因子化处理（图 S4F）。
      7. 使用 图 S4G 中的命令在标准化计数表上运行负二项检验。
      8. 使用 图 S4H 中的命令将显著差异表达基因输出至 .csv 文件。
4. 使用 Excel 查找转录因子（TFs）在各样本中的 FPKM 值。对差异表达基因表与转录因子表进行交集分析，同时属于两个表的基因为差异表达的转录因子。
   1. 访问网站 http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php 下载转录因子列表，然后在 Excel 中查找差异表达的转录因子（图 S5）。
5. 生成用于 UCSC 基因组浏览器可视化的 .bigwig 文件。
   1. 从网站 https://github.com/arq5x/bedtools2 下载“bedtools”软件包并在系统中安装³¹。从网站 http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ 下载 UCSC 工具“bedGraphToBigWig”并在系统中安装。
   2. 在包含 .bam 文件的文件夹中，使用 图 S6A 中的命令将 tophat 生成的 .bam 文件转换为 .bed 文件。
   3. 生成 .bed 文件后，使用 图 S6B 中的命令生成 .bigwig 文件。“ChromInfo.txt”文件可从以下网址获取：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz。
   4. 在 UCSC 基因组浏览器中查看自定义轨道。有关如何使用 UCSC 基因组浏览器显示自定义轨道的说明，请参阅网站 http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html。

图 S1：使用 CASAVA 软件将 .bcl 文件转换为 .fastq 文件。

图S2：使用Tophat将读段比对至参考基因组。

图 S3：新转录本的检测与表达水平估计。

图 S4：使用 DESeq 软件包鉴定差异表达基因。

图 S5：差异表达转录因子的鉴定。

图 S6：将比对结果转换用于数据可视化。

结果

为了分析 Lin-CD34+ 和 Lin-CD34- EML 细胞中差异表达的基因，我们采用了 RNA-Seq 技术。图 1 展示了实验流程。通过磁性细胞分选法分离出谱系阴性细胞后，我们使用 FACS Aria 分选出 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞。将谱系富集的 EML 细胞用抗 CD34、抗 Sca1 及谱系混合抗体进行染色，仅对 Lin- 细胞设门，以分析 Sca1 和 CD34 的表达。通过 FACS 分析可观察到两个细胞群（SCA+CD34+ 和 SCA-CD34- EML 细胞）（图 2）⁶。

细胞分离后，我们分别从CD34+和CD34-细胞中提取总RNA，并分析RNA的质量。RNA-Seq数据的准确性在很大程度上依赖于RNA-Seq文库的质量，而总RNA的质量对于构建高质量文库至关重要。高质量的RNA样本其OD 260/280比值应在1.8至2.0之间。除使用分光光度计外，还通过生物分析仪（Bioanalyzer）更精确地评估RNA质量。

讨论

哺乳动物转录组非常复杂^34-38RNA-Seq 技术在转录组分析、新转录本检测和单核苷酸变异发现的研究中正发挥着日益重要的作用 等等。 与其他基因表达分析方法相比，它具有多种优势。如引言中所述，该方法克服了微阵列的杂交假象问题，并可用于鉴定新转录本 从头合成RNA测序的一个局限性在于其读长相对较短，与桑格测序相比尤其如此。然而，随着测序技术的快速进步，读长正在持续增加。本文提供了利用该技术鉴定小鼠EML细胞自我更新与分化过程中潜在关键调控因子的详细方法。

本方案的第一个关键步骤是 EML 细胞培养。尽管 EML 是一种造血前体细胞系，可在干细胞因子（SCF）存在下大量扩增，但其培养条件相比常规永生化细胞系需要更加细致的控制。细胞应定期换液并传代，操作需轻柔；否则细胞的自我更新与分化特性可能发生改变，并出现细胞死亡。在收集到足够数量的细胞后，我们首先利用磁性激活细胞分选系统分离出谱系阴性细胞，随后通过荧光激活细胞分选法将 CD34+ 与 CD34- 细胞分开。通常在用于 RNA 提取前，EML 细胞传代不应超过...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素	Invitrogen	15240-062	BHK 细胞培养
抗小鼠 CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	FACS 分选
抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	FACS 分选
APC 小鼠谱系抗体混合物	BD Biosciences	558074	FACS 分选
BD FACSAria 细胞分选仪	BD Biosciences	Special offer sysmtem	FACS 分选
Corning™ 细胞培养处理培养瓶 75 cm2	Corning incorporated	430641	细胞培养
Corning™ 细胞培养处理培养瓶 25 cm2	Corning incorporated	430639	细胞培养
脱氧核糖核酸酶 I，扩增级	Invitrogen	18068-015	文库制备
DMEM	Invitrogen	11965-092	BHK 细胞培养
DPBS	Gibco	14190	细胞培养
热灭活胎牛血清	Invitrogen	16140071	BHK 细胞培养
马血清	Invitrogen	16050-122	EML 细胞培养
IMDM	HyClone	SH30228.02	EML 细胞培养
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	细胞培养
谱系细胞耗竭试剂盒，小鼠	Miltenyi Biotec	130-090-858	谱系阴性细胞的分离
NanoVue Plus 分光光度计	GE Healthcare	28-9569-62	质量控制
Thermo Scientific™ Napco™ 8000 水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific	15-497-002	细胞培养
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122	EML 细胞培养
TRIzol® 试剂	Invitrogen	15596-018	RNA 提取
TruSeq™ RNA 样本制备试剂盒 v2 - B 套装（48 次反应）	Illumina	RS-122-2002	文库制备
2100 电泳生物分析仪	Agilent	G2939AA	质量控制
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200	细胞培养
0.45 µm 注射器滤器	Nalgene	190-2545	细胞培养