采用自组装肽（SAP）和神经前体细胞（NPC）联合生长因子治疗颈段脊髓损伤，是一种促进神经再生与功能恢复的有前景的策略。本研究建立了颈段脊髓损伤的 contusion/compression 动脉瘤夹大鼠模型，并采用 SAP 注射联合 NPC 移植的综合治疗方案。
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本文内容
摘要
摘要
脊髓损伤（SCI）会导致严重的神经功能障碍，并给患者及其家庭带来心理、经济和社会方面的后果。临床上，超过50%的脊髓损伤累及颈椎1。继发于原发性损伤之后，会引发一系列继发性病理机制，包括炎症反应、细胞凋亡和脱髓鞘，最终导致组织瘢痕形成以及髓内空洞的出现2,3。这两者均构成细胞移植、整合与再生的物理和化学屏障。因此，改造抑制性微环境并桥接空洞，以创建有利于细胞移植和再生的支持性环境，是一个有前景的治疗靶点4。本文描述了一种使用动脉瘤夹建立的颈椎脊髓挫伤/压迫模型。该模型相较于其他实验模型更具临床相关性，因为脊髓完全横断或破裂在临床上较为罕见。此外，与主要损伤背柱的重物坠落模型相比，对脊髓实施环形压迫更具优势。通过调节动脉瘤夹的闭合力度和夹闭时间，可实现不同程度的损伤严重性。环形弹簧有助于精确校准并保持夹力的稳定性。在生理条件下，合成的自组装肽（SAP）可自组装形成纳米纤维，因此在脊髓损伤治疗中具有应用潜力5。SAP可直接注射至损伤部位，从而最大限度减少对脊髓的进一步损伤。SAP是生物相容性结构，能够构建支架以桥接髓内空洞，从而使受损脊髓具备接受再生治疗的条件。K2(QL)6K2（QL6）是一种由Dong et al.6首次报道的新型自组装肽。与其他肽相比，QL6可在中性pH条件下自组装形成β-折叠结构6。在脊髓损伤后14天（即急性期过后），将SAP注射至损伤中心区域，同时将神经前体细胞（NPC）注射至邻近的背柱区域。为了促进细胞存活，细胞移植操作联合使用渗透压微泵持续7天向硬膜下腔输注生长因子。
引言
超过50%的脊髓损伤与颈椎相关。在临床背景下，存在两种主要的病理生理机制：最初的脊髓挫伤，以及随后由骨折、出血或组织肿胀引起的持续性压迫。
动脉瘤夹挫伤/压迫模型模拟了两种病理生理机制：夹子的闭合造成挫伤，而夹持持续的时间则代表压迫成分，尽管临床上由骨折、出血或组织肿胀引起的压迫通常持续时间更长。所使用的动脉瘤夹经过环形弹簧改装，可确保夹持力精确且可重复。与半横断或单纯挫伤模型相比，该动脉瘤夹模型更能准确模拟临床实际情况。胸段脊髓损伤患者通常表现为截瘫，而颈段脊髓损伤患者大多为四肢瘫痪，完全丧失自理能力。然而，颈段脊髓的解剖结构与胸段或腰段脊髓存在显著差异，因此本方案特别针对颈段脊髓进行阐述。
髓腔形成和组织瘢痕化是阻碍恢复与再生的障碍。为克服这些障碍，使用支架材料是一种有前景的方法。自组装肽可直接注射至损伤中心，在该处自组装形成纳米纤维支架，桥接空腔，并通过减轻炎症和组织瘢痕化改善抑制性微环境。与植入时会对脊髓造成显著损伤的刚性材料不同，液态肽可安全注射，且不会引起严重附加损伤。
在颈段脊髓损伤后，于干细胞移植前利用自组装多肽改善抑制性微环境，从而促进细胞整合、分化及最终的功能恢复。
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方案
注意：以下实验方案已获得大学健康网络动物护理委员会（加拿大安大略省多伦多市）的批准，并符合加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》中所确立的政策。
1. 宫颈动脉瘤夹挫伤/压迫模型
- 手术前将器械进行高压灭菌，并在整个手术过程中通过将器械置于70%酒精浴中以维持无菌条件。
- 使用氧气（O2）、一氧化二氮（N2O）（1:1）和1.8–2.2%异氟烷的混合气体对Wistar大鼠（250–270 g）进行麻醉，并通过气体麻醉面罩支持其自主呼吸。诱导麻醉时，先使用5%异氟烷持续1分钟，随后降低浓度。手术开始前，通过施加疼痛刺激（例如在足部）来确认麻醉深度。在眼部涂抹油脂类软膏，以防止干燥及继发感染。
- 将大鼠置于37 °C加热垫上，并将其头部固定于立体定位仪中。
- 剃除颈椎周围的手术区域毛发，并使用聚维酮碘和70%酒精进行消毒。
- 从颈椎第2节（C2）开始，沿脊柱中线做一纵行切口，延伸至胸椎第2节（T2）明显的棘突处。
- 沿中线方向纵向切开椎旁肌的表层（以避免出血），并钝性分离深层肌肉组织，直至暴露棘突和椎板。插入牵开器。
- 以胸椎第2节（T2）明显的棘突为定位标志，确定椎板切除的目标节段。在显微外科技术下辨认并分离目标椎板后，剪开黄韧带以松解椎板和棘突。最后，使用骨剪在脊髓侧方剪断椎板，并轻柔移除，避免对脊髓本身造成压迫。
注意：最常见的手术节段为C5/6、C6/7或C7/T1。损伤节段越靠近头侧，围手术期死亡率越高。椎旁静脉窦出血较为常见，可通过使用海绵谨慎压迫止血。 - 在插入夹闭装置造成脊髓损伤前，应先辨认并保护发出的神经根，避免夹伤（尤其在C5/6节段）。
- 为确保夹闭装置顺利插入，使用钩针从椎体背侧松解腹侧硬脊膜，为夹闭器建立通路。
- 最后，插入打开的夹闭器并使其迅速闭合，以造成挫伤性损伤。夹闭力和夹闭持续时间决定了损伤强度和压迫程度。常用的夹闭力为15–35 g，夹闭时间通常为例如1分钟。（图1）。
- 移除夹闭器后，将肌肉分两层缝合，并关闭切口。
- 停止麻醉，持续观察动物直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。最后将大鼠放入单独笼具，并遵循术后护理指南。
- 由于动物对此类损伤的耐受性较差，必须特别注意术后处理：
- 给予镇痛药物（布托啡诺使用3天，美洛昔康使用5天，具体根据临床症状调整）。
- 术后3天内皮下注射生理盐水（每日2次，每次5–10毫升（ml））。
- 术前2天开始至术后7天，在饮水中添加抗生素（例如莫西沙星）。
- 每日2–3次手动挤压排尿，直至膀胱功能持续恢复。
- 每天至少一次观察手术动物的神经功能缺损情况和生理状态。
2. 注射 SAPs 和 NPCs（损伤后 14 天）
- 按照1.1至1.3节所述诱导麻醉，将大鼠头部固定于立体定位仪中，拆除缝线或伤口夹，并使用聚维酮碘和70%酒精对伤口及手术区域进行消毒。
- 仔细分离椎旁肌，置入牵开器，在显微镜下清除硬脊膜上的瘢痕组织，并重新暴露损伤部位。
- 以1%（w/v）浓度配制SAPs，用于形成细胞外基质凝胶。QL6 SAPs具有生理相容的pH值，注射前无需缓冲。为在脊髓中可视化SAPs，可使用QL6的荧光衍生物（QL6-FITC）。
- 将SAPs注射至损伤中心，总体积为5微升（μl），分两部分注入，每侧中线旁2.5 μl。使用连接于立体定位仪的Hamilton注射器，配以微细玻璃毛细管（外径（OD）100微米（μm））。用锐利针尖小心切开硬脊膜，将玻璃毛细管立体定向插入受损脊髓组织深2毫米（mm）处。
- 注入1/3体积后，将针头退至1.5 mm深度；再注入1/3体积后，进一步退至1 mm深度。注射全部体积后，在拔出注射器前等待5分钟，以确保凝胶形成稳定。
- 为获取NPCs，使用成年DsRed小鼠（或YFP阳性小鼠，绿色），并从侧脑室下区分离和培养细胞4,18,21。
- 通过台盼蓝染色评估NPCs的存活率，显示细胞悬液中约90%为活细胞。将细胞用生长培养基稀释至（50 × 10³ 个活细胞/μl），随后用于细胞移植。
- 在损伤部位头侧和尾侧各2 mm处，双侧进行共四次脊髓内注射，每次2 μl（总体积8 μl，含4 × 105个NPCs）。切开硬脊膜后，将Hamilton微细玻璃毛细管插入脊髓背表面以下1.5 mm处，注入2 μl细胞悬液。注射速率选择约0.5 μl/min（分钟）。
- 每次注射结束后，在拔出毛细管前至少等待1分钟，以使组织充分延展，适应新增的细胞体积。（图2）
3. 用于生长因子给药的硬膜下泵植入
- 为了用支持细胞存活的生长因子富集脑脊液（CSF），使用微型渗透泵在7-14天内将生长因子持续稀释至硬膜下，稀释速率为0.5 μl/hr，导管外径为0.04 cm，储液器容积为100 μl。
- 选择所需的生长因子（例如，脑源性生长因子（BDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）），在植入前6-10小时填充泵，并在37 °C的水浴中平衡泵。
- 在神经前体细胞（NPC）注射后立即制备皮下腔隙以放置泵。首选位置为胸腹部侧 flank 区域，以避免泵本身引起明显的局部不适。
- 为获得最高的生长因子浓度，确保导管开口端靠近损伤部位。因此，对相邻的上位或下位节段进行跳跃式椎板切除术。例如，若脊髓损伤（SCI）位于C7/T1，则在C5处进行小范围椎板切除术。
- 将泵置入皮下腔隙，将导管剪至所需长度，并用数针（6.0）缝合固定于椎旁肌肉上，以防止因活动导致的移位。
- 用针尖锐端切开硬膜（例如，在C5处），将导管插入硬膜下腔，并使其顺行向尾端无阻力滑入，避免损伤脊髓。跳跃保留的椎板（例如 C6）可作为导管的附加固定和稳定点。
- 确保导管走行顺畅，无折叠。
- 逐层缝合肌肉和皮肤，可使用缝线或钉合器。（图3）
- 停止麻醉，并在持续观察下让动物苏醒，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。最后将其放回单独的笼子，并遵循术后治疗指南。
- 即使动物在此时点可能已部分恢复，仍需提供特殊的术后治疗：
- 给予镇痛药（布托啡诺和美洛昔康分别使用3天和5天，具体根据临床症状调整）。
- 术前2天至术后7天在饮水瓶中提供抗生素（例如 莫西沙星）。
- 若仍有需要，继续挤压排空膀胱。
- 若大鼠出现脱水迹象，给予额外的皮下补液。
- 至少每日一次持续观察手术动物的神经功能和生理状况。
- 在NPC注射前2天开始免疫抑制治疗，并持续至移植后7天（使用米诺环素）以及直至动物处死（使用山地明）。
4. 组织评估
- 在观察期结束时（例如，脊髓损伤后4周），于深度麻醉（5% 异氟烷，2-3 分钟）下处死动物，经心脏灌注50 ml冷（4 °C）生理盐水，随后灌注150 ml冷的含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 取出脊髓，置于含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中固定24小时。
- 将脊髓组织放入25%蔗糖溶液中，48小时以进行冷冻保护。
- 制备厚度为<30 μm的纵向冷冻切片。
- 为对所有细胞核进行免疫组织化学染色以提供背景，使用DAPI（1:1,000）。DsRed阳性的神经前体细胞呈红色，QL-6 FITC呈绿色，因此两者无需特殊染色。（图4）。
- 进行扫描电子显微镜（SEM）观察时，将样品在4 °C下浸泡于戊二醛中2小时，随后以每步10%浓度递增的乙醇溶液逐步脱水，每次5分钟，然后将样品置于加压液态CO2虹吸装置中1小时。使用溅射镀膜仪在支架表面镀金。采用日立S-3400N型扫描电子显微镜拍摄图像。（图5）
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结果
执行上述操作步骤后，您将获得一种SAP支架，该支架可跨越空腔，改善抑制性微环境，减少组织瘢痕形成，并提高神经前体细胞（NPC）的存活率。图4展示了脊髓损伤（SCI）后6周、QL6 SAP注射及NPC移植后4周，大鼠损伤部位脊髓的纵向切面。QL6多肽成功注入脊髓，在损伤中心聚集，并向周围半影区向头-尾方向扩散。电子显微镜成像进一步显示，图5中1%（w/v）QL6多肽在PBS溶液中稀释后2小时内自组装形成纳米纤维支架。
该基质改善了抑制性微环境，有助于提高细胞存活率和细胞分化，减少组织瘢痕形成，最终增加了功能恢复的可能性。
图1：夹闭挫伤/压迫性动脉瘤模型。
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讨论
本方案旨在使读者能够建立大鼠颈髓损伤模型，并采用SAPs与NPCs联合治疗策略，以促进颈段脊髓损伤后的更好恢复。
与其他颈椎创伤模型（如（半）横断模型或坠物打击和脑震荡模型）相比，夹闭挫伤/压迫模型同时体现了两种主要的病理生理创伤机制——挫伤和压迫，因此最能模拟临床实际情况。尽管该模型在大鼠和小鼠胸段脊髓中的应用已较为成熟7-11，但近年来已被改进并应用于颈椎部位。这一步骤具有重要意义，因为临床上最常见的脊髓损伤为颈段脊髓损伤，且颈椎解剖结构与胸段脊髓存在显著差异。此外，四肢轻瘫的颈段脊髓损伤患者迫切希望恢复上肢至少部分的运动功能。
然而，实验性颈段脊髓损伤（SCI）的难点在于，从C7向头侧至C5方向，动物死亡率较高，在中上段颈椎区域可高达20–30%。此外，新生的神经根（尤其是C5/6节段）对操作极为敏感，若未能妥善保护，可能因损伤或刺激导致动物啃咬前肢，从而不得不提前实施安乐死。总体而言，颈段脊髓损伤动物需要大量的术后护理与关注，且恢复过程较长。另一方面，除了精细的手术准备外，还可通过调整损伤程度来部...
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披露
本研究中使用的 Covidien QL6 SAP 由 Covidien 公司提供。
致谢
我们感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、克伦比尔家族基金会、哈尔伯特神经修复与再生讲席、Phillip 和 Peggy DeZwirek 以及 Gordon Yao 为本研究提供的资金支持，其中 Gordon Yao 对图 2 的制作做出了贡献。Klaus Zweckberger 的研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgesellschaft，DFG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动脉瘤夹 | SharpTech | ||
| 手术显微镜 | Leica | ||
| 显微注射系统 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 小型动物立体定位仪 | David Kopf Instruments | ||
| 汉密尔顿注射器 | Hamilton公司 | ||
| 皮下输注泵 |  Alzet 渗透压微型泵 1007D | ||
| 外科手术器械 | 精细科学工具 | ||
| Isoflurane USP | 加拿大制药合作伙伴公司 | ||
| 0.9% 氯化钠注射液 USP | Baxter | ||
| 7.5% 聚维酮碘 | 普渡制药 | ||
| 70% Isopropyl alcohol USP | GreenField 乙醇公司 | ||
| QL6 SAP | Covidien | ||
| 0.4% 台盼蓝 | Gibco | ||
| 血小板源性生长因子（PDGF） | Sigma | ||
| 表皮生长因子（EGF） | Sigma | ||
| 成纤维细胞生长因子（FGF） | Sigma |
参考文献
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