小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro 操作的成功需要严格注意试剂和细胞的维持，以及若干对技术敏感的关键步骤。本文将讨论这些关键参数，并提供详细的实验方案，以促进该技术的广泛应用。
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摘要
摘要
OP9/OP9-DL1 共培养系统已成为从小鼠和人类胚胎及造血前体细胞中诱导分化血细胞类型的成熟方法。目前该系统被广泛用于研究与造血相关的日益复杂的遗传学、细胞学和分子学问题，并处于将这些基础研究成果转化为治疗应用的前沿。该方法操作简便，常规操作即可获得稳定可靠的结果。然而，实现成功的造血分化 体外 需要特别注意试剂和细胞培养维护的细节。此外，该实验方案包含一些对技术较为敏感的步骤，这些步骤虽然并不复杂，但需要细心操作并经过练习才能熟练掌握。本文重点介绍从小鼠胚胎干细胞（mESC）分化诱导T淋巴细胞的实验流程。我们提供了一个详细的实验方案，并对关键步骤和参数进行讨论，以确保细胞分化结果具有良好的可重复性和稳健性 体外该技术的广泛应用有望减少动物实验的使用，降低基础与转化研究的成本并缩短研究周期，因此推动该技术的普及符合领域发展的利益。
引言
已建立一种细胞培养系统，用于将小鼠胚胎干细胞（mESC）分化为T细胞 体外1 该系统利用Notch信号通路驱动T细胞分化的特性。2 OP9-DL1 细胞系是通过转导骨髓来源的 OP9 细胞而建立的3 与Notch配体Delta样1（DL1）共同作用。4 Notch信号通路的激活 体外 促进T细胞发育，同时抑制其他细胞谱系的分化。通过添加适当的细胞因子，该系统可提供一种细胞培养“微环境”，支持小鼠胚胎干细胞（mESC）依次向造血谱系及最终向T细胞谱系发育。该系统支持通过流式细胞术鉴定在胸腺中正常T细胞发育过程中各阶段所见的T细胞。针对特定T细胞发育相关问题的研究，该方法已成为一种颇具吸引力的替代方案 体内 整体小鼠模型5 和 体外 从小鼠胚胎干细胞衍生的造血前体细胞诱导T细胞发育的胎胸腺器官培养方法6 OP9共培养系统的主要优势在于其采用标准且简单的细胞培养技术，且无需持续使用实验动物。
我们在实验中采用了一种详细且先前已发表的方案。7 我们已利用该技术检测未经修饰的小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆、用于制备嵌合胚胎的高质量手工挑选mESC克隆8，以及直接从药物筛选中获得的稳定转染ESC克隆的造血分化产物。9 我....
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方案
1. 培养基、细胞因子和明胶包被培养板的制备
- 使用高糖和丙酮酸钠的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）配制ES细胞培养基。添加20%经胚胎干细胞验证的胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES缓冲液、1%非必需氨基酸、0.1%庆大霉素（50 mg/ml）和0.1%（55 μM）β-巯基乙醇。通过过滤除菌法对ES细胞培养基进行灭菌。
- 按照制造商说明，将粉末配制成1 L的α-最小必需培养基（α-MEM），制备OP9培养基。加入20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，颠倒混匀。经滤器除菌，分装为两份500 ml等份。
注意：建议使用粉末配制的培养基，这可能有助于改善OP9细胞的维持培养。 体外 分化结果。该方法已成为我们的标准操作流程。然而，我们也注意到，有时使用预配制的液体α-MEM也能获得满意的效果。 - 通过将10%二甲基亚砜（DMSO）加入90%胎牛血清（FBS）中配制冻存液。轻轻混匀，过滤除菌，4 °C保存。
- 通过将人重组 Flt-3 配体（Flt-3L）溶解于完全 OP9 培养基中至终浓度 10 μg/ml，配制 2,000 倍浓缩的 Flt-3 配体（10 μg/ml）。分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -80 °C 保存。有关稳定性与储存条件，请遵循供应商提供的说明。
注意：Flt-3L 的稳定性较短（在 4 °C 下为 1 个月，或在 -80 °C 下为....
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结果
在含有LIF的MEFs上培养时，小鼠胚胎干细胞（mESCs）可维持在未分化状态。在理想条件下，它们在相差显微镜下呈现为由明亮晕圈包围的致密细胞集落。图1）。这些培养物必须每天监测。根据细胞的融合度，可更换培养基或对细胞进行传代。邻近的小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆不应相互接触。正常且健康的未分化mESC培养物是实验的必要起始条件 体外 T细胞分化。开始共培养时，建议细胞达到完全汇合但不过于密集。这样可确保收获并接种到OP9单层细胞上的细胞绝大多数为小鼠胚胎干细胞（mESC，而非饲养层细胞）。如果在第0天观察到拟分化的不同mESC克隆之间汇合度存在显著差异，则建议在计数mESC用于共培养接种前，通过预先贴壁法（使用完全ES细胞培养基，参照步骤3.4.3–3.4.6）去除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。
在启动共培养之前，必须对OP9细胞进行良好维护（如第2.4节所述）。此外，据认为OP9细胞在长期培养或增殖速率显著增加的情况下会丧失部分特性7。在OP9细胞的维护过程中，避免传代比例超过1:5，并在连续培养六周后弃.......
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讨论
OP9-DL1 共培养系统已被用于研究各种基因产物在干细胞发育为血细胞类型过程中的作用。8,12,13 它也被证明是研究基因调控DNA在细胞分化过程中功能的有效模型。9,14 采用这种方法替代全鼠模型，可在回答造血过程中诸多基础科学问题的实验中显著节省时间和成本。然而，将本方案用于这些目的时，需充分认识到所用小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆之间可能存在的变异性。已发表方案中的时间线适用于平均状态良好、常规维持且未经遗传操作的小鼠胚胎干细胞系。7 此外，用于制备嵌合小鼠的mESC克隆通常质量较高，在OP9共培养体系中表现出较强的分化能力。相反，直接来源于稳定转染并外源整合转基因的mESC克隆，其初始造血分化效率则存在差异，表现从平均水平到低于平均水平不等。本方案通过策略性地将第5天的传代步骤延迟1至2天，以在诱导造血分化之前均衡这些潜在差异。 体外
第8天的传代是本实验方案最容易出错的步骤。耐心、练习和仔细观察有助于掌握优化造血前体细胞收获并尽量减少OP9单层细胞破坏的技术。除了关键的第5天和第8天步骤.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Joon Kim在流式细胞术方面的专业协助。作者实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）SCORE项目（资助号SC1-GM095402，授予B.D.O）和加拿大卫生研究院（授予J.C.Z.P.）的支持。J.C.Z.P.还获得了加拿大发育免疫学研究主席职位的支持。亨特学院的生物医学研究基础设施部分由NIH少数族裔机构研究中心（RCMI）项目通过资助号MD007599提供支持。我们还感谢纽约州干细胞科学计划（NYSTEM）通过资助号C023048对亨特学院启动干细胞研究工作所提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| 干细胞鉴定级 FBS | Gemini | 100-125 | 热灭活 |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES 缓冲液 | Millipore | TMS-003-C | |
| 非必需氨基酸 | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| 庆大霉素试剂溶液 (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| DPBS 中的β-巯基乙醇 (55 mM) | Life Technologies | 21985-023 | |
| 滤器单元 | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES 膜 |
| 细胞培养级水 | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | 粉末，按制造商推荐方法重悬 |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | 需对单一批次进行测试 |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 重组人 Flt-3 配体 | R&D Systems | 308-FK | |
| 重组小鼠 IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| 含 0.1% 明胶的超纯水 | Millipore | ES-006-B | |
| 经丝裂霉素 C 处理的 MEFs | Millipore | PMEF-CF | 任何有丝分裂阻滞的 MEFs 均可使用 |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| 细胞筛（40 μm） | Fisher | 22363547 | |
| 组织培养皿 100 × 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| 多孔板 6 孔 | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml 微离心管 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml 离心管 | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml 离心管 | BD Falcon | 352070 | |
| 带细胞筛帽的 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | BD Falcon | 352235 | FACS 用管 |
| ES R1 细胞 | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 细胞 | 细胞可从日本理化学研究所细胞库获取。 | ||
| OP9-DL1 细胞 | 可向 Zúñiga-Pflücker 实验室申请获取细胞。 | ||
| FlowJo 软件 | Tree Star | FACS 数据分析 | |
| 流式细胞仪 | BD | 本实验室曾使用 FACScan、FACSCalibur 和 FACSVantage |
参考文献
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notc....
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重印与许可
