体外分析Myd88介导的细胞免疫应答对西尼罗病毒突变株感染的反应

摘要

两种基于流式细胞术的方法 – 一种 体外 采用T细胞启动实验和细胞内细胞因子染色法，检测树突状细胞在小鼠西尼罗病毒突变株感染中呈递抗原的能力及抗原特异性T细胞应答。

摘要

一种减毒的西尼罗病毒（WNV）非结构蛋白4B-P38G突变株在小鼠中诱导的天然细胞因子和T细胞反应高于野生型WNV。最近研究表明，髓样分化因子88（MyD88）信号通路在WNV NS4B-P38G突变株感染期间初始T细胞活化及记忆T细胞发育过程中具有重要作用。本研究中，采用两种基于流式细胞术的方法—— 体外 T细胞启动实验和细胞内细胞因子染色（ICS）被用于评估树突状细胞（DCs）和T细胞的功能。在T细胞启动实验中，将两组小鼠来源的DCs与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD4+ T细胞共培养，随后通过流式细胞术分析细胞增殖情况。⁺ OTII 转基因小鼠的 T 细胞。该方法可准确测定增殖性 CD4⁺ T细胞的检测灵敏度显著高于使用放射性试剂的传统检测方法。在ICS方案的细胞培养和细胞因子染色步骤中均采用了微量离心管系统。与传统的基于组织培养板的系统相比，该改良方法在生物安全三级（BL3）设施中更易于操作。此外，在两种检测方法中，均使用多聚甲醛处理西尼罗病毒（WNV）感染的细胞，从而允许后续在BL3设施外进行进一步分析。总体而言，这些 体外 免疫学检测可用于高效评估西尼罗河病毒感染期间的细胞介导免疫反应。

引言

西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）是一种嗜神经性的正链黄病毒，正日益成为重要的公共卫生威胁。目前尚无批准用于人类的疫苗¹。一种减毒的WNV毒株，其非结构蛋白（NS）4B中存在P38G取代，已知在小鼠中不引起致死性，但与野生型WNV NY99毒株相比，能诱导更高的先天性细胞因子反应和T细胞反应²。用NS4B-P38G突变株免疫的小鼠在随后遭受致死剂量的野生型WNV攻击时均受到保护。这表明NS4B-P38G突变株具备理想疫苗候选株的适宜特征。然而，NS4B-P38G突变株诱导强效保护性适应性免疫的机制尚不明确。Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）可识别病原体相关分子模式，在启动抗病毒先天性免疫中发挥关键作用。核心TLR信号通路主要利用骨髓分化初反应基因88（myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88）作为接头蛋白^3,4。最近一项研究表明，MyD88信号在小鼠感染WNV NS4B-P38G突变株期间细胞介导免疫的发育过程中起重要作用⁵。树突状细胞（dendritic cells, DCs）是最重要的抗原呈递细胞之一，具有在病毒感染期间启动初始T细胞反应的独特能力^6,7。CD4⁺和CD8⁺ T细胞均有助于长期保护性免疫，并在宿主感染野生型WNV后的存活中发挥重要作用<....

方案

所有动物实验均经德克萨斯大学医学分部动物护理与使用委员会批准。

1. 从非感染小鼠和西尼罗河病毒（WNV）感染小鼠中分离树突状细胞（DCs）

1. 选用6至10周龄、性别匹配的野生型C57BL/6（B6）和MyD88^−/−小鼠。通过腹腔注射（i.p.）接种500个噬斑形成单位（PFU）的WNV NS4B-P38G突变株。感染后第3天，用CO₂处死B6和MyD88^−/−小鼠。以两组未感染小鼠作为对照。每组使用三只小鼠。
2. 用70%乙醇润湿已处死小鼠左侧体表毛发，沿小鼠左侧（前后肢之间约一半位置）剪除毛发。切开体腔，用镊子取出脾脏，并将其置于含RPMI培养基的培养皿中。
3. 根据制造商说明书，使用抗CD11c磁珠分离脾脏树突状细胞（DCs）。

2. OTII 转基因小鼠T细胞的纯化与标记

1. 按照上述步骤1.2所述方法，取一只未处理的OTII小鼠的脾脏，将脾脏置于两张磨砂端的载玻片之间进行研磨均质。将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，加入RPMI培养基至14 ml。静置5分钟后，将13 ml悬液转移至新的15 ml锥形管中。
2. 使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒....

结果

在T细胞初始实验中，将CFSE标记的CD4⁺ T细胞与来自感染NS4B-P38G突变体的野生型小鼠和MyD88^−/−小鼠的纯化树突状细胞（DCs）共培养，并在有或无OVA肽的情况下进行培养。将标记的T细胞单独培养（有或无OVA）5天作为阴性对照。如图1A所示，对总T细胞进行设门，以分析FL1通道上的荧光强度。根据第0天新鲜标记的CD4⁺ T细胞设定标记，用于确定未与DC共培养时的增殖率。在此培养条件下，增殖率较低（1.6%）。使用相同的标记来确定以10:1比例与DC共培养的CD4⁺ T细胞的增殖率。由于T细胞在共培养体系中比例较高且具有增殖特性，因此可在混合细胞群中直接设门分析，无需额外的表型染色。如图1B所示，在野生型组中，T细胞增殖率达到87.0%，此为三个相同条件下处理样本中的一个代表性结果。此外，在存在OVA的情况下，CFSE标记的T细胞与MyD88^−/−小鼠来源的D.......

讨论

WNV 是一种三级生物安全病原体。由于安全规定限制，针对 WNV 感染样本的免疫学检测常受限于三级生物安全实验室设备的可及性，或操作过程更为耗时和繁琐。在最近的一项研究中，我们采用两种基于流式细胞术的方法来研究西尼罗病毒（WNV）感染期间的细胞介导免疫应答⁵在两种检测中，均直接使用1-2%多聚甲醛（PFA）或含4% PFA的固定/通透溶液处理西尼罗病毒（WNV）感染的细胞。已知使用1% PFA固定病毒感染的细胞可有效将感染性病毒颗粒数量降低至检测限以下。¹²因此，这两种方法均显著缩短了在三级生物安全实验室（BL3）内的操作时间。目前已有多种成熟的检测T细胞增殖的方法，包括通过掺入BrdU或放射性标记的胸腺嘧啶，以及基于流式细胞术的检测方法 体外 使用CFSE标记的OTII T细胞进行T细胞初始活化实验，可更准确地测定增殖CD4的百分比⁺ T细胞的整体敏感性显著提高。本实验中，采用10:1的树突状细胞（DCs）与T细胞比例，以有效评估西尼罗病毒（WNV）感染期间抗原呈递能力。当研究其他病原体感染时，建议进行剂量滴定，因为该比例可能有所不同。胞内细胞因子染色.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Invitrogen	11875	在 37 °C 下预热
抗 CD11c 磁珠	Miltenyi Biotec	130-052-001	按照生产商’s 说明操作
抗 CD4 磁珠	Miltenyi Biotec	130-095-248	按照生产商’s 说明操作
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA 残基 323-339	金斯瑞公司	RP10610
多肽	Proimmune	PC0AD-D
布雷菲德菌素 A 溶液	BD 生物科学	555029
小鼠 Fc 封闭剂	e-Bioscience	14-0161-85
APC 标记的 CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC 标记的 CD8	e-Bioscience	11-0081-82
固定/透化溶液	BD 生物科学	554722
透化/洗涤缓冲液	BD 生物科学	554723
抗 IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri 流式细胞仪	BD 生物科学