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方法文章

体外分析Myd88介导的细胞免疫应答对西尼罗病毒突变株感染的反应

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DOI：

10.3791/52121

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2014年11月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Immunology, The University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, The University of Texas Medical Branch, 3Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Sealy Center for Vaccine Development, The University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

两种基于流式细胞术的方法 – 一种 体外 采用T细胞启动实验和细胞内细胞因子染色法，检测树突状细胞在小鼠西尼罗病毒突变株感染中呈递抗原的能力及抗原特异性T细胞应答。

摘要

一种减毒的西尼罗病毒（WNV）非结构蛋白4B-P38G突变株在小鼠中诱导的天然细胞因子和T细胞反应高于野生型WNV。最近研究表明，髓样分化因子88（MyD88）信号通路在WNV NS4B-P38G突变株感染期间初始T细胞活化及记忆T细胞发育过程中具有重要作用。本研究中，采用两种基于流式细胞术的方法—— 体外 T细胞启动实验和细胞内细胞因子染色（ICS）被用于评估树突状细胞（DCs）和T细胞的功能。在T细胞启动实验中，将两组小鼠来源的DCs与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD4+ T细胞共培养，随后通过流式细胞术分析细胞增殖情况。+ OTII 转基因小鼠的 T 细胞。该方法可准确测定增殖性 CD4+ T细胞的检测灵敏度显著高于使用放射性试剂的传统检测方法。在ICS方案的细胞培养和细胞因子染色步骤中均采用了微量离心管系统。与传统的基于组织培养板的系统相比，该改良方法在生物安全三级（BL3）设施中更易于操作。此外，在两种检测方法中，均使用多聚甲醛处理西尼罗病毒（WNV）感染的细胞，从而允许后续在BL3设施外进行进一步分析。总体而言，这些 体外 免疫学检测可用于高效评估西尼罗河病毒感染期间的细胞介导免疫反应。

引言

西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）是一种嗜神经性的正链黄病毒，正日益成为重要的公共卫生威胁。目前尚无批准用于人类的疫苗1。一种减毒的WNV毒株，其非结构蛋白（NS）4B中存在P38G取代，已知在小鼠中不引起致死性，但与野生型WNV NY99毒株相比，能诱导更高的先天性细胞因子反应和T细胞反应2。用NS4B-P38G突变株免疫的小鼠在随后遭受致死剂量的野生型WNV攻击时均受到保护。这表明NS4B-P38G突变株具备理想疫苗候选株的适宜特征。然而，NS4B-P38G突变株诱导强效保护性适应性免疫的机制尚不明确。Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）可识别病原体相关分子模式，在启动抗病毒先天性免疫中发挥关键作用。核心TLR信号通路主要利用骨髓分化初反应基因88（myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88）作为接头蛋白3,4。最近一项研究表明，MyD88信号在小鼠感染WNV NS4B-P38G突变株期间细胞介导免疫的发育过程中起重要作用5。树突状细胞（dendritic cells, DCs）是最重要的抗原呈递细胞之一，具有在病毒感染期间启动初始T细胞反应的独特能力6,7。CD4+和CD8+ T细胞均有助于长期保护性免疫，并在宿主感染野生型WNV后的存活中发挥重要作用8,9。本研究采用两种免疫学检测方法，评估这些细胞在NS4B-P38G突变株感染小鼠中的功能。

首先，一个 体外 T细胞初始实验用于比较西尼罗河病毒感染的野生型与MyD88缺陷型树突状细胞的抗原提呈能力−/− 小鼠。为了提高检测的灵敏度，使用初始CD4+ T细胞从OTII转基因小鼠中分离获得，这些小鼠表达一种针对鸡卵清蛋白（OVA）肽323 - 339的Vα2/Vβ5 T细胞受体（TCR）。对西尼罗河病毒（WNV）感染小鼠的树突状细胞（DCs）进行纯化，并与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD4+ 在含有OVA肽的条件下培养T细胞。共培养5天后，收集细胞并用多聚甲醛（PFA）固定，随后通过流式细胞术进行分析。增殖实验传统上通过掺入5-溴-2’-脱氧尿苷（BrdU）或氚标记的胸腺脱氧核糖核苷（tritiated thymine deoxyriboside）来完成。3HTdr10然而，这些检测方法要么具有放射性，要么需要在进行西尼罗病毒（WNV）研究的生物安全三级（BL3）设施中使用特殊设备。通过活体染料CFSE荧光强度的连续减半来分析淋巴细胞增殖的流式细胞术，已在免疫学检测中得到更广泛应用，因为该染料在细胞中的掺入更加稳定且均匀，可通过流式细胞术轻松检测，并且不具放射性。11该检测还可用于评估细胞分裂次数。在西尼罗病毒（WNV）研究中使用该检测方法的一个主要优势在于，使用1-2%多聚甲醛（PFA）固定感染细胞可使WNV失活12，这将能够在生物安全二级实验室中使用流式细胞仪进行样本采集。

接下来，采用改良的细胞内细胞因子染色（ICS）方法，研究MyD88信号通路在感染NS4B-P38G突变株小鼠中调控西尼罗病毒（WNV）特异性T细胞反应的作用。在该实验中，从感染小鼠分离的脾细胞被处理 体外 使用WNV特异性肽段刺激。加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）以阻止细胞因子分泌，使其保留在细胞内。经过5小时孵育后，收集细胞，洗涤并进行T细胞亚群表面染色。随后用多聚甲醛（PFA）固定细胞，进行透膜处理，并对干扰素（IFN）-γ染色，最后通过流式细胞术分析。与其他基于流式细胞术的检测方法类似，一旦细胞经含PFA的固定和透膜缓冲液处理后，感染性样本即可转移至生物安全二级（BL2）实验室进行后续处理和分析。在已发表的多项研究中，我们已采用细胞内细胞因子染色法（ICS）检测WNV感染小鼠中T细胞的效应功能13,14尽管该检测方法已得到广泛应用，但其主要缺点在于操作流程十分耗时，尤其在生物安全三级（BL3）实验室中进行时更为费时。本文展示了一种基于微型离心管的细胞内细胞因子染色（ICS）方法，该方法在BL3实验室中操作更为可行，步骤更简便，且耗时更短。

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方案

所有动物实验均经德克萨斯大学医学分部动物护理与使用委员会批准。

1. 从非感染小鼠和西尼罗河病毒（WNV）感染小鼠中分离树突状细胞（DCs）

  1. 选用6至10周龄、性别匹配的野生型C57BL/6（B6）和MyD88−/−小鼠。通过腹腔注射（i.p.）接种500个噬斑形成单位（PFU）的WNV NS4B-P38G突变株。感染后第3天，用CO2处死B6和MyD88−/−小鼠。以两组未感染小鼠作为对照。每组使用三只小鼠。
  2. 用70%乙醇润湿已处死小鼠左侧体表毛发，沿小鼠左侧（前后肢之间约一半位置）剪除毛发。切开体腔，用镊子取出脾脏，并将其置于含RPMI培养基的培养皿中。
  3. 根据制造商说明书，使用抗CD11c磁珠分离脾脏树突状细胞（DCs）。

2. OTII 转基因小鼠T细胞的纯化与标记

  1. 按照上述步骤1.2所述方法，取一只未处理的OTII小鼠的脾脏，将脾脏置于两张磨砂端的载玻片之间进行研磨均质。将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，加入RPMI培养基至14 ml。静置5分钟后，将13 ml悬液转移至新的15 ml锥形管中。
  2. 使用CD4+ T细胞分离试剂盒，按照制造商说明书操作，分离脾脏来源的CD4+ T细胞。
  3. 将细胞转移至50 ml锥形管中，用PBS洗涤两次。用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS重悬细胞，浓度为1 × 106 个细胞/ml，并加入0.5 µmol/ml的CFSE。避光条件下37 °C孵育10分钟。
  4. 加入5 ml冷的完全培养基（RPMI-1640培养基，含10%热灭活胎牛血清、1/100体积的抗生素/抗真菌剂、1/100体积的L-谷氨酰胺和1/1,000体积的1,000倍2-巯基乙醇）。
  5. 冰上孵育5分钟。用PBS洗涤细胞一次，将0.2 × 106 个标记的CD4+ T细胞用2%多聚甲醛固定，并上流式细胞仪检测。此样本用于确定CFSE的基础水平。将剩余的标记细胞重悬于完全培养基中。

3. 将OTII T细胞与西尼罗河病毒感染小鼠的DC细胞进行共培养

  1. 在24孔板中，将2 × 105个纯化的OTII小鼠CD4+ T细胞单独培养，或与野生型或MyD88−/−小鼠的纯化树突状细胞（2 × 104个）共同培养，每孔加入1 ml完全培养基，可添加或不添加OVA抗原肽323-339（1 g/ml）。
  2. 37 °C孵育5天。收集细胞，用FACS缓冲液（含1% FBS的PBS）洗涤两次，加入0.25 ml 2%多聚甲醛固定，立即涡旋混匀。

4. 流式细胞术分析 体外 T细胞启动

  1. 采集时，双击流式细胞仪软件图标。获取线性FSC-A的密度图 与 线性 SSC-A，FSC-A 通道选择 0 到 200,000，SSC-A 通道选择 0 到 200,000。然后在活细胞上创建门控（P2；参见 图1A).
  2. 为了分析CFSE的荧光强度，打开FL1通道的直方图，并对设门后的细胞群采集20,000个事件。在单独培养的OTII细胞样本上设置标记图1A).
  3. 获取OTII细胞与野生型DCs共培养的样本（图1B）或 MyD88−/− 树突状细胞（DCs）图1C）以类似的方式。

5. 细胞因子检测中脾细胞的分离与刺激

  1. 感染 B6 和 MyD88−/−使用与所述相同的方法，利用WNV NS4B-P38G突变体感染小鼠 步骤 1.1感染后第30天，对存活的小鼠腹腔注射2000 PFU野生型WNV毒株进行再次攻击。在初次WNV感染后第8天和第21天，或二次感染后第4天，使用CO₂处死小鼠2 用于脾脏的采集。
    注意：每个时间点每组使用 2-3 只小鼠。
  2. 按照上述方法制备脾细胞的单细胞悬液 步骤 1.2 & 步骤 2.2使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其重悬于10 ml完全培养基中。
  3. 用完全培养基将细胞稀释至 2.5 x 106 细胞/毫升。取1毫升脾细胞悬液加入1.5毫升微量离心管中。
  4. 为了模拟CD8+ T细胞，将西尼罗病毒特异性NS4B和E肽（SSVWNATTA和IALTFLAV）用DMSO稀释至1 mg/ml。用于刺激CD4+ T细胞中，将西尼罗病毒特异性NS3和E肽（RRWCFDGPRTNTILE和PVGRLVTVNPFVSVA）用DMSO稀释至1 mg/ml。向细胞中加入10 µl肽段，随后加入1 µl布雷菲德菌素A溶液。以未加肽段处理的细胞作为对照。混匀细胞。
  5. 用18 G针头在管盖上打两个孔。将细胞在37 °C孵育5小时。

6. 胞内细胞因子染色

  1. 将细胞转移至新的微量离心管中，以 300–400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。加入 1 ml FACS 缓冲液，以 300–400 × g 离心 5 分钟，然后用 120 µl FACS 缓冲液重悬细胞。
  2. 加入 2 µl Fc 阻断剂，在室温下孵育 10 分钟。每管加入 1 ml FACS 缓冲液，以 300–400 × g 离心 5 分钟。
  3. 将细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中，并分装至三个管中（每管约 0.8 × 106 个细胞）。如 表 1 所示，将每种培养条件下的第一管细胞保留用于大鼠 IgG-PE 染色。对于第二管，向 CD4 多肽处理的细胞中加入 3 µl 抗-CD4 APC，向 CD8 多肽处理的细胞中加入 3 µl 抗-CD8 FITC，或向未经多肽处理的细胞中同时加入两种抗体。第三管用于补偿染色。针对每种培养条件，分别使用三管细胞，单独染色 APC 标记的 CD4、FITC 标记的 CD8 或 PE 标记的 CD3 抗体（每管 3 µl），作为 FL1、FL2 和 FL4 通道的补偿对照。
  4. 短暂涡旋混匀细胞，冰上避光孵育 20 分钟。加入 1.4 ml FACS 缓冲液，以 300–400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 轻轻振荡以充分分散细胞沉淀（或短暂涡旋）。用移液器将细胞沉淀重悬于 250 µl 固定/破膜溶液中，室温避光孵育 20 分钟。
  6. 加入 1.2 ml FACS 缓冲液，以 300–400 × g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中。
    注意：此时可将细胞转移至生物安全二级实验室进行后续操作，或避光保存于冰箱中，最多可保存三天。
  7. 加入 500 µl FACS 缓冲液，以 300–400 × g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于 500 µl 1× 破膜/洗涤缓冲液中，再以 300–400 × g 离心 5 分钟。
  8. 将细胞重悬于 100 µl 1× 破膜/洗涤缓冲液中，向在 步骤 6.3 中已加入 CD4 和/或 CD8 T 细胞表面标记抗体的管中加入 3.5 µl 抗-IFNγ-PE，向保留用于 IgG 对照的管中加入 3.5 µl 大鼠 IgG-PE，冰上避光孵育 25 分钟。加入 1.4 ml 1× 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，以 300–400 × g 离心 5 分钟。再加入 1.4 ml 1× 破膜/洗涤缓冲液，重复洗涤一次。
  9. 以 300–400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。加入 1.4 ml FACS 缓冲液洗涤细胞，最后重悬于 400 µl FACS 缓冲液中用于上机检测。

7. 胞内细胞因子染色的流式细胞术分析

  1. 使用与步骤 4.1相同的采集设置。对活细胞（P2；见图 2A）设置门控。利用每个组的补偿管调整电压。
  2. 打开两个新的散点图，一个用于显示FL1 vs. FL2（CD8 vs. IFN-γ）采集的数据，另一个用于显示FL4 vs. FL2（CD4 vs. IFN-γ）采集的数据。对每个样本的门控群体采集50,000个事件。

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结果

在T细胞初始实验中，将CFSE标记的CD4+ T细胞与来自感染NS4B-P38G突变体的野生型小鼠和MyD88−/−小鼠的纯化树突状细胞（DCs）共培养，并在有或无OVA肽的情况下进行培养。将标记的T细胞单独培养（有或无OVA）5天作为阴性对照。如图1A所示，对总T细胞进行设门，以分析FL1通道上的荧光强度。根据第0天新鲜标记的CD4+ T细胞设定标记，用于确定未与DC共培养时的增殖率。在此培养条件下，增殖率较低（1.6%）。使用相同的标记来确定以10:1比例与DC共培养的CD4+ T细胞的增殖率。由于T细胞在共培养体系中比例较高且具有增殖特性，因此可在混合细胞群中直接设门分析，无需额外的表型染色。如图1B所示，在野生型组中，T细胞增殖率达到87.0%，此为三个相同条件下处理样本中的一个代表性结果。此外，在存在OVA的情况下，CFSE标记的T细胞与MyD88−/−小鼠来源的D...

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讨论

WNV 是一种三级生物安全病原体。由于安全规定限制，针对 WNV 感染样本的免疫学检测常受限于三级生物安全实验室设备的可及性，或操作过程更为耗时和繁琐。在最近的一项研究中，我们采用两种基于流式细胞术的方法来研究西尼罗病毒（WNV）感染期间的细胞介导免疫应答5在两种检测中，均直接使用1-2%多聚甲醛（PFA）或含4% PFA的固定/通透溶液处理西尼罗病毒（WNV）感染的细胞。已知使用1% PFA固定病毒感染的细胞可有效将感染性病毒颗粒数量降低至检测限以下。12因此，这两种方法均显著缩短了在三级生物安全实验室（BL3）内的操作时间。目前已有多种成熟的检测T细胞增殖的方法，包括通过掺入BrdU或放射性标记的胸腺嘧啶，以及基于流式细胞术的检测方法 体外 使用CFSE标记的OTII T细胞进行T细胞初始活化实验，可更准确地测定增殖CD4的百分比+ T细胞的整体敏感性显著提高。本实验中，采用10:1的树突状细胞（DCs）与T细胞比例，以有效评估西尼罗病毒（WNV）感染期间抗原呈递能力。当研究其他病原体感染时，建议进行剂量滴定，因为该比例可能有所不同。胞内细胞因子染色...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）对 T.W. 的资助（项目编号：R01AI072060 和 R01AI099123）。G. Xie 获得了塞利疫苗开发中心博士前奖学金的支持。我们感谢理查德·弗拉维尔博士（Richard Flavell，霍华德·休斯医学研究所，耶鲁大学医学院，纽黑文）和明石静雄博士（Shizuo Akira，日本大阪大学）提供了 MyD88–/– 小鼠，以及 Y. Cong 博士（美国德克萨斯大学医学分部，加尔维斯顿）提供了 OTII 转基因小鼠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640Invitrogen11875在 37 °C 下预热
抗 CD11c 磁珠Miltenyi Biotec130-052-001按照生产商’s 说明操作
抗 CD4 磁珠Miltenyi Biotec130-095-248按照生产商’s 说明操作
CFSEInvitrogenC34554
OVA 残基 323-339金斯瑞公司RP10610
多肽ProimmunePC0AD-D
布雷菲德菌素 A 溶液BD 生物科学555029
小鼠 Fc 封闭剂e-Bioscience14-0161-85
APC 标记的 CD4e-Bioscience17-0041-81
FITC 标记的 CD8e-Bioscience11-0081-82
固定/透化溶液BD 生物科学554722
透化/洗涤缓冲液BD 生物科学554723
抗 IFNγ-PEe-Bioscience12-7311-82
Accuri 流式细胞仪BD 生物科学

参考文献

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