在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

摘要

此处，我们介绍一种可用于评估白细胞募集动态的实验方案 离体 通过将涂有内皮源性黏附分子的腔室连接至小鼠循环系统。该方法具有显著优势，因其可在相对生物学条件下实现对白细胞的评估。

摘要

白细胞-内皮细胞相互作用是急性和慢性炎症中早期且关键的事件，当调节异常时，可介导组织损伤，导致永久性病理损害。现有的常规检测方法仅能在从血液中分离白细胞后分析其黏附分子，这需要血液经过多个处理步骤才能获得可用于分析的外周血白细胞（PBLs），而这些步骤可能激活PBLs，从而影响研究结果。然而，自灌注微流控腔室检测技术使科学家能够在活体小鼠的全身血流条件下研究白细胞早期功能失调，同时可自由操控包被的腔室。通过疾病模型，可在包被有固定化内皮黏附分子的微玻璃腔室内评估并定量白细胞黏附分子的功能性表达。 白细胞-内皮细胞相互作用，炎症，微流控腔室，自灌注，黏附分子，外周血白细胞，功能失调，活体检测 离体在该模型中，麻醉状态下活体小鼠的右侧颈总动脉与左侧颈外静脉之间形成血流，使外周血白细胞（PBLs）在玻璃腔室内与内皮细胞发生自然相互作用。通过活体显微镜结合哈佛仪器公司压力装置，可实现对实验过程的实时分析。在玻璃腔室入口处安装流量调节器，可确保不同实验间具备可比的生理血流条件。白细胞滚动速度为主要观测指标，采用美国国立卫生研究院（NIH）开源软件ImageJ进行测量。综上所述，自灌注微流腔实验为研究白细胞与内皮细胞相互作用提供了接近生理状态的理想环境，有助于研究人员在炎症研究中得出准确结论。

引言

炎症是机体对损伤的普遍反应，也是先天性和适应性免疫系统功能中的关键步骤。在损伤和/或炎症刺激下，内皮细胞会上调特定的黏附分子，从而主要在毛细血管后微静脉处促使白细胞穿过微血管内皮发生外渗。该过程始于血液中自由流动的白细胞在内皮表面的初始黏附。随后是白细胞的稳定滚动和牢固黏附，进而引发跨内皮迁移以及细胞毒性物质的释放^1,2。选择素（selectins）已知介导这一级联反应的早期步骤^3-5；而整合素（integrins）则负责后续的牢固黏附和跨内皮迁移步骤^1,6-8。

越来越多的证据表明，白细胞和内皮细胞黏附分子在缺血再灌注损伤、哮喘、银屑病、多发性硬化症以及年龄相关性黄斑变性的动物模型中具有重要作用^9-12。在这些情况下，炎症反应被错误地导向攻击自身机体，导致健康组织的破坏。现有的抗炎药物（如非甾体抗炎药、皮质类固醇或其他化疗药物）在长期使用时存在严重副作用的风险¹³。因此，开发能够识别疾病特异性分子的适当工具具有重要意义，这些工具最终可被用于靶向治疗，以实现理想的抗炎效果，同时保持无毒性¹⁴。

早在1976年，已有研究采用静态白细胞黏附实验等体外方法¹⁵。1987年，平行流室首次被用于体外研究在流动条件下白细胞与内皮细胞的相互作用。在这些实验中，从静脉血中获取的经刺激的人多形核白细胞（PMNs）被灌注于原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）单层表面。为控制血流动力学条件，采用了哈佛仪器公司的注射泵¹⁶。此外，为避免人工分离白细胞，也可使用全血，并结合涂覆有固定化黏附分子的玻璃腔室进行实验¹⁷。

为了避免白细胞被激活，并在接近生理条件下从机制上研究其与黏附分子的相互作用，已建立一种ex vivo自体灌注的体外动静脉循环系统¹⁶。在该系统中，麻醉状态下活体小鼠的血液在右侧颈总动脉与左侧颈外静脉之间循环流动，使天然外周血白细胞（PBLs）能够与涂覆有单一或共固定黏附分子的玻璃微流控腔室发生相互作用。该系统的一大优势在于可使用基因工程小鼠，直接或间接调控其炎症通路。此外，该系统能够在流动条件下排除外部激活因素，精确识别白细胞黏附分子在炎症过程中的独立作用。在微流控腔室的入口处安装流量调节器，可实现广泛的实验性剪切力变化，以模拟动脉或静脉系统的血流环境^18-22。本文将详细描述ex vivo自体灌注微流控腔室实验的制备与操作方案。

方案

所有动物实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用研究协会声明以及马萨诸塞州眼耳医院动物护理委员会制定的指南和规定进行操作。

实验前一天：

1. 流动室管路的准备

1. 准备颈静脉侧时，将1 cm长的PE10聚乙烯管连接至6 cm长的硅胶管，再连接5 cm长的聚乙烯管。对于颈动脉侧，除在距1 cm聚乙烯管约1.5 cm处的6 cm硅胶管中插入一个T形管外，其余部分与颈静脉侧相同（图1A, B）。若需插入T形管，可使用精细镊子适当扩大硅胶管管径。
2. 将一段10 cm硅胶管的一端连接至压力传感器，另一端插入颈动脉侧T形管的T形接口端。确保各连接部位紧密且无泄漏。必要时，可在管路连接处覆盖一小块Parafilm膜，以防止泄漏（图1C）。

2. 包被反应室

1. 制备内皮表面包被蛋白（例如， P选择素、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附蛋白-1（VCAM-1））溶于0.1% BSA中。一般而言，200 μl BSA中含有1 μg蛋白足以包被4–5个腔室。使用连接25 G针头的1 ml注射器，向每个腔室（0.04 × 0.4 × 50 mm）注入内皮表面包被蛋白。将包被后的腔室置于15 ml离心管中，4 °C孵育过夜。

实验当天：

3. 准备反应室

1. 从 4 °C 取出包被好的灌流室，将颈静脉和颈动脉导管分别连接到灌流室两侧。在导管与灌流室连接处小心地覆盖一小块矩形 Parafilm 膜以密封接口。使用注射器将 0.1% BSA 溶液注入灌流室和导管中（检查是否泄漏）。孵育 45 分钟。
2. 准备一个 35 mm 的培养皿，通过在培养皿两侧切出凹槽以固定灌流室。将灌流室稳定地嵌入凹槽中，然后在凹槽位置滴加少量硅胶将灌流室固定在培养皿上。在显微镜下观察，确保灌流室处于水平状态。让硅胶至少干燥 15 分钟。
3. 用肝素充满一个 60 ml 的锁紧注射器，并将其连接至压力传感器。按照以下顺序将压力传感器连接至灌流室的颈动脉导管：传感器、硅胶管、T 形管。
   1. 在连接传感器的硅胶管与 T 形管之间使用一段 1 cm 的 PE50 导管以确保连接牢固。将颈动脉侧的硅胶管穿过压力夹（图 1D）。通过导管和灌流室灌注 100 USP 肝素，直至无气泡存在。

4. 设置软件

1. 准备软件时，打开计算机、显微镜和实验设备。双击 Leica 应用程序套件 (LAS)（或等效软件），并创建一个用于保存视频的文件夹：浏览 → 采集 → 视频 → 定义剪辑序列（剪辑数量 = 15，录制时间 = 30 秒，间隔 = 15 秒），然后点击“+”号确认。
2. 为记录流体压力，请打开 LabChart（或等效软件）文件，并将文件名与上述步骤 4.1中的录制文件夹保持一致。

5. 手术步骤

1. 通过腹腔注射（IP）给予8至10周龄小鼠氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（6 mg/kg）混合物进行麻醉。在5-10分钟内通过足底回缩反射消失确认深度镇静状态。如有需要，可通过面罩给予异氟烷以维持麻醉。
2. 麻醉期间，在笼子下方放置加热垫并设定为37 °C以维持体温。确认麻醉效果后，将小鼠置于俯卧位，并在眼睛表面涂抹杆菌肽软膏以防止角膜干燥。
3. 随后，使用刀片剃除切口部位的毛发，并用酒精彻底清洁该区域。
4. 待小鼠完全麻醉后，用胶带固定动物，保持俯卧位。使用剪刀暴露颈部区域，并移除甲状腺以暴露气管和血管（图2A）。
5. 仔细分离颈总动脉直至完全暴露，注意避免损伤迷走神经（图2B）。将一段缝线对折，将折弯处穿过颈总动脉下方，然后在折弯处剪断，使两段缝线均位于动脉下方。将每段缝线打结成环（暂不收紧结扎）。
6. 采用相同操作步骤暴露左侧颈外静脉（图2C），并以相同方式准备缝线（图2D）。
7. 将导管连接至小鼠血管系统。
   1. 通过腹腔注射1 ml肝素对小鼠进行肝素化处理。
   2. 收紧颈总动脉上方的缝线。将血管夹尽可能向下夹住颈总动脉（图3A）。用镊子通过上方缝线提起动脉，使用显微剪刀在动脉上做一小切口，切口大小约为动脉周长的1/8（图3B）。
   3. 将颈总动脉导管穿过上方缝线的第二个结环，并插入动脉切口内。结扎下方缝线，使动脉在导管周围密封（应打多个结以确保紧密封闭；图3C）。
   4. 采用相同操作将导管插入颈外静脉（颈静脉侧无需使用血管夹；图3D）。
   5. 松开血管夹以测试血流。若无渗漏，将小鼠转移至显微镜下，并将颈动脉导管和颈外静脉导管连接至灌流 chamber 的导管（参见附带视频以了解手术操作演示）。

6. 记录滚动速度

1. 打开颈动脉夹，使血液流入腔室，形成与小鼠循环系统相连的回路。让血液循环 3–5 分钟，以使流动条件稳定。在等待的 3–5 分钟内，调节显微镜载物台，使腔室从一端到另一端保持水平，并使物镜边缘与屏幕上的视频记录窗口平行。
2. 将装有玻璃腔室的改良培养皿注满水，然后将 10X 水浸物镜浸入培养皿中，使流经腔室的细胞可见。可能需要调节光照强度以清晰观察细胞，通常较低的光照强度更佳。
3. 调节管路上的夹子，使传感器读数稳定在 30 mm Hg，对应中等生理流动压力，或按实验需求设定。
4. 按下“开始”按钮，同时开始视频和压力记录，首次时间推移记录从颈静脉端附近开始，逆血流方向向颈动脉端移动，直至完成。
   注意：通过使用多个腔室，可在同一只小鼠中研究不同黏附分子涂层条件。每次仅记录一个腔室。
   1. 记录完成后，关闭输入端的阀门，停止血流。取下腔室，用一只手持细镊、另一只手持沟镊，将新的腔室（涂覆不同黏附分子）接入回路。按照 步骤 6.1–6.4 的说明，继续对新腔室进行记录。
5. 实验结束后，采用 CO₂ 窒息法处死所有小鼠，随后进行脊髓脱位。该实验为终末性操作，因此实验结束时需通过脊髓脱位处死小鼠。

7. 结果解读

1. 使用 ImageJ 软件的“M TrackJ”插件分析记录的数据²³。
2. 通过选择文件 → 导入 → AVI → 转换为灰度图像，将文件转换为灰度图。
3. 通过选择 → 图像 → 属性 → 输入帧间隔 (i) → 全局，来标准化帧。通过将视频总时长（通常为 30 秒）除以单个视频中的帧数（显示在 ImageJ 视频窗口的右上角）来计算帧间隔。
4. 通过选择插件 → M TrackJ → 添加轨迹 → 选择一个白细胞 → 在 15 至 20 秒内逐帧追踪 → 合并，测量每个白细胞的流动。
5. 对视野中所有白细胞重复步骤 7.4。
6. 通过选择测量 → 出现两列数据 → 将所有 M TrackJ:Tracks 数据复制到电子表格中，确定白细胞的平均滚动速度。“mean V”列即为以像素/秒为单位测得的白细胞滚动速度。通过除以 2/3 将其转换为 μm/sec。
7. 为分析压力数据，将其高亮并导出至电子表格，并进行如下计算：ΔP（mm Hg）和 t（dyne/cm²），用于各实验组之间的比较。计算完成后，将数据复制到 Prism 软件中进行作图。

结果

每次记录中，仅有相互作用的白细胞在腔室内可见。代表性实验结果如图4所示。白色箭头指向被目标黏附分子捕获的单个白细胞，这些细胞在血流中沿腔室壁滚动，而其他未结合的白细胞则自由流动。所有图像中腔室外均可见一种常见的人工假象，表现为较大的深色球形结构。这些深色球体有助于读者参照固定点判断白细胞的运动情况。图中可观察到白细胞在22秒时间内的前进情况相对于这些球体的变化。同一图中的曲线图展示了最终的数据分析结果，与对照组相比，Tx1降低了白细胞的滚动速度（曲线向左偏移），而Tx2则增加了滚动速度（曲线向右偏移）。

图1：流动腔管路的准备。(A) 管路和腔室组装所需工具（微型玻璃腔室 0.4 x 0.04 x 50 mm、聚乙烯管 PE10、聚乙烯管 PE60、硅胶管 002、Y型管、T型管、35 mm 培养皿、精细镊子、精细剪刀、管路支架、血管夹、7-0 丝线缝合线）。(B) 准备颈动脉和颈静脉管路，用于将小鼠血液重定向流经包被的腔室。(C) 将颈动脉管路连接至压力换能器。(D) 将来自换能器的管路穿过夹具，以调节血流速度。请点击此处查看该图的高清版本。

图2：暴露颈动脉和颈外静脉。 (A) 小心切开颈部区域以暴露气管。 (B) 清理右侧颈动脉，以便将缝线从血管下方穿过（黄色虚线标出颈动脉轮廓）。 (C) 清理左侧颈外静脉，以便将缝线从血管下方穿过（黄色虚线标出颈外静脉轮廓）。 (D) 在颈动脉和颈外静脉的上部和下部区域松散地放置缝线（箭头指示血管的上部和下部区域）。 请点击此处查看该图的高清版本。

图3：将导管连接至颈动脉和颈外静脉。（A） 扎紧颈动脉上方的结，并将夹子置于下方结的远端。（B） 使用显微剪刀在颈动脉上做一小切口，约为周长的1/8（黄色虚线圆圈指示切口位置）。（C） 将导管插入颈动脉，并用至少两针缝线固定（绿色虚线表示导管，黄色虚线表示颈动脉）。（D） 同样方法将导管插入颈外静脉（绿色虚线表示导管，黄色虚线表示颈外静脉）。请点击此处查看该图的高清版本。

图4：白细胞在流动腔室中滚动的代表性时间过程（比例尺 = 100 μm）（白色箭头指示滚动中的白细胞）。 该图显示了导出至绘图软件后得到的代表性结果（Tx1 和 Tx2 为实验处理组，CTR 为对照组）。Tx1 代表一种使白细胞减速的处理方式，导致白细胞滚动速度降低，并与未处理组（CTR）相比出现曲线左移；而 Tx2 则导致曲线右移，反映出白细胞滚动速度增加。 请点击此处查看此图的高清版本。

讨论

白细胞募集过程是炎症反应中的关键步骤，该过程涉及白细胞从循环系统向靶组织迁移，从而发挥其效应功能。白细胞募集在多种炎症性疾病中具有重要作用，例如动脉粥样硬化斑块、心肌梗死、缺血/再灌注损伤以及移植手术¹，同时也参与多种中枢神经系统相关的神经炎症性疾病^{10-12,20,24,25}。鉴于白细胞募集所涉及疾病类型的多样性，自灌流微流控腔室为研究人员提供了一种不可或缺的工具，可用于研究白细胞迁移的动力学过程。

在过去的几十年中，各种 体外 已开发出多种检测方法用于研究白细胞黏附的动态过程²⁶. 遗憾的是，所有这些检测均需要从血液中提取白细胞，从而引入了机械活化。为了更接近 体内 环境，对采集体全血样本和控制血流动力学条件进行了相应调整^16,17在此，我们通过将包被室与小鼠循环系统连接，进一步拓展了该领域的前期进展。我们能够将血流调节至生理范围，从而研究白细胞滚动的动力学过程。包被室使我们能够研究白细胞与特定黏附分子之间的相互作用。由于该系统由活体小鼠整体运作，功能上作为一个完整单位，更接近于天然环境，使我们可在多种免疫学小鼠模型中研究白细胞-内皮细胞相互作用。此外，该系统使我们能够充分利用现有的多种遗传学小鼠模型。尽管该系统尚不能完全复制 体内 环境，它为在生理条件下研究白细胞的特定组分提供了一个平台，这一成就是在以往无法实现的。尽管这使我们更接近于模拟生理环境，但该系统仍存在局限性。它无法完全复制血管系统复杂的三维基质结构，因此我们仅能评估局限于腔室包被成分的白细胞相互作用的某些方面。此外，必须格外注意确保小鼠循环系统的封闭性，严格遵循方案中所述的全部步骤。气泡的引入将显著影响实验的准确性和可重复性。

尽管本文描述了使用自灌注微流控室来评估白细胞滚动动力学的方法，但该技术具有可扩展性，研究人员可根据需要将其个性化应用于多种疾病的研究。例如，癌细胞通过表达许多与白细胞共有的常见整合素实现转移。在更接近模拟生理环境的条件下研究这些癌细胞的滚动动力学，有助于深入理解其转移机制。 体内 环境可能有助于我们理解甚至预测某些癌细胞的侵袭性。一种可能的方法是结合使用癌细胞标记技术，例如GFP²⁷，以及利用表达GFP的癌细胞进行流动腔实验以追踪其滚动动态。鉴于该装置可灵活地包被多种不同物质，并可将多个腔室连接至同一只小鼠，这一技术在其他实验室中若结合基因修饰小鼠和疾病模型使用时，其应用方式的改进前景值得期待。本文所述方法仅揭示了其更广泛应用潜力的一角，而这种潜力的拓展仅受限于研究者的创造力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型玻璃腔室 0.4 x 0.04 x 50 mm	VitroCom	2540-050
聚乙烯导管 PE 10	Fisher Scientific	427400
聚乙烯导管 PE 60	Fisher Scientific	427416
硅胶导管 002	Fisher Scientific	11-189-15A
Y型接头管	Value Plastics	Y210-6
T型接头管	value plastics	T410-6
硅胶凝胶	五金商店 - Home Depo
35 mm 培养皿	Corning	430165
Parafilm 封口膜	Pechiney Plastic Packaging	PM996
精细镊子	FST	11253-25
精细剪刀	FST	15000-08
导管固定架	FST	00608-11
夹具施加器	FST	18057-14
血管夹	FST	18055-04
6-0 丝线缝合线	George Tiemann & Co	160-1215-6/0
25 x 1 G 针头	BD	305125
30 x 1/2 G 针头	BD	305106
肝素 100 USP 单位/毫升	医院药房