本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao 被证实可在突触后区域形成复合物，此相互作用此前已通过共免疫沉淀实验被发现。
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摘要
摘要
Discs large（Dlg）是膜相关鸟苷酸激酶家族中一种保守的成员，在Drosophila幼虫神经肌肉接头（NMJ）处作为主要的支架蛋白发挥作用。先前的研究表明，Dlg在幼虫NMJ突触后区域的分布与Hu-li tai shao（Hts）的分布重叠，Hts是哺乳动物adducin蛋白的同源物。此外，基于对整只成年果蝇裂解液进行的共免疫沉淀实验，发现Dlg与Hts可相互形成复合物。然而，由于这些实验的性质，尚不清楚该复合物是否在幼虫发育期间特异性地存在于NMJ处。
邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）是一种近期发展起来的技术，主要用于细胞和组织培养，可检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位在该实验中，采用标准免疫组织化学方法，将样本与针对两种目标蛋白的一抗共同孵育。随后使用一对特别设计的寡核苷酸偶联二抗（称为PLA探针）检测一抗，只有当两个探针彼此靠近结合时，才能产生可检测信号。因此，可实现对处于复合物状态的蛋白质的可视化。本文演示了如何利用PLA技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。该技术在幼虫体壁肌制备物上进行，以证明Dlg与Hts的复合物确实存在于神经肌肉接头的突触后区域。
引言
黑腹果蝇 Discs large（Dlg）是膜相关鸟苷酸激酶家族中一种保守的支架蛋白成员，可协助在细胞质膜特定区域组装大型蛋白质复合物。Dlg最初被鉴定为一种肿瘤抑制蛋白，是上皮细胞顶-基底极性的重要决定因子。 1,2,3Dlg 还在幼虫发育期间谷氨酸能运动神经元的神经肌肉接头（NMJ）处充当主要的支架蛋白模块 4Dlg在幼虫神经肌肉接头处发挥多种作用，其多效性依赖于其与多种蛋白质相互作用的能力 5,6一种这样的蛋白是Hu-li tai shao（Hts），它是哺乳动物adducin蛋白的同源物，后者主要因其在调控肌动蛋白-血影蛋白细胞骨架中的作用而被描述。 7. 之前的研究表明，Dlg 和 Hts 可以相互形成复合物 体外 利用成年果蝇全组织裂解液进行的免疫共沉淀实验 8然而，这些结果的一个不足之处在于，它们并未指明该复合物形成的部位。通过免疫组织化学方法，可观察到Dlg与Hts在幼虫神经肌肉接头的突触后膜区域分布存在重叠，但二者在此区域是否形成复合物仍有待明确。 8如最近所示并在此进一步详细说明，邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）用于检测 原位 Dlg 与 Hts 在幼虫神经肌肉接头处的特异性结合 27.
PLA 是一种相对较新的技术，主要用于细胞和组织培养，可检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 9在此实验中，针对两种目标蛋白的一抗通过一对物种特异性的二抗（称为PLA探针）进行检测，这些二抗偶联有寡核苷酸（图1A、B）。如果这两种蛋白质彼此处于紧密相邻的位置（即 在几纳米到几十纳米范围内，所连接的PLA探针之间的距离可通过两个额外的连接寡核苷酸杂交而桥接图1C）。在此构象中，连接子寡核苷酸的游离末端彼此靠近到足以相互接触，从而可形成闭合的环状DNA分子 原位 连接（图1D）。该环状DNA分子可作为模板 原位 滚环扩增，由连接在PLA探针上的寡核苷酸之一引发（图1E）。随后可使用荧光标记的互补寡核苷酸探针对扩增得到的串联重复DNA产物中的序列进行可视化检测（图1F由于扩增的DNA仍连接在PLA探针之一上，因此可轻松确定组织中蛋白质-蛋白质相互作用的亚细胞定位。
检测蛋白质-蛋白质相互作用的常用方法包括 体外 共免疫沉淀、拉下实验和酵母双杂交筛选等技术，以及 体内 Förster共振能量转移（FRET）和双分子荧光互补（BiFC）等技术。这些方法的一个缺陷是 体外 技术的局限性在于它们无法确定相互作用在体内发生的位置，而上述方法 体内 该技术涉及人工表达融合蛋白，可能无法反映其内源对应物的天然行为。PLA 的一个主要优势在于，它能够在组织中确定彼此靠近且可能形成复合物的内源性相互作用蛋白的亚细胞定位，其产生信号所需的接近程度与 FRET 和 BiFC 相当。由于结合了抗体识别与 DNA 扩增，PLA 能够以高特异性和高灵敏度检测蛋白相互作用。因此，该检测可产生离散而明亮的点状信号，精确揭示相互作用的位置。此外，即使丰度极低的抗原也可被检测到。最后，PLA 是一种相对简单的实验技术，所需时间不长于标准的免疫组织化学操作流程。因此，与其他常因准备时间长且需大量调试优化的蛋白-蛋白相互作用检测方法相比，PLA 具有明显的技术优势。
本方案展示了如何将PLA应用于 果蝇 用于检测内源性蛋白质-蛋白质相互作用的幼虫神经肌肉接头 原位在此，对幼虫体壁肌肉标本进行邻近连接实验（PLA），结果显示Dlg与Hts确实在神经肌肉接头（NMJ）的突触后区域形成复合物。PLA此前尚未用于幼虫NMJ的研究，目前仅有少数已发表的论文应用了该检测方法 果蝇 组织。希望进一步使PLA暴露于 果蝇 该方法的推广应用将使其成为补充其他更常用蛋白质-蛋白质相互作用检测手段的有力工具。
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方案
1. 体壁制备
注意：三龄幼虫体壁（用于研究支配体壁肌肉的神经肌肉接头）的制备方法如 Brent 等 10 或 Ramachandran 和 Budnik 11,12 之前所述，但略有修改。
- 解剖
- 饲养果蝇品系及进行杂交实验于 25 °C 采用标准操作程序进行五至六天 13.
- 使用精细镊子从试管或瓶子中挑选爬行的三龄幼虫。
- 在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的小型培养皿中清洗幼虫，以去除任何食物颗粒。
- 将一条幼虫置于Sylgard培养皿上，并加入数滴冰浴的PBS浸没幼虫。使用冰浴的PBS有助于使幼虫麻痹，便于操作。在解剖过程中，需始终确保样本完全浸没在PBS中，以防干燥。
- 将幼虫背侧朝上放置，在解剖显微镜下使两条气管可见（图 2A）。用镊子夹住一个微小的图钉，在靠近气门的后端将幼虫固定住（图2B）。用另一根针从口钩附近的前端表皮穿刺。轻轻纵向拉伸幼虫，然后将其固定图2B).
- 使用显微解剖剪，在靠近固定针的后端轻轻夹取，形成一个小开口。切口应足够浅，仅穿透角质层即可。
- 将剪刀的下刃尖端插入切口，沿两条气管束之间的整个背侧中线长度进行剪切图 2C剪切时将剪刀刀尖略向上倾斜，以避免损伤腹壁肌肉。
- 在后方放置的针稍靠前的位置做一个小的横向切口（图2C）。在前侧定位的针稍后方做一个类似的切口（图2C切口应刚好穿过角质层。
注意：步骤 1.1.7 和 1.1.8 中的三处切口组合后应呈“
完成后， 即在幼虫体背侧应形成左右两个瓣状结构。 - 用镊子仔细清除内部器官。加入几滴PBS并用力冲洗，有助于将器官从幼虫体内排出，从而更易于移除。避免戳刺幼虫体壁，以免损伤体壁肌肉。
- 展开幼虫体壁并固定四角（图2D）。固定时，需将体壁在水平和垂直方向上均匀拉伸，形成张力均匀的矩形（参见 图2G （用于形状），注意在此过程中不要撕裂体壁肌肉。
- 去除所有剩余的内脏器官图2E).
- 固定与通透
- 将固定好的体壁浸入数滴Bouin溶液中，冰上孵育15分钟。或者，可使用4%多聚甲醛（PFA）作为替代固定剂，孵育30分钟。
- 用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBT）清洗三次。
- 使用精细镊子小心移除针头，并通过体壁的角部将其转移至硅化处理的0.65 ml微量离心管中。
- 将体壁保存在 PBT 中 4 °C 在准备进行 PLA 之前保存至适宜时间。为获得最佳结果，建议在解剖后一两天内开始对体壁进行免疫染色。
注意：为了节省试剂并确保在实验过程中所有体壁均得到同等处理，可将不同基因型的样本置于同一管中。可通过以不同方式切割体壁的角来区分基因型（参见 图2F （例如）。
2. 免疫组织化学
注意：三龄幼虫体壁的免疫染色按照 Brent 等14 以及 Ramachandran 和 Budnik 11 之前所述的方法进行，但有部分修改11,14。
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行，并轻轻振荡。
- 封闭
- 用PBT清洗体壁，每次10分钟，共清洗三次。
- 用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。
- 免疫染色
- 将体壁与针对两种目标蛋白的小鼠和兔源一抗（用1% BSA稀释）在室温下孵育2小时，或在4℃过夜孵育 4 °C此时使用1:10的小鼠抗Dlg抗体和1:250的兔抗HtsM抗体 15,16。也可加入针对非小鼠或兔来源标记物的抗体—— 例如使用1:200的山羊抗HRP标记神经元膜。
- 用PBT清洗三次，每次10分钟。
- 在室温下用荧光染料标记的二抗（以1% BSA稀释）孵育2小时，或在4°C过夜孵育，以检测标记物。 4 °C由于PLA信号后续将用红色荧光染料进行可视化，因此必须使用另一种荧光染料来检测标记物—— 例如使用1:200稀释的FITC标记抗山羊抗体检测山羊抗HRP抗体。由于使用光敏试剂，从此时起须将试管置于避光条件下。
注意：所使用的试剂盒允许在小鼠和兔来源的一抗之间进行PLA实验，信号可在共聚焦显微镜的红色通道中观察到。如有需要，也可选用其他试剂盒，以实现其他物种来源的一抗之间的检测，并在其他通道中观察信号。
3. 邻近连接实验
注意：除非另有说明，所有步骤均需在室温下进行，并轻轻振荡。
- PLA探针
- 用PBT清洗体壁，每次10分钟，共清洗三次。
- 在1% BSA中按1:5稀释PLA探针，孵育2小时 37 °C. 在这种情况下，使用 40 µl 小鼠MINUS PLA探针 40 µl PLA探针抗兔PLUS和 120 µl 1% BSA 以确保 5-10 个体壁的充分浸润和混合。PLA 探针稀释至 1:25 仍可获得足够的信噪比（即，本实验）。
- 连接反应
- 用洗涤缓冲液A洗涤体壁，每次5分钟，重复两次。
- 在连接缓冲液中加入连接酶（1:40 稀释）配制连接反应液，37 °C孵育 1 小时 37 °C在这种情况下，使用 5 µl 连接酶 40 µl 5 L连接缓冲液 155 µl 高纯度水，以确保5-10个体壁的充分浸润和混合。
- 扩增
- 用 Wash Buffer A 清洗体壁，每次 2 分钟，共清洗两次。
- 在扩增缓冲液中加入聚合酶（1:80稀释），配制成扩增溶液，于该溶液中孵育2小时 37 °C。在这种情况下，使用 2.5 µl 聚合酶 40 µl 5 倍扩增缓冲液和 157.5 µl 加入高纯度水，确保5-10个体壁充分浸润并混合均匀。
- 成像前准备
- 用洗涤缓冲液B洗涤体壁，每次10分钟，重复两次。
- 用 0.01x 洗涤缓冲液 B 洗涤一次，每次 1 分钟。
- 在封片前，用少量封片液平衡至少30分钟，或于4°C避光过夜保存。 4 °C.
- 使用精细镊子，小心地将体壁转移到载玻片平台上，使角质层朝下。在一小滴或两滴封片剂中，将体壁按行排列并保持方向一致。盖上22 mm × 40 mm的盖玻片，注意避免产生气泡，然后用透明指甲油密封载玻片。
- 将载玻片置于黑暗环境中，于 -20 °C 待进行共聚焦成像前保存。
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结果
在野生型三龄幼虫神经肌肉接头（NMJ）中，Dlg 主要分布于 I 型谷氨酸能突触小体的突触后膜，且在 Ib 型突触小体中的 Dlg 免疫反应信号强度高于 Is 型突触小体（图 3A）4。Hts 在肌肉中广泛分布，但在突触后区域富集，其免疫反应信号在两种 I 型突触小体中强度相近，同时也在突触前区域存在（图 3A'）8,17。需要注意的是，Dlg 与 Hts 在突触后区域的分布大部分重叠（图 3A''）8。
为了确定Dlg和Hts是否在神经肌肉接头（NMJ）处形成复合物，我们在幼虫体壁肌制备样本上进行了两种蛋白之间的邻近连接实验（PLA）。在该实验中，使用了一种小鼠抗Dlg抗体，可识别N端的第二个PDZ结构域，以及一种兔抗HtsM抗体，可识别C端的MARCKS同源结构域15,16。在野生型样本中，Dlg与Hts之间的PLA信号特异性地出现在神经肌肉接头处（图3C-C''
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讨论
本报告展示了如何将 PLA 技术应用于黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）。该检测方法使用幼虫体壁肌制备样本，旨在检测 NMJ 处内源性蛋白质-蛋白质相互作用。利用该技术，发现 Dlg 与 Hts 在空间上彼此靠近，因此特异性地存在于突触后区域的同一复合物中27。支持该结果的先前研究提供了以下证据：1）Dlg 与 Hts 的免疫反应性分布信号在幼虫 NMJ 的突触后区域存在重叠；2）基于对整只成年果蝇裂解液进行的共免疫沉淀实验，证实 Dlg 与 Hts 可形成复合物；3）Dlg 与 Hts 在上皮连接和突触连接中均存在相互作用8。此外，在突触后区域还检测到 Dlg 与 Pak 之间的 PLA 信号，而二者之间的相互作用已在其他研究中被证实，进一步验证了该方法在 NMJ 研究中的适用性15,20,21。有趣的是，尽管 Pak 与 Wg 在 NMJ 处的免疫反应性分布存在重叠，但二者之间的 PLA 检测并未产生可观察到的信号。该结果表明，并非所有免疫反应性分布重叠的蛋白质都能产生 PLA 信号，因此说明 PLA 在检测蛋白质-蛋白质相...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Bloomington果蝇品系中心提供果蝇品系。同时感谢发育研究杂交瘤库以及耶鲁大学的Lynn Cooley博士提供抗体。特别感谢AhHyun Yoo在稿件撰写过程中提供的帮助。 本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（Krieger）、William和Ada Isabelle Steel基金（Krieger）以及加拿大卫生研究院（Harden）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子（精细 #5） | Almedic | A10-704 | |
| 硅胶盘（Sylgard Disc） | World Precision Instruments | SYLG184 | 将弹性体基础液与固化剂按10:1比例混合，静置30分钟。倒入模具中（例如 使用12孔细胞培养板）。室温下固化至少24小时。解剖时将其粘附于60 × 15 mm培养皿盖内侧。 |
| 显微销钉（Minutien Pins，尖端直径0.0125 mm） | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 显微解剖剪（超精细） | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 平台载玻片（Platform Slides） | 用透明指甲油将两片22 × 22 mm2盖玻片粘合在显微镜载玻片上，中间留出约<20 mm的间隙用于样品固定。 | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | 该品系已使用GFP标记的平衡染色体重新平衡，可通过GFP信号的缺失筛选纯合突变体。 |
| 1× PBS（磷酸盐缓冲液）：3 mM NaH2PO4，7 mM Na2HPO4，130 mM NaCl，pH 7.0 | NaH2PO4（Caledon Laboratories - 8180-1），Na2HPO4（Caledon - 8120-1），NaCl（Caledon - 7560-1） | ||
| Bouin固定液 | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA（多聚甲醛）：1× PBS中含4% PFA | PFA（Anachemia Science - 66194-300）。配制方法参见 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006。 | ||
| [header] | |||
| 1× PBT（含Triton的磷酸盐缓冲液）：1× PBS中含0.01% Triton | Triton X-100（Sigma-Aldrich - T8787） | ||
| 1% BSA（牛血清白蛋白）：1% BSA溶于1× PBT | BSA（Bioshop Canada - ALB001）。4 °C保存。 | ||
| 小鼠抗Dlg（Discs large）抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | 用1% BSA按1:10稀释后使用。 |
| 兔抗HtsM（Hu-li tai shao）抗体 | 由耶鲁大学Lynn Cooley博士提供。用1% BSA按1:250稀释后使用。 | ||
| 兔抗Pak（p21激活激酶）抗体 | 由西蒙弗雷泽大学Nicholas Harden博士提供。用1% BSA按1:500稀释后使用。 | ||
| 小鼠抗Wg（Wingless）抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | 用1% BSA按1:5稀释后使用。 |
| 山羊抗Hrp（辣根过氧化物酶）抗体 | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | 用1% BSA按1:200稀释后使用。 |
| FITC标记的驴抗山羊抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | 用1% BSA按1:200稀释后使用。 |
| Duolink原位PLA探针 抗小鼠 MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink原位PLA探针 抗兔 PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink原位检测试剂 红色 | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1× 洗涤缓冲液A：0.01 M Tris，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1），Tween 20（Fisher Scientific - BP337） |
| 1× 洗涤缓冲液B：0.2 M Tris，0.1 M NaCl，pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1） |
| 0.01× 洗涤缓冲液B：2 mM Tris，1 mM NaCl，pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1） |
| Duolink原位封片介质（含DAPI） | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
参考文献
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