细胞与分子极化的快速和强大的分析趋化因子诱导信号

摘要

趋化因子信号转导引起细胞形态的显着改变和细胞内蛋白质的一些重要重新分布。在这里，提供了一个快速而详细的方案来研究这些事件。

摘要

细胞响应由失去其圆形形状在这个过程被称为极化，并通过改变许多蛋白质​​的亚细胞定位趋化因子刺激。经典的成像技术已被用来研究这些现象。然而，他们所需要的手工采集许多细胞后跟形态和共定位几十细胞染色的耗时定量。这里，快速和有效的方法被描述为在由几千利用流式细胞技术的成像流动，结合了显微镜的优点与这些细胞仪的细胞的样品研究了这些现象。使用与CCL19和染色MHC I类分子和丝状肌动蛋白刺激的T淋巴细胞，一个选通策略提出同时测量形状的改变的程度和标记物的共定位该受CCL19信令的程度。此外，这门控策略使我们能够observë丝状肌动蛋白（正面）和磷酸化Ezrin蛋白 - 根蛋白 - 膜突（磷ERM）的蛋白质（在后面）中的CXCL12刺激后偏振性T细胞的分离。这种技术也是有益的，观察偏振的两种不同元素的阻挡效果：由PAR6 /非典型PKC信号传导途径的突变体的药理抑制剂和表达抑制肌动蛋白聚合的。因此，有证据表明，这种技术是分析这两种形态的改变和蛋白质再分配有用。

引言

趋化因子是吸引细胞专门的地点¹小的可溶性蛋白质。因此，它们参与细胞在组织中的正确定位，在发展和生理的一个关键功能。免疫系统是无例外，因为它依赖于在音乐会其作用是进行有效的免疫应答的许多不同类型的细胞的作用。通过控制在一个给定的状态下的一种免疫细胞类型的具体位置，趋化因子是预先需要外来抗原可被检测并中和之前。

在T淋巴细胞特别是趋化因子绑定到特定的表面受体其中，在接合时，引起许多细胞内的信号（钙上升，ERK磷酸化，卢GTP酶的活化，增加整合的亲和力和细胞骨架的改变）有利于T细胞的活力^2,3。在细胞水平，人们可以观察到形态学改变时的趋化因子刺激引起。这些变化在细胞形状是在T细胞中特别引人注目：静息T细胞具有珠状轮的形态在血流中行进时。然而，在炎症部位或淋巴器官的附近的趋化因子的存在的感测会改变T细胞的形状，现在采用一种典型的“手镜”的形态组成的双极形式：前缘在前面和后缘，或尾肢，在后面^4。此外，细胞内的组分可以分离成偏振性T细胞的这两个相对的区域，以维持迁移。例如，在趋化因子刺激⁵和聚合的肌动蛋白微丝聚合增加积聚在一个极化T细胞²的前面。另一方面，一些蛋白质，如Ezrin蛋白 - 根蛋白 - 膜突（ERM）家族，质膜链接到皮质F-肌动蛋白细胞骨架，磷酸化的蛋白质重新定位于极化的尾肢T细胞^6。有趣的是，我们和其他人已经表明，所需的T细胞迁移该偏振过程。事实上，与极化干扰任何治疗会抑制细胞运动。例如，抑制非典型蛋白成员的活性的激酶C（PKC）家族，蛋白激酶Cζ和PKCι块T细胞极化和树突细胞⁷的其迁徙扫描过程。 T细胞极化也受卢GTP酶。我们已经表明，RhoA活性的由最近描述Fam65b蛋白调制与形态学T细胞的变化和它们的能力干涉以在Transwell小试验⁶迁移。作为极化是细胞运动的前提步骤，它是这样的关键是能够量化它作为趋化因子应答的主读出。细胞形态改变，以前手工测量^8。然而，这种量化的非常费时，因此通常只有几几十细胞都考虑在内。

在这里，一个新的方法，提出了快速量化暴露于趋化因子刺激的T淋巴细胞的形状的改变的程度。流式细胞技术的成像流（ 见表特定试剂/设备 ）的情况下，它结合了流式细胞仪和显微镜⁹的优势，有效地量化的趋化因子刺激的不同条件极化的细胞的量。除了形态学改变，人们可以使用该技术鲁棒测量的定量，还能够评价的变化时的趋化因子信号传导的一些蛋白质的亚细胞定位。

方案

1.准备T淋巴细胞

1. 准备主鼠标或人类T细胞所描述^10,11。
2. 培养的人T细胞在完全的RPMI培养基中，用10％的人血清AB以2的密度- 3×10 ⁶个细胞/ ml。
   注意：使用胎牛血清（FCS）代替人血清的能引起人T细胞的培养的大部分的自发极化。在此期间5天，进一步处理他们在任何时候 - 保持这些细胞的培养4。
3. 保持小鼠的T细胞在一个相似的细胞密度在补充有10％FCS的完全RPMI培养基。在10毫微克/毫升IL7存在立即使用或隔天，后O / N培养在37℃。
4. 培养CEM人T-细胞系在完全RPMI补加10％FCS中。

2.趋化因子刺激

1. 在补充了10mM的HEPE温暖的HBSS培养基洗每个实验条件5×10 ⁵个细胞秒。对于一些实验中，前一天共转染原代人T细胞与2微克pmaxGFP和8微克的pcDNA3.1 ^+（空载体对照），蛋白激酶Cζ激酶死的，或N末端​​PAR6质粒。
2. 悬浮在温暖的HBSS-HEPES中的细胞沉淀（用实验条件0.3毫升X号）。
3. 分发在1.5ml微量离心管中的细胞。
   注：因此，对应于一个单一的实验条件1管将含有5×10 ⁵个细胞在0.3毫升的HBSS-HEPES培养基。对于一些实验中，加入500纳米Latrunculin A或车辆（DMSO）孵育细胞趋化因子刺激前30分钟。
4. 添加10〜500毫微克/毫升的CCL19或CXCL12趋化因子中的每个管中。
   注：我们通常使用10 - 200毫微克/毫升的趋化因子对人类T细胞。 CEM细胞不表达CCR7受体结合CCL19。因此，CEM细胞将仅能够以一个CXCL12刺激作出响应。此外，使用较高浓度的趋化因子（300 - 500 N克/毫升）极化小鼠T细胞。
5. 翻转管几次，分别孵育它们在37℃的水浴中8或10分钟为主要的T细胞或CEM。
6. 通过加入到每个管0.3ml的含有2％多聚甲醛（PFA）和10mM的Hepes在PBS中的热溶液停止该极化过程。翻转试管孵育它们在37℃下5分钟。

3.染色

1. 从离心管转移至细胞流式细胞管中。
2. 完全填充管与含有1％牛血清白蛋白（BSA），0.5毫摩尔EDTA及10毫摩尔的Hepes的PBS室温溶液中。
3. 离心管中，在460 XG 4分钟。
4. 弃去上清并将细胞重新悬浮在100μl的含5％FCS的PBS室温溶液中。
5. 添加5微升的FITC的抗HLA-ABC在每个管中，涡流它们，它们孵育30分钟，在室温，避光。
6. 用PBS含5％FCS洗涤一次细胞，一ND一次PBS而已。
7. 在RT：加入500μl1％PFA中，孵育10分钟，然后用含有1％BSA，0.5毫摩尔EDTA和10mM HEPES的PBS溶液洗涤细胞。
8. 弃去上清液，完全填充管以含0.2％BSA，0.1％皂甙，0.5毫摩尔EDTA和10mM的Hepes（透化缓冲液）的PBS溶液。
9. 在该培养基中洗涤细胞两次。
10. 翻转管以除去介质，涡旋它们以解离细胞团。
11. 添加0.25微克/毫升TRITC-鬼笔环肽和/或1：100稀释的抗P-ERM抗体与各管中，涡流它们并温育30分钟，在室温。
12. 与通透缓冲洗涤细胞。孵育如有必要，荧光第二抗体。
13. 悬浮细胞在200微升PBS，并将其转移到离心管。
    注：细胞准备收购。另外，同时保持每管200微升最大总容积，加浓PFA到最终1％为了集中保存染色，如果细胞不被使用的同一天，以便进一步处理。

4.图像采集与分析

1. 开关上的装置（ 见表特定试剂/设备 ），并让它根据制造商的说明校准自身。
   注：INSPIRE软件有40X的目标（0.75 NA）使用。思想3.0软件被用于所有报告的量化值。
2. 制备了一系列的采集窗口，并且可以保存在一个模板以供将来的实验。得出量化的RMS梯度值直方图。从“聚焦”人群中，对RMS梯度直方图选择，delimitate的“单细胞”群对区域的直方图。一旦离心管已插入在机器中，调整激光功率，对单个细胞栅极和获得5000 T淋巴细胞。
3. 在软理念洁具，开收购文件，并创建为每个单元获得的直方图，将显示为亮场图像梯度RMS值的值（通道1）。借鉴RMS梯度直方图认为细胞表现出RMS上述57梯度值门。
   注：RMS梯度允许考虑到在分析仅T淋巴细胞是在焦平面。我们已经凭经验确定，表现出的R​​MS梯度值优于57个体细胞是在焦平面，并且可以精确地考虑。
4. 在分析/面具菜单，创建一个新的面具，被称为从在明图像M01，侵蚀了2个像素的形态面具侵蚀（M01,2）。然后，在分析/功能菜单，创建面积，计算出的侵蚀（M01,2）面具的一项新功能。从在前面的门中选择的细胞中，打开一个直方图表示使用这个新创建的掩模单元的面积。
   注：该形态口罩可用通过默认比小区的实际尺寸要大得多。因此，更精确的侵蚀它最多2个像素。
5. 对个人的T细胞画门，不包括校准珠和碎片（小面积）和双峰（大区）。在每次采集调整这个门。
   注：在细胞大小的变化会影响到门的位置。小鼠T细胞是比人类T细胞它们本身比CEM细胞小较小，每种细胞类型的区域将正比于它的大小。
6. 考虑到单，在焦细胞进行门控，在前面的步骤中，打开一个点图构成的原料最大象素上的HLA-ABC染色（通道2中，x轴）作为原料最大象素上的鬼笔环肽的功能染色（第4频道，Y轴）。创建栅极排除未染色或饱和荧光事件。打开两个直方图显示了原始最大像素为HLA-ABC（通道2）和鬼笔（第四频道）染色。
7. 在分析/面具菜单，科瑞EA新的面具，被称为从HLA-ABC染色细胞（通道2），侵蚀了2个像素的形态面具侵蚀（M02,2）。然后，在分析/功能菜单，创建包含圆参数的新功能，计算上的侵蚀（M02,2）。
   注：此参数测量细胞形状的偏差的圆。因此，浑圆的T细胞将具有高圆形度的值，而细长偏振光细胞将显示出低圆度指数。
8. 接着，创建另一直方图，将来自先前门控细胞报告圆特征的值。使用这个直方图根据该圆度为每个单独的单元格的值直接绘制的个体，在焦细胞群的分布。
9. 看着直方图用于非刺激的细胞的形状，画出一个门，用于极化的细胞，从最低值圆到圆的限制值，其中大部分的未刺激细胞的绘制。看看统计数据显示极化细胞的门控人口的比例（％门控）。
   注意：我们设置这个门为低于13圆的索引值。
10. 为了看在细胞中的肌动蛋白染色的偏振，画出的直方图为明亮详细相似度R3值，比较所述HLA-ABC染色（通道2）和鬼笔环肽染色（通道4）。
    注：做大这一功能的价值，更多的叠加两个染色的。
11. 使用与以前相同的选通策略，在非刺激的细胞为分离的染色，显示细胞极化肌动蛋白染色的百分比绘制栅极。
12. 当完成时，细胞中的MHC I类和鬼笔环肽染色，偏光细胞连同所有细胞数±标准差的圆度和相似度指标的平均值的百分比的分布呈现偏析的百分比示于corresponding统计面板。

结果

这里选择的第一个例子是关于使用与CCL19刺激的人初级T淋巴细胞的。然而，同样的策略可用于原发性小鼠T细胞，T细胞系或任何其他细胞类型响应于趋化因子刺激。这里介绍的门控战略包括一系列选择聚焦的事件，那么单个细胞窗口。最后荧光强度的范围被这里作为一个例子，随后在两个标记：对MHC I类HLA-ABC和丝状肌动蛋白为静息（ 图1）或CCL19刺激（ 图2）的T淋巴细胞。

首先，将圆度指数测量在未处理的（ 图1）或CCL19刺激（ 图2）的T淋巴细胞。该静息细胞有具有高圆形度指数值的一个主要的单峰的事实表明，大部分细胞是接近圆。然而，很明显，CCL19刺激诱发的外观Ò细胞FA具有低圆指数第二亚群。该亚群包括已采用极化形态的细胞。此外，代表HLA-ABC和F-肌动蛋白染色的明亮详细相似度索引时，可以观察到某些细胞表现出在此指数时CCL19的治疗价值的下降，这表明这两个标记显示共定位的程度较低。有趣的是，从点图先前提出，可以在任何特定的点的位置的光标来获得由...

讨论

使用最近的成像流技术术，快速和翔实门控策略进行分析诱导的趋化因子刺激的细胞和分子事件呈现。从一个单一的实验，可以得到的信息的两个主要类型：诱导的趋化因子刺激和不同的蛋白质的过程中的极化过程的亚细胞分布的细胞形态的变化。有趣的是，证据还提供了用于分析大量细胞的，这允许统计鲁棒性和整个细胞群体的一小部分相关的分析的可能性。据报道，这种技术也可用于在免疫突触¹²的上下文分析分子再分配事件。此外，一组类似的向上已经用于SDF1刺激T细胞但已被提供¹³没有分析共定位的两个标记之间的程度。

虽然因而这种技术可以适用于许多类型的细胞，粘附细胞，不能直接进行分析和细胞悬浮液之前需要采集固定。除了机器的这些固有的限制，这是关键的刺激它们时，以保持细胞在37℃。温度的确键实现合适的T细胞的极化自细胞骨架的变化，如肌动蛋白聚合，驱动形态的变化，都非常依赖于温度。我们的实验用latrunculin A处理的细胞确认正确的肌动蛋白重塑诱导趋化因子的刺激确实是至关重要的一个单元，以实现其完全极化状态。除了提供这里用此药的数据，我们还测试了成像流式细胞仪技术与转染了该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	Gibco	61870-010
人血清 AB	PAA	C11-021	预热以灭活补体。
胎牛血清	PAN Biotech	P30-3300	预热以灭活补体。
人 T 细胞核因子试剂盒	Lonza	VCA-1002
小鼠 IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	37 &°C 温热C 使用前进行水浴。
Hepes	Gibco	15630-056
小鼠 CCL19	Peprotech	250-27B	等分试样在冰上解冻，然后向细胞中加入趋化因子。
在将趋化因子加入细胞之前，将	人 CCL19	Peprotech	300-29B
人 CXCL12	Peprotech	300-28A	等分试样在冰上解冻，然后将趋化因子加入细胞中。这种趋化因子也可用于小鼠 T 细胞。
PFA	电子显微镜科学	157-8-100	这是 8% PFA 的水溶液。与 2x PBS 逐体积混合，以获得 PBS 中的 4% PFA 溶液。
BSA	Sigma	A3059
皂苷	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 鬼笔环肽	Invitrogen	A12381
FITC 抗 HLA-ABC 抗体	贝克曼库尔特	IM1838	克隆 B9.12.1
抗 P-ERM 抗体	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	阿姆尼斯