趋化因子信号诱导的细胞与分子极化的快速稳健分析

摘要

趋化因子信号转导会引起细胞形态的显著改变以及细胞内蛋白质的重要重分布。本文提供了一种快速且详细的实验方案用于研究这些事件。

摘要

细胞在趋化因子刺激下会失去其圆形形态，这一过程称为极化，同时许多蛋白质的亚细胞定位也会发生改变。传统成像技术已被用于研究这些现象，但需要手动采集大量细胞，并对数十个细胞的形态及染色共定位进行耗时的定量分析。本文介绍了一种快速而强大的方法，利用成像流式细胞术技术，结合显微镜与流式细胞仪的优势，可在包含数千个细胞的样本上研究上述现象。通过使用CCL19刺激T淋巴细胞，并对MHC I类分子和丝状肌动蛋白进行染色，本文提出了一种设门策略，可同时量化形态改变的程度以及受CCL19信号影响的标记物共定位情况。此外，该设门策略使我们能够观察到在CXCL12刺激后，极化T细胞中丝状肌动蛋白（位于前部）与磷酸化Ezrin-Radixin-Moesin（phospho-ERM）蛋白（位于后部）的分离现象。该技术还可用于观察两种不同因素对极化的抑制效应：通过药理学抑制剂阻断肌动蛋白聚合，以及表达Par6/非典型PKC信号通路的突变体。因此，本文证明了该技术可用于分析形态学改变及蛋白质重分布。

引言

趋化因子是一类小分子可溶性蛋白质，能够将细胞吸引至特定位置¹。因此，它们参与细胞在组织中的精确定位，这一功能在发育和生理过程中至关重要。免疫系统也不例外，其功能依赖于多种不同类型细胞的协同作用，以产生有效的免疫应答。通过调控特定状态下某一免疫细胞类型的精确定位，趋化因子在识别和中和外来抗原之前即已发挥必要的前提作用。

特别是在T淋巴细胞中，趋化因子会结合特定的细胞表面受体，受体被激活后可引发多种细胞内信号通路（如钙离子浓度升高、ERK磷酸化、Rho GTP酶活化、整合素亲和力增强以及细胞骨架的改变），从而促进T细胞的运动能力^2,3。在细胞水平上，可以观察到趋化因子刺激所引发的形态学变化。这些细胞形态的改变在T细胞中尤为显著：静息状态的T细胞在血液中循环时呈珠状圆形。然而，当T细胞感知到炎症部位或淋巴器官附近存在趋化因子时，其形态会发生改变，转变为典型的“手镜样”形态，即呈现双极结构：前端为 Leading edge（前缘），后端为 trailing edge（尾突），也称为 uropod（尾足）⁴。此外，细胞内组分可在极化的T细胞的这两个相对区域中发生区室化分布，以维持细胞迁移。例如，趋化因子刺激可增强肌动蛋白丝的聚合⁵，而聚合的肌动蛋白则在极化T细胞的前端富集²。另一方面，多种蛋白质，如Ezrin-Radixin-Moesin（ERM）家族的磷酸化蛋白（可连接细胞膜....

方案

1. T 淋巴细胞的制备

1. 按照文献^10,11所述方法制备原代小鼠或人T细胞。
2. 将人T细胞在含10%人AB型血清的完全RPMI培养基中培养，细胞密度为2 - 3 × 10⁶ 个细胞/ml。
   注意：使用胎牛血清（FCS）替代人血清可能导致体外培养中大量人T细胞自发极化。将这些细胞继续培养4 - 5天，并可在该时间段内任意时间点进行后续处理。
3. 将小鼠T细胞维持在补充有10% FCS的完全RPMI培养基中，细胞密度与上述相似。细胞可在37 °C、含10 ng/ml IL7的条件下过夜培养后立即使用或次日使用。
4. 将CEM人T细胞系在补充有10% FCS的完全RPMI培养基中培养。

2. 趋化因子刺激

1. 每种实验条件下，用添加了10 mM Hepes的温热HBSS培养基洗涤5 × 10⁵个细胞。在某些实验中，于前一天共转染2 µg pmaxGFP和8 µg pcDNA3.1⁺（空载体对照）、PKCζ激酶失活突变体或N端Par6质粒至原代人T细胞。
2. 将细胞沉淀重悬于温热的HBSS-Hepes培养基中（使用0.3 ml × 实验条件数量）。
3. 将细胞分装至1.5 ml微量离心管中。
   注意：因此，每支对应单一实验条件的离心管....

结果

此处选择的第一个示例涉及使用CCL19刺激的人原代T淋巴细胞。然而，相同的策略也可用于小鼠原代T细胞、T细胞系或任何其他对趋化因子刺激有反应的细胞类型。此处展示的设门策略包括一系列窗口，用于选择目标事件，然后选择单个细胞。最后，以两个标志物为例，展示了荧光强度的范围：MHC I类分子HLA-ABC和丝状肌动蛋白，分别对应静息状态（图1）或CCL19刺激后的T淋巴细胞（图2）。

首先，在未处理的（图1）或经CCL19刺激的（图2）T淋巴细胞中测量圆形度指数。静息状态的细胞呈现一个主要的单一峰，且圆形度指数值较高，表明大多数细胞接近圆形。然而，CCL19刺激明显导致出现第二个圆形度指数较低的细胞亚群，该亚群包含已呈现极化形态的细胞。此外，当绘制HLA-ABC与F-肌动蛋白染色之间的亮细节相似性指数时，可以观察到部分细胞在CCL19处理后该指数值下降，表明这两个标记物的共定位程度降低。有趣的是，从此前展示的散点图中，可将光标置于任意一个数据点上，以查看对.......

讨论

本文介绍了一种利用成像流式细胞术这一前沿技术，快速且信息丰富的门控策略，用于分析趋化因子刺激所诱导的细胞和分子事件。通过单次实验，可获得两类主要信息：趋化因子刺激引起的细胞形态变化，以及极化过程中不同蛋白质的亚细胞分布情况。值得注意的是，该方法还可对大量细胞进行分析，从而实现统计学上的稳健性，并对整体细胞群中少量亚群进行有效分析。如已有报道所示，该技术还可用于分析免疫突触环境中的分子重分布事件¹²。此外，类似实验体系已应用于SDF1刺激的T细胞研究，但尚未提供两种标记物之间共定位程度的分析结果¹³。

尽管该技术因此适用于多种细胞类型，但贴壁细胞无法直接进行分析，且悬浮细胞在检测前需要固定。除了仪器本身的这些固有限制外，在刺激细胞时保持细胞处于37 °C也至关重要。温度对于实现适当的T细胞极化尤为关键，因为细胞骨架的改变（如驱动形态变化的肌动蛋白聚合）对温度高度依赖。我们使用Latrunculin A处理细胞的实验结果证实，趋化因子刺激所诱导的正常肌动蛋白重塑对于细胞达到完全极化状态确实至关重要。除了本文提供的该药物相关数据外，我们还利用转.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	Gibco	61870-010
人AB型血清	PAA	C11-021	预热以灭活补体。
胎牛血清	PAN Biotech	P30-3300	预热以灭活补体。
人T细胞核转染试剂盒	Lonza	VCA-1002
小鼠IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	使用前在37 °C水浴中预热。
Hepes	Gibco	15630-056
小鼠CCL19	Peprotech	250-27B	分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。
人CCL19	Peprotech	300-29B	分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。
人CXCL12	Peprotech	300-28A	分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。该趋化因子也可用于小鼠T细胞。
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	这是水中8%的PFA溶液。与2倍浓度的PBS按体积比1:1混合，可获得PBS中4%的PFA溶液。
BSA	Sigma	A3059
皂苷	Fluka	84510
Alexa Fluor 594鬼笔环肽	Invitrogen	A12381
FITC标记的抗HLA-ABC抗体	Beckman Coulter	IM1838	克隆号B9.12.1
抗P-ERM抗体	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis