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方法文章

趋化因子信号诱导的细胞与分子极化的快速稳健分析

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DOI：

10.3791/52140

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2014年12月12日

 , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, 2Cnrs, UMR8104, 3Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

本文内容

摘要

趋化因子信号转导会引起细胞形态的显著改变以及细胞内蛋白质的重要重分布。本文提供了一种快速且详细的实验方案用于研究这些事件。

摘要

细胞在趋化因子刺激下会失去其圆形形态，这一过程称为极化，同时许多蛋白质的亚细胞定位也会发生改变。传统成像技术已被用于研究这些现象，但需要手动采集大量细胞，并对数十个细胞的形态及染色共定位进行耗时的定量分析。本文介绍了一种快速而强大的方法，利用成像流式细胞术技术，结合显微镜与流式细胞仪的优势，可在包含数千个细胞的样本上研究上述现象。通过使用CCL19刺激T淋巴细胞，并对MHC I类分子和丝状肌动蛋白进行染色，本文提出了一种设门策略，可同时量化形态改变的程度以及受CCL19信号影响的标记物共定位情况。此外，该设门策略使我们能够观察到在CXCL12刺激后，极化T细胞中丝状肌动蛋白（位于前部）与磷酸化Ezrin-Radixin-Moesin（phospho-ERM）蛋白（位于后部）的分离现象。该技术还可用于观察两种不同因素对极化的抑制效应：通过药理学抑制剂阻断肌动蛋白聚合，以及表达Par6/非典型PKC信号通路的突变体。因此，本文证明了该技术可用于分析形态学改变及蛋白质重分布。

引言

趋化因子是一类小分子可溶性蛋白质，能够将细胞吸引至特定位置1。因此，它们参与细胞在组织中的精确定位，这一功能在发育和生理过程中至关重要。免疫系统也不例外，其功能依赖于多种不同类型细胞的协同作用，以产生有效的免疫应答。通过调控特定状态下某一免疫细胞类型的精确定位，趋化因子在识别和中和外来抗原之前即已发挥必要的前提作用。

特别是在T淋巴细胞中，趋化因子会结合特定的细胞表面受体，受体被激活后可引发多种细胞内信号通路（如钙离子浓度升高、ERK磷酸化、Rho GTP酶活化、整合素亲和力增强以及细胞骨架的改变），从而促进T细胞的运动能力2,3。在细胞水平上，可以观察到趋化因子刺激所引发的形态学变化。这些细胞形态的改变在T细胞中尤为显著：静息状态的T细胞在血液中循环时呈珠状圆形。然而，当T细胞感知到炎症部位或淋巴器官附近存在趋化因子时，其形态会发生改变，转变为典型的“手镜样”形态，即呈现双极结构：前端为 Leading edge（前缘），后端为 trailing edge（尾突），也称为 uropod（尾足）4。此外，细胞内组分可在极化的T细胞的这两个相对区域中发生区室化分布，以维持细胞迁移。例如，趋化因子刺激可增强肌动蛋白丝的聚合5，而聚合的肌动蛋白则在极化T细胞的前端富集2。另一方面，多种蛋白质，如Ezrin-Radixin-Moesin（ERM）家族的磷酸化蛋白（可连接细胞膜与皮层F-肌动蛋白细胞骨架），会重新定位至极化T细胞的尾足部位6。有趣的是，我们及其他研究者已证实，这种极化过程是T细胞迁移所必需的。事实上，任何干扰极化的处理都会抑制细胞的运动能力。例如，抑制非典型蛋白激酶C（PKC）家族成员PKCζ和PKCι的活性，会阻断T细胞的极化及其对树突状细胞的迁移扫描过程7。T细胞极化还受到Rho GTP酶的调控。我们已证明，由新近发现的Fam65b蛋白对RhoA活性的调节，会影响T细胞的形态改变及其在Transwell迁移实验中的迁移能力6。由于极化是细胞运动的前提步骤，因此将其作为趋化因子反应的主要读出指标进行定量分析显得尤为关键。以往，细胞形态变化主要依靠人工测量8。然而，此类定量方法极为耗时，通常仅能统计数十个细胞。

本文介绍了一种快速定量分析T淋巴细胞在趋化因子刺激下形态改变程度的新方法。该方法采用成像流式细胞术（见特异性试剂/仪器表格），结合了流式细胞仪与显微镜的优势9，可高效定量不同趋化因子刺激条件下极化细胞的数量。除了能够稳健地测量细胞形态学变化外，该技术还可用于评估趋化因子信号传导过程中某些蛋白质亚细胞定位的变化。

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方案

1. T 淋巴细胞的制备

  1. 按照文献10,11所述方法制备原代小鼠或人T细胞。
  2. 将人T细胞在含10%人AB型血清的完全RPMI培养基中培养，细胞密度为2 - 3 × 106 个细胞/ml。
    注意：使用胎牛血清（FCS）替代人血清可能导致体外培养中大量人T细胞自发极化。将这些细胞继续培养4 - 5天，并可在该时间段内任意时间点进行后续处理。
  3. 将小鼠T细胞维持在补充有10% FCS的完全RPMI培养基中，细胞密度与上述相似。细胞可在37 °C、含10 ng/ml IL7的条件下过夜培养后立即使用或次日使用。
  4. 将CEM人T细胞系在补充有10% FCS的完全RPMI培养基中培养。

2. 趋化因子刺激

  1. 每种实验条件下，用添加了10 mM Hepes的温热HBSS培养基洗涤5 × 105个细胞。在某些实验中，于前一天共转染2 µg pmaxGFP和8 µg pcDNA3.1+（空载体对照）、PKCζ激酶失活突变体或N端Par6质粒至原代人T细胞。
  2. 将细胞沉淀重悬于温热的HBSS-Hepes培养基中（使用0.3 ml × 实验条件数量）。
  3. 将细胞分装至1.5 ml微量离心管中。
    注意：因此，每支对应单一实验条件的离心管将含有5 × 105个细胞，溶于0.3 ml HBSS-Hepes培养基中。在某些实验中，加入500 nM Latrunculin A或溶剂对照（DMSO），并在趋化因子刺激前孵育30分钟。
  4. 在每支离心管中加入10至500 ng/ml的CCL19或CXCL12趋化因子。
    注意：我们通常对人T细胞使用10–200 ng/ml的趋化因子浓度。CEM细胞不表达可结合CCL19的CCR7受体，因此CEM细胞仅能对CXCL12刺激产生反应。此外，诱导小鼠T细胞极化时需使用较高浓度的趋化因子（300–500 ng/ml）。
  5. 轻轻翻转离心管数次，随后将原代T细胞或CEM细胞分别在37 °C水浴中孵育8分钟或10分钟。
  6. 通过向每支离心管中加入0.3 ml含2%多聚甲醛（PFA）和10 mM Hepes的温热PBS溶液终止极化过程。翻转离心管，并在37 °C孵育5分钟。

3. 染色

  1. 将细胞从微量离心管转移至流式细胞仪检测管中。
  2. 用含有1%牛血清白蛋白（BSA）、0.5 mM EDTA和10 mM Hepes的PBS溶液（室温）将管子完全充满。
  3. 以460 × g离心4分钟。
  4. 弃去上清液，将细胞重悬于100 µl含5%胎牛血清（FCS）的PBS溶液（室温）中。
  5. 每管加入5 µl FITC标记的抗HLA-ABC抗体，涡旋混匀后避光、室温孵育30分钟。
  6. 用含5% FCS的PBS洗涤细胞一次，再用PBS洗涤一次。
  7. 室温下：每管加入500 µl 1%多聚甲醛（PFA），孵育10分钟后，用含1% BSA、0.5 mM EDTA和10 mM HEPES的PBS溶液洗涤细胞。
  8. 弃去上清液，用含0.2% BSA、0.1%皂苷、0.5 mM EDTA和10 mM Hepes的PBS溶液（破膜缓冲液）将管子完全充满。
  9. 在此缓冲液中洗涤细胞两次。
  10. 将管子倒置以去除液体，涡旋振荡以充分分散细胞沉淀。
  11. 每管加入0.25 µg/ml TRITC标记的鬼笔环肽（Phalloidin）和/或1:100稀释的抗P-ERM抗体，涡旋混匀后室温孵育30分钟。
  12. 用破膜缓冲液洗涤细胞。如需检测，可加入荧光标记的二抗并孵育。
  13. 将细胞重悬于200 µl PBS中，并转移至微量离心管。
    注意：细胞现已准备好用于上机检测。或者，若细胞不在当天进行后续实验，可在保持每管总体积不超过200 µl的前提下，加入浓缩的PFA至终浓度为1%，以保存染色结果。

4. 图像采集与分析

  1. 开启仪器设备（参见 特定试剂/设备表），并根据制造商的说明让其自行校准。
    注意：本实验使用了配备 40X 物镜（0.75 NA）的 INSPIRE 软件。所有报告的定量分析均采用 IDEAS 3.0 软件完成。
  2. 准备一系列采集窗口，并可将其保存为模板以供后续实验使用。绘制用于量化 RMS 梯度值的直方图。在基于 RMS 梯度直方图选定的“在焦平面”（"In Focus"）细胞群体基础上，在细胞面积（Area）直方图上圈定“单个细胞”（"Single cell"）群体。将微量离心管插入仪器后，调节激光功率，对单个细胞设门，并采集 5,000 个 T 淋巴细胞。
  3. 在 Ideas 软件中打开采集文件，创建一个直方图，显示每个单独细胞明场图像（通道 1）的梯度 RMS 值。在 RMS 梯度直方图上设门，选择 RMS 梯度值高于 57 的细胞。
    注意：RMS 梯度可用于确保分析中仅包含处于焦平面上的 T 淋巴细胞。我们通过实验经验确定，RMS 梯度值大于 57 的单个细胞位于焦平面内，可被准确识别。
  4. 在“分析/掩膜”（Analysis/Masks）菜单中，基于明场图像的形态学掩膜 M01 创建一个新的掩膜，命名为 Erode(M01,2)，即向内腐蚀 2 个像素。随后，在“分析/特征”（Analysis/Features）菜单中，基于 Erode(M01,2) 掩膜创建一个新的面积（Area）特征参数。对前一步设门所选的细胞，使用新创建的掩膜绘制细胞面积直方图。
    注意：默认提供的形态学掩膜通常远大于细胞实际尺寸，因此将其向内腐蚀 2 个像素可提高精度。
  5. 对单个 T 细胞设门，排除校准微珠、碎片（面积小）以及双联体（面积大）。每次采集时均需调整此门限。
    注意：细胞大小的变化会影响门限的位置。由于小鼠 T 细胞小于人类 T 细胞，而人类 T 细胞又小于 CEM 细胞，因此每种细胞类型的面积与其大小成正比。
  6. 针对前几步中已设门的单个在焦细胞，绘制一个散点图，横轴为 HLA-ABC 染色（通道 2）的原始最大像素值（Raw Max Pixel），纵轴为鬼笔环肽（phalloidin）染色（通道 4）的原始最大像素值。设门排除未染色或荧光饱和的事件。分别打开两个直方图，显示 HLA-ABC（通道 2）和鬼笔环肽（通道 4）染色的原始最大像素值。
  7. 在“分析/掩膜”（Analysis/Masks）菜单中，基于 HLA-ABC 染色细胞（通道 2）的形态学掩膜创建一个新掩膜，命名为 Erode(M02,2)，即向内腐蚀 2 个像素。随后，在“分析/特征”（Analysis/Features）菜单中，基于 Erode(M02,2) 掩膜创建一个新的特征参数——圆形度（Circularity）。
    注意：该参数用于衡量细胞形状偏离圆形的程度。因此，完全圆形的 T 细胞具有较高的圆形度值，而拉长或极化的细胞则表现出较低的圆形度指数。
  8. 随后，创建另一个直方图，显示前述设门细胞的圆形度特征值。利用该直方图可直接展示单个在焦细胞群体中每个细胞的圆形度分布情况。
  9. 观察未刺激细胞的直方图形状，绘制极化细胞的门限，从最低圆形度值开始，至大多数未刺激细胞所处的圆形度临界值为止。查看统计结果显示面板中门内细胞群体中极化细胞的百分比（%Gated）。
    注意：我们将圆形度指数低于 13 的细胞定义为极化细胞。
  10. 为观察细胞中鬼笔环肽染色的极化情况，绘制一个“亮细节相似性 R3”（Bright Detail Similarity R3）值的直方图，用于比较 HLA-ABC 染色（通道 2）与鬼笔环肽染色（通道 4）。
    注意：该特征值越大，表明两种染色的重叠程度越高。
  11. 采用与之前相同的设门策略，对未刺激细胞绘制显示染色分离情况的门限，以反映具有极化肌动蛋白染色的细胞百分比。
  12. 完成分析后，相应的统计面板将显示：表现出 MHC I 类分子与鬼笔环肽染色分布分离的细胞百分比、极化细胞百分比，以及所有细胞的圆形度和相似性指数的平均值 ± 标准差（SD）。

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结果

此处选择的第一个示例涉及使用CCL19刺激的人原代T淋巴细胞。然而，相同的策略也可用于小鼠原代T细胞、T细胞系或任何其他对趋化因子刺激有反应的细胞类型。此处展示的设门策略包括一系列窗口，用于选择目标事件，然后选择单个细胞。最后，以两个标志物为例，展示了荧光强度的范围：MHC I类分子HLA-ABC和丝状肌动蛋白，分别对应静息状态（图1）或CCL19刺激后的T淋巴细胞（图2）。

首先，在未处理的（图1）或经CCL19刺激的（图2）T淋巴细胞中测量圆形度指数。静息状态的细胞呈现一个主要的单一峰，且圆形度指数值较高，表明大多数细胞接近圆形。然而，CCL19刺激明显导致出现第二个圆形度指数较低的细胞亚群，该亚群包含已呈现极化形态的细胞。此外，当绘制HLA-ABC与F-肌动蛋白染色之间的亮细节相似性指数时，可以观察到部分细胞在CCL19处理后该指数值下降，表明这两个标记物的共定位程度降低。有趣的是，从此前展示的散点图中，可将光标置于任意一个数据点上，以查看对...

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讨论

本文介绍了一种利用成像流式细胞术这一前沿技术，快速且信息丰富的门控策略，用于分析趋化因子刺激所诱导的细胞和分子事件。通过单次实验，可获得两类主要信息：趋化因子刺激引起的细胞形态变化，以及极化过程中不同蛋白质的亚细胞分布情况。值得注意的是，该方法还可对大量细胞进行分析，从而实现统计学上的稳健性，并对整体细胞群中少量亚群进行有效分析。如已有报道所示，该技术还可用于分析免疫突触环境中的分子重分布事件12。此外，类似实验体系已应用于SDF1刺激的T细胞研究，但尚未提供两种标记物之间共定位程度的分析结果13。

尽管该技术因此适用于多种细胞类型，但贴壁细胞无法直接进行分析，且悬浮细胞在检测前需要固定。除了仪器本身的这些固有限制外，在刺激细胞时保持细胞处于37 °C也至关重要。温度对于实现适当的T细胞极化尤为关键，因为细胞骨架的改变（如驱动形态变化的肌动蛋白聚合）对温度高度依赖。我们使用Latrunculin A处理细胞的实验结果证实，趋化因子刺激所诱导的正常肌动蛋白重塑对于细胞达到完全极化状态确实至关重要。除了本文提供的该药物相关数据外，我们还利用转...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者非常感谢科钦影像平台的 Pierre Bourdoncle、Thomas Guilbert 和 Louise Rimbault。本工作由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、法国国家科学研究中心（CNRS）以及法国抗癌联盟（Ligue Nationale contre le Cancer，标牌团队）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMIGibco61870-010
人AB型血清PAAC11-021预热以灭活补体。
胎牛血清PAN BiotechP30-3300预热以灭活补体。
人T细胞核转染试剂盒LonzaVCA-1002
小鼠IL7Peprotech217-17
HBSSGibco14025-050使用前在37 °C水浴中预热。
HepesGibco15630-056
小鼠CCL19Peprotech250-27B分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。
人CCL19Peprotech300-29B分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。
人CXCL12Peprotech300-28A分装样品在加入趋化因子至细胞前需在冰上解冻。该趋化因子也可用于小鼠T细胞。
PFAElectron Microscopy Sciences157-8-100这是水中8%的PFA溶液。与2倍浓度的PBS按体积比1:1混合，可获得PBS中4%的PFA溶液。
BSASigmaA3059
皂苷Fluka84510
Alexa Fluor 594鬼笔环肽InvitrogenA12381
FITC标记的抗HLA-ABC抗体Beckman CoulterIM1838克隆号B9.12.1
抗P-ERM抗体Cell Signaling Technology3149P
ImageStreamx Mark IIAmnis

参考文献

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