自动化 ChIP-seq 实验以在 10,000 个 HeLa 细胞中生成表观遗传谱型

摘要

用于定位的方法 在体 蛋白质-DNA 相互作用对于基因组研究的各个方面正变得至关重要，但这类实验通常耗时、费力且成本高昂。本文介绍了一种市售的自动化液体处理系统，可实现染色质免疫沉淀的自动化操作，用于绘制 体内 使用有限数量的细胞研究蛋白质-DNA相互作用的方法被介绍。

摘要

染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）是研究蛋白质-DNA相互作用的首选技术。ChIP-seq已被广泛用于绘制蛋白质-DNA相互作用图谱以及定位组蛋白修饰。该实验流程繁琐且耗时，其主要局限之一是需要大量的起始材料，通常需数百万个细胞。当实验基于磁珠法进行时，染色质免疫沉淀的自动化成为可能。已有研究专门在一种 commercially available 的机器人液体处理系统上设计出成功的自动化染色质免疫沉淀及文库构建方案，该系统主要用于自动化表观遗传学检测。首先，已证实使用靶向多种组蛋白修饰的抗体进行自动化ChIP-seq检测的可行性，随后对该自动化流程进行了优化，使其能够从极低数量的细胞起始完成染色质免疫沉淀及文库构建。这些实验的目标是为未来特定细胞类型、细胞亚群以及活检样本的表观遗传学分析提供一种有价值的工具。

引言

随着下一代测序（NGS）技术的广泛应用和普及，全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的主要研究方法现已发展为染色质免疫沉淀联合NGS检测（ChIP-seq），该方法可用于发现转录因子结合位点或组蛋白修饰模式。ChIP-seq的优势在于能够提供全基因组的高通量数据，通过检测富集的DNA片段，实现对蛋白质-DNA相互作用的定性和定量分析。然而，标准ChIP-seq实验也存在一些局限性，例如难以获得足够的材料构建测序文库。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验分为六个基本步骤，包括：1）交联蛋白质-DNA结合区域；2）样品制备，包括细胞裂解及通过超声处理剪切染色质；3）免疫复合物的形成；4）免疫复合物的沉淀；5）免疫复合物的洗涤；以及6）富集物质的洗脱，并通过qPCR和NGS进行分析。

ChIP 实验的成功取决于三个主要因素：良好的染色质制备、原始样品中抗原的含量，以及抗体对其对应抗原的特异性和亲和力。一个主要的限制是需要大量的起始细胞数量，以获得足够的富集 DNA 用于构建测序文库。对于使用有限样品量进行研究的科研人员，例如活检样本或细胞亚群，ChIP-seq 实验极具挑战性。最近的研究表明，在起始细胞数量较少的情况下仍可进行 ChIP-seq 实验^{1, 2}。Diagenode 开发了一种可完全自动化 ChIP-seq 实验的机器人液体处理系统，适用于起始细胞数量有限的情况。

自动化相比手动制备ChIP-seq样品具有多种优势，可减少人为误差、降低实验变异性，并降低实验成本。已有研究报道了染色质免疫沉淀及文库构建的半自动化方案，但这些研究均未展示在使用少量细胞时的实验数据^{3, 4, 5, 6}。

本文介绍了一种完全自动化的实验流程，适用于染色质免疫沉淀和文库构建实验，该流程在基于磁珠技术的液体处理机器人系统中进行，可针对实验方案优化中的多个参数进行操作。在此，研究人员成功利用有限数量的细胞进行了自动化的ChIP-seq实验，旨在简化操作、实现标准化，并为研究小规模细胞群体中的表观遗传谱提供可靠的解决方案。本文所述的自动化ChIP方案使用特定的组蛋白抗体和试剂在HeLa细胞上进行了优化，但该流程可通过相应的实验优化，适配于其他细胞系和抗体。

方案

1. 标准 ChIP 实验

1. 细胞收集与DNA-蛋白质交联
   1. 将HeLa-S3细胞培养至80%-90%融合度。移除培养基，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿两次，向培养板中加入胰蛋白酶-EDTA（1×）。孵育最多2分钟，使细胞从培养皿上脱落。收集细胞，并用10 ml PBS洗涤两次。
      注意：孵育时间过长会导致细胞损伤。
   2. 在500 × g条件下离心细胞5分钟，用20 ml PBS重悬细胞。随后进行细胞计数。
   3. 在500 × g条件下于4 °C离心5分钟，弃去上清液，加入500 μl PBS。固定步骤的最佳细胞数量为每500 μl PBS中含1000万个细胞。
   4. 向每份500 μl细胞悬液中加入13.5 μl新鲜的37%甲醛。在室温下固定细胞8分钟。
   5. 加入57 μl 1.25 M甘氨酸溶液以终止固定反应。在室温下轻轻涡旋混合，持续孵育5分钟。自此步骤起，所有操作均需在冰上进行。
   6. 在4 °C、500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
   7. 用1 ml PBS洗涤细胞两次。小心弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。
2. 细胞裂解与染色质剪切
   1. 向细胞沉淀中加入10 ml预冷的裂解缓冲液iL1（最佳比例为每100万个细胞加入1 ml裂解缓冲液）。用移液器反复吹打数次，在4 °C轻柔混匀条件下孵育10分钟。
   2. 在4 °C、500 × g条件下离心裂解物5分钟，弃去上清液。
   3. 向裂解物中加入10 ml预冷的裂解缓冲液iL2，通过反复吹打轻轻混匀。在4 °C孵育裂解物10分钟。
   4. 在4 °C、500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
   5. 通过向iS1剪切缓冲液中加入200×蛋白酶抑制剂混合物（PIC）配制完整的剪切缓冲液。将缓冲液置于冰上5分钟，之后所有操作均在冰上进行。每1000万个细胞沉淀中加入1 ml完整的iS1剪切缓冲液，通过反复吹打轻轻混匀。超声处理前，将样品在冰上孵育10分钟以降低样品黏度。
   6. 使用水浴超声仪对300 µl染色质分装样品进行超声剪切，共进行2至3轮，每轮10个循环。每个循环包括在高功率设置下“开启”30秒、“关闭”30秒。或者，可使用Pico超声设备，以较短时间进行5至10个循环，每个循环同样为“开启”30秒、“关闭”30秒。每轮之间短暂涡旋并离心试管。若使用其他类型的超声仪，请遵循相应制造商关于染色质剪切的操作说明。
   7. 在16,000 × g条件下离心剪切后的染色质10分钟，收集上清液并立即用于免疫沉淀（IP）步骤。或者，可将染色质在-80 °C保存最多2个月以备后续使用。
   8. 在免疫沉淀步骤之前，使用1-1.5% TAE琼脂糖凝胶或生物分析仪检测染色质剪切效率。理想的染色质片段大小应在100-600 bp之间。

2. 少细胞量 ChIP 实验

1. 细胞收集与DNA-蛋白质交联
   1. 将HeLa-S3细胞培养至80%–90%融合度。移除培养基，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿两次，然后向培养板中加入1×胰蛋白酶-EDTA。孵育最多2分钟，使细胞从培养皿上脱落。
      注意：孵育时间过长会导致细胞损伤。
   2. 加入含血清的1 ml培养基至1 ml离心管中收集细胞。计数细胞。
   3. 在500 × g条件下离心5分钟。将细胞浓度调整为每毫升培养基含10,000个细胞，用于固定。
   4. 每管中加入27 μl新鲜配制的36.5%甲醛溶液进行固定。轻轻倒置管子2至3次，室温孵育10分钟。
   5. 向样品中加入115 μl 1.25 M甘氨酸溶液，倒置管子2至3次，室温孵育5分钟。此后所有操作均需在冰上进行。
   6. 在4 °C、300 × g条件下离心10分钟。缓慢弃去上清液。
   7. 用1 ml含蛋白酶抑制剂混合物（PIC，200×，终浓度1×）的冰浴HBSS洗涤细胞。倒置管子2至3次以重悬细胞，在4 °C、300 × g条件下离心10分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。
2. 细胞裂解与染色质剪切
   1. 每10,000个细胞加入25 μl完整裂解缓冲液tL1（裂解缓冲液tL1 + PIC），手动轻轻搅动管底以重悬细胞。冰上孵育5分钟。
   2. 向每份含10,000个细胞的样品中加入75 μl完整HBSS缓冲液（HBSS + PIC）。
   3. 对含10,000个细胞的100 μl样品进行超声剪切，共5组，每组5个循环。每个循环包括高功率设置下30秒“开启”和30秒“关闭”。或者，可使用微型超声设备，采用较短的超声时间，即5个循环，每个循环30秒“开启”、30秒“关闭”。最佳染色质片段大小应在100–600 bp之间。请注意，不同染色质制备条件、细胞类型及超声设备需分别优化剪切条件。
   4. 在14,000 × g条件下离心10分钟，去除不溶性物质，收集上清液并立即用于免疫沉淀（IP）步骤。或者，可将染色质在-80 °C保存最多2个月，以备后续使用。
   5. 在进行免疫沉淀前，使用1–1.5% TAE琼脂糖凝胶或生物分析仪检测染色质剪切效率。在琼脂糖凝胶分析前应对样品进行RNase处理，以更清晰地评估剪切效果。最佳染色质片段大小应在100–600 bp之间。

3. 染色质免疫沉淀与文库制备

1. 用于标准的自动化染色质免疫沉淀实验
   1. 向100 μl剪切后的染色质中加入120 μl ChIP缓冲液H（ChIP Buffer H + PIC）。取200 μl用于免疫沉淀，保留2 μl至20 μl作为输入样品。
   2. 在自动化仪器中选择自动ChIP 200 μl方案。该方案每轮可处理1至16个样本。
   3. 使用对应于100万至200万细胞的染色质，以及1-2 μg抗H3K79me3、-H3K27me3、-H3K4me3、-H3K4me2、-H3K9ac、-H3K9/14ac、-H3K36me3和H3K9me3的ChIP-seq级别兔多克隆抗体，运行自动化ChIP实验。最佳抗体用量因组蛋白修饰类型及相应抗体的亲和力与特异性而异。
      1. 使用等量的非免疫兔IgG作为同型对照抗体。或者，使用未包被的磁珠或特异性封闭的抗体作为ChIP对照。每个反应中加入20 μl蛋白A包被的磁珠。
   4. 使用自动化组蛋白ChIP-seq试剂盒试剂，采用抗H3K79me3和H3K4me2多克隆抗体进行自动化的ChIP实验。使用理想的ChIP-seq试剂盒试剂，采用抗H3K27me3、H3K4me3、H3K9ac、H3K9/14ac、H3K36me3和H3K9me3抗体进行ChIP实验。
   5. 根据自动化设备中内置软件的指示选择自动化的ChIP程序。将ChIP实验参数设置为：抗体包被步骤4小时，免疫沉淀步骤15小时。逆转交联步骤在自动化仪器中于65 °C进行，持续4小时。
   6. 在自动化系统上纯化逆转交联的DNA。选择基于磁珠法DNA纯化的自动程序或试剂盒进行DNA纯化。用25 μl水洗脱DNA。
   7. 通过提取免疫沉淀DNA的10%来定量。免疫沉淀DNA的得率取决于染色质和抗体的质量、细胞类型以及目标组蛋白修饰。根据制造商说明书，使用试剂盒对DNA进行定量。
   8. 使用针对至少1个阳性对照和1个阴性对照基因组区域的引物，通过定量PCR分析免疫沉淀DNA的质量。检测ChIP富集度时，所用免疫沉淀DNA总量不得超过10%。
      1. 配制qPCR反应体系。每反应加入10 μl 2x SyberGreen qPCR预混液、1 μl引物混合液、1–5 μl免疫沉淀DNA或输入DNA，并用无菌水补足至终体积20 µl。qPCR程序包括初始变性步骤：95 °C下5–10分钟（具体时间根据Taq DNA聚合酶供应商建议确定），退火温度应根据所选引物进行设定。
   9. 使用与市售Illumina ChIP-seq文库制备试剂兼容的自动化文库构建方案，分别利用ChIP DNA以及来自同一染色质样品的保存输入DNA（input DNA）构建文库。每种抗体的免疫沉淀DNA取10–20 ng用于文库制备。每次运行最多可制备16个自动化文库。
   10. 根据Illumina制造商的说明对文库进行测序并生成簇。进行初级生物信息学分析（簇过滤、碱基识别， 等等。）按照标准的Illumina流程，使用ELAND比对程序将测序读段过滤并比对至最新的人类基因组组装版本（当前为GRCh38）。使用SICER⁷ 或 MACS⁸ 用于峰区识别，并使用Homer对峰区进行下游分析⁹，BEDTools¹⁰ 或首选软件。
2. 适用于低细胞数量的自动化ChIP实验
   1. 向100 μl剪切后的染色质中加入120 μl完全ChIP缓冲液tC1（ChIP缓冲液tC1 + PIC）。取200 μl用于免疫沉淀，保留20 μl作为输入样本。
   2. 在自动化系统中选择自动ChIP 200 μl方案。该方案每轮可处理1至16个样本。
   3. 使用经优化适用于低量染色质的自动化ChIP-seq试剂和ChIP级抗体，运行自动化的ChIP-seq实验。实验中使用相当于10,000个细胞和100,000个细胞的染色质，分别加入0.5 μg抗H3K27me3、0.25 μg抗H3K4me3、0.1 μg抗H3K27ac、0.25 μg抗H3K9me3兔源Premium ChIP-seq级兔多克隆抗体。最佳抗体用量因组蛋白修饰类型以及相应抗体的亲和力和特异性而异。
      1. 使用等量的非免疫兔IgG作为同型对照抗体。或者，使用未包被的磁珠或特异性封闭的抗体作为ChIP对照。每个反应中加入10 μl蛋白A包被的磁珠。
   4. 根据自动化设备中预设的软件指令选择自动化的ChIP实验程序。将ChIP实验参数设置为：抗体包被步骤4小时，免疫沉淀步骤15小时。逆转交联步骤在自动化仪器中于65 °C进行，持续4小时。
   5. 使用离心柱按照制造商说明书纯化反向交联的DNA，并用6 μl至25 μl的水洗脱。
   6. 使用商业试剂盒定量DNA。利用针对阳性和阴性对照区域的引物，通过qPCR分析结果，以评估ChIP质量。
   7. 使用经过优化的文库制备试剂盒，对低浓度DNA样本进行文库构建。文库制备时分别使用30 pg和300 pg的ChIP DNA（分别对应10,000和100,000个细胞的实验）。采用与文库制备试剂兼容的自动化流程进行文库构建。自动化文库制备通量为每轮运行可处理1至48个文库。
   8. 在双链DNA模板末端修复后，连接含有测序引物位点的可切割茎环接头。在DNA延伸步骤之后，采用文库构建试剂盒说明书所述的高保真扩增方法对样本进行扩增。
   9. 文库扩增后，根据文库构建试剂盒的说明书对文库进行定量和纯化。注意：纯化后的片段大小选择并非必需步骤。
   10. 根据制造商的说明对文库进行测序并生成簇。执行初级生物信息学分析（簇过滤、碱基识别， 等等。按照标准的制造商流程，使用ELAND将测序读段过滤并比对至最新的人类基因组组装版本（当前为GRCh38）⁷ 校准器。使用 SICER⁸ 或 MACS⁹ 用于峰区识别，并使用 Homer 和 BEDTools 对峰区进行下游分析¹⁰或任何其他首选软件。

图1. 软件截图，展示如何在 IP-Star Compact 系统中设置自动化的 ChIP 实验。 该软件提供了灵活的选择，可根据研究人员的需求设定每次运行的样本数量，并调整关键实验参数（抗体包被、免疫沉淀及洗涤步骤）。自动化程序支持并行测试不同条件。即同一次实验中，不同类型的抗体、不同数量的抗体、不同类型的细胞、不同数量的细胞，甚至不同类型的磁珠及不同数量的磁珠。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2. 软件界面截图，展示如何在自动化系统中使用文库试剂盒设置下一代测序的自动化文库制备流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

优化针对八种不同组蛋白标记物的自动化 ChIP-seq 实验

为了成功开发并验证自动化ChIP实验方案，本研究选用了此前已在手动ChIP-Seq实验中验证过的ChIP-seq级别抗体（数据未显示）。本研究所选用的ChIP-seq级别抗体包括：anti-H3K79me3、-H3K27me3、-H3K4me3、-H3K4me2、-H3K9ac、-H3K9/14ac、-H3K36me3 和 -H3K9me3。所有ChIP-seq级别抗体的特异性此前均已通过点印迹（dot blot）、肽段阵列（peptide arrays）和Western Blot实验确认（数据未显示）。通过使用不同抗体用量进行预实验ChIP-qPCR，以确定抗体的灵敏度（图3）。qPCR分析至少包含两个阳性对照靶点和两个阴性对照靶点，只有当阳性靶点相对于阴性靶点的富集倍数超过五倍时，方可进行测序实验。进行ChIP和ChIP-seq实验时，必须确保染色质剪切的质量。本出版物中展示的所有ChIP实验均使用新鲜制备的染色质进行。也可将固定后的细胞在-80 °C下冷冻保存，并于另一天继续进行染色质提取与剪切。然而，由冷冻固定细胞制备的染色质可能与新鲜制备的染色质行为不同，因此每次染色质制备可能需要优化超声处理条件。在处理不同细胞类型时，可使用含有不同去垢剂成分（SDS）的剪切缓冲液。例如，原代细胞系或悬浮培养细胞属于较难剪切的细胞类型，需要较高浓度的SDS（1%）；而HeLa等易于剪切的细胞系则仅需较低浓度的SDS（0.1%）即可满足剪切需求。

图 3. 使用自动化系统验证适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的抗体。 针对不同的组蛋白修饰，在100万个HeLa-S3细胞来源的剪切染色质上分别使用抗H3K79me3、-H3K27me3、-H3K4me3、-H3K4me2、-H3K9ac、H3K9/14ac、-H3K36me3和-H3K9me3兔多克隆抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验。抗体滴定实验采用自动化仪器中工作体积为200 µl的自动ChIP方案。每个ChIP实验测试了1、2、5和10 μg的抗体用量，每个实验均以2 μg IgG作为阴性对照。通过qPCR评估富集程度。结果以输入量的百分比（qPCR分析后，免疫沉淀DNA相对于输入DNA的相对含量）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

在验证并确定自动化系统中ChIP级抗体的最佳使用量后，进行了自动化的ChIP-seq实验，以生成每种组蛋白修饰的测序谱图（图4）。

图 4. 由自动化 ChIP-seq 实验生成的组蛋白 ChIP-seq 谱图。 该图展示了 H3K4me3、H3K9ac、H3K9/14ac、H3K4me2、H3K79me3 和 H3K36me3 在不同基因组区域的 ChIP-seq 谱图。4A 显示了沿整条 X 染色体的峰分布，4B 显示了 GAPDH 基因周围 75 kb 区域的分布情况。4C 显示了 MYT1 基因周围 500 kb 区域内 H3K27me3、H3K36me3 和 H3K4me3 的谱图，4D 显示了 ZNF12 基因周围 200 kb 区域内 H3K9me3 的分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。

生成了与基因表达相关的六种不同组蛋白修饰的组蛋白表观遗传谱（H3K4me3、H3K9ac、H3K9/14ac、H3K4me2、H3K79me3 和 H3K36me3）。图4A展示了不同组蛋白标记沿X染色体的ChIP-seq谱图。六种不同组蛋白谱图之间观察到的高度峰相关性表明，该自动化系统能够生成准确且可靠的数据。图4B、图4C和图4D展示了不同组蛋白修饰在特定基因组区域的峰分布情况。

低至 200 个细胞的自动化染色质免疫沉淀实验

染色质免疫沉淀（ChIP）实验可使用的最低细胞数量取决于染色质的质量、抗体的特异性和灵敏度，以及所研究的组蛋白修饰或蛋白质的丰度。在样本量有限的情况下，选择高质量的ChIP-seq级别抗体至关重要，而选择最佳试剂和不同的载体可提高DNA回收效率，有助于ChIP实验的成功。为了确定自动化ChIP流程可处理的最低细胞数量，使用专为低量染色质优化的ChIP试剂，在IP-Star自动化系统中测试了不同数量的染色质、抗体和磁珠。

首先，按照方案所述对10,000个细胞的染色质进行超声处理。染色质免疫沉淀（ChIP）结果通过qPCR验证（图5A），结果显示H3K4me3抗体在阳性对照区域有显著富集，而在阴性对照区域信号可忽略不计。为进行比较并证明结果的一致性，还提供了使用10,000个细胞、H3K27ac、H3K9me3和H3K27me3抗体获得的额外数据。

随后进行了自动化的染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以验证该自动化系统在使用相同H3K4me3抗体的情况下，能够有效处理少量细胞的能力。自动化ChIP实验结果良好，连续进行的十次免疫沉淀（IP）反应显示出良好的可重复性，并且与手动ChIP实验结果高度一致（图5B）。通过开展手动与自动化实验，发现自动化方案的优势在于可显著降低实验间的变异性（图5C）。

图 5. 在 10,000 个细胞上优化 ChIP 和自动 ChIP 实验 对 10,000 个细胞进行手动 ChIP 实验，分别使用 0.25 μg H3K4me3、0.1 μg H3K27ac、0.5 μg H3K9me3 和 0.25 μg H3K27me3 抗体。使用相同数量的兔 IgG 作为对照。qPCR 使用针对每个 ChIP 实验的两个阳性位点和两个阴性位点的引物进行。图 5A 显示回收率，以输入量的百分比表示（qPCR 分析后，免疫沉淀 DNA 相对于输入 DNA 的相对量）。图 5B 显示在 IP-Star Compact 仪器上运行的 10 次 ChIP 反应，使用 0.25 μg H3K4me3 多克隆抗体和 0.25 μg 兔 IgG 作为阴性对照抗体。随后使用针对阳性位点 EIF4A2 启动子和 GAPDH TSS 以及阴性位点肌红蛋白外显子2（Myoglobin exon2）和 Sat2 的引物进行 qPCR 分析。该图显示回收率，以输入量的百分比表示（qPCR 分析后，免疫沉淀 DNA 相对于输入 DNA 的相对量）。图 5C 显示 10 次手动 ChIP 实验与 10 次自动 ChIP 实验的 H3K4me3 ChIP 数据比较。误差线代表十次重复实验的标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

为了了解自动化ChIP方案的灵敏度，实验中使用的细胞数量从每IP 100,000个细胞逐步减少至200个细胞。实验采用抗H3K27me3抗体，因为这是一种非常常见的组蛋白修饰。使用其他组蛋白或非组蛋白抗体时，所需细胞数量可能更多或更少，具体取决于表位的丰度及抗体的质量。实验通过定量PCR进行验证，结果表明，通过减少实验中的磁珠和抗体用量，可降低背景信号，从而在低至200个细胞的情况下仍能获得成功的ChIP-qPCR结果（图6）。

图6. 在200个细胞上进行的自动化ChIP实验。使用Hela-S3细胞及靶向H3K27me3的抗体。染色质来源于100万个细胞，每个ChIP反应使用该染色质的系列稀释样本（相当于10万至200个细胞）。在10万个细胞的实验中使用1 µg H3K27me3和10 μl蛋白A包被的磁珠；在1万和1千个细胞的实验中使用0.5 µg H3K27me3和10 µl磁珠；在500和200个细胞的实验中使用0.25 µg H3K27me3和5 µl磁珠。在分别进行10万个细胞和1千个细胞的实验时，使用1 µg和0.5 µg兔IgG作为阴性对照抗体。6A 显示TSH2B和GAPDH基因在输入样本中的占位百分比。6B 显示TSH2B相对于阴性对照基因组区域GAPDH的相对占位情况。

基于10,000个细胞的ChIP-seq结果的下游分析

为了评估起始细胞数量较少时自动化ChIP-seq实验的整体质量，使用10,000个HeLa细胞和0.25 µg的H3K4me3抗体进行了自动化ChIP-seq检测，同时以100,000个HeLa-S3细胞的ChIP实验作为该实验的阳性对照。自动化文库的构建采用适用于低量DNA样本的MicroPlex文库构建试剂盒。需要注意的是，尽管使用少于10,000个细胞仍可成功完成自动化ChIP实验，但所获得的DNA量不足以使用该试剂盒构建文库。簇生成和测序均按照制造商的说明进行。测序后的生物信息学分析显示，低细胞数量的ChIP样本获得了出色的结果。30 pg数据集（对应起始材料为10,000个细胞）背景噪声低，富集峰高度可靠，且该结果通过300 pg数据集（对应起始材料为100,000个细胞）以及由Broad研究所为ENCODE项目生成的H3K4me3数据集（作为外部参考）得到验证。值得注意的是Top 40重叠率数据，这是ENCODE¹¹项目中使用的一种标准方法：当比较两个数据集时，若按显著性评分排序后前40%的峰中至少有80%重叠，则认为ChIP-seq结果具有可重复性。30 pg数据集在与300 pg数据集（考虑其全部峰，而不仅是前40%）以及Broad研究所数据进行比较时均满足该标准（表1）。300 pg数据集与Broad研究所数据的峰几乎完全一致，Top 40重叠率达到98%（图7）。

图7. 在10,000个细胞上进行的ChIP实验与文库构建 使用H3K4me3抗体（0.25 µg/µl）在10,000和100,000个HeLa-S3细胞上进行了ChIP-seq实验。将35 bp的标签通过ELAND比对工具映射到人类基因组。在后续的峰识别分析中，SICER能够可靠地从少量细胞以及数百万细胞中识别出富集区域。这些数据集相互之间进行了分析和比较，并与Broad研究所生成的参考数据进行了比对。低细胞数量样本结果一致，且具有很高的相似性。30 pg样本满足ENCODE标准¹¹（前40%最强峰中至少有80%应相互重叠）。请点击此处查看该图的放大版本。

表 1.

讨论

染色质免疫沉淀结合测序现已成为一项标准实验流程。本文介绍了一种自动化 ChIP-seq 方案，仅需 10,000 个起始细胞即可生成染色质表观遗传学图谱。

自动化ChIP及文库制备实验可实现ChIP优化流程的标准化，并降低实验变异性。本文介绍的液体处理系统消除了与ChIP相关的大量手动操作，将实际操作时间缩短至仅30分钟，最大限度减少样品损失，并仅需数皮克的文库投入量即可实现精确的ChIP-seq。为了成功开展自动化的ChIP-seq实验，每次实验中使用高质量的剪切染色质样品以及适用于ChIP-seq级别的抗体也至关重要。该系统采用基于磁珠的技术，具有灵活性，可调整主要实验参数，例如抗体包被和免疫沉淀步骤的孵育时间，或洗涤条件的修改，使研究人员能够完成ChIP-seq优化所需的所有必要实验。该自动化系统是一个“开放”平台，允许并行比较多种试剂，以针对每种特定细胞系和抗体优化实验条件，同时能够直接比较不同类型和浓度的染色质、不同抗体，甚至不同类型的磁珠。

自动化系统的一个局限性在于需要将所有实验方案的体积范围在5 μl至200 μl之间实现自动化。然而，该自动化平台的实验微型化也有助于节省试剂成本。

除了本研究中描述的实验方案外，该系统还具有适应性，可自动化完成多种其他基于磁珠的应用，如免疫沉淀、甲基化DNA的捕获（MeDIP和MethylCap技术）、羟甲基化DNA的免疫沉淀（hMEDIP）、连续染色质免疫沉淀（ReChIP）、RNA免疫沉淀（RNA-IP）、亚硫酸氢盐转化以及DNA纯化检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Life technologies	14190-094
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T3924-100ML
甲醛 37%	Sigma	F8775-25
1.25 M 甘氨酸溶液	Diagenode	C01020010	理想 ChIP-seq 试剂盒的组分
裂解缓冲液 iL1	Diagenode	C01020010	理想 ChIP-seq 试剂盒的组分
解缓冲液 iL2	Diagenode	C01020010	理想 ChIP-seq 试剂盒的组分
剪切缓冲液 iS1	Diagenode	C01020010	理想 ChIP-seq 试剂盒的组分
蛋白酶抑制剂混合物 （200x）	Diagenode	C01010130	Auto True Micro ChIP 试剂盒的组分
HBSS（无钙、无镁、无酚红）	Life technologies	14175-053
裂解缓冲液 tL1	Diagenode	C01010130	自动真实微 ChIP 试剂盒的组分
ChIP 缓冲液 tC1	Diagenode	C01010130	自动真实微 ChIP 试剂盒的组分
理想的 ChIP-seq 试剂盒	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	自动组蛋白 ChIP-seq 试剂盒的组
分 自动组蛋白 ChIP-seq 试剂盒	Diagenode	C01010020
全自动 True Micro ChIP 试剂盒	Diagenode	C01010130
H3K79me3 多克隆抗体-Classic	Diagenode	C15310068
H3K27me3 多克隆抗体-Classic	Diagenode	C15410069
H3K4me3 多克隆抗体-Classic	Diagenode	C15410030
H3K4me2 多克隆抗体-Classic	Diagenode	C15410035
H3K9ac 多克隆抗体-Premium	Diagenode	C15410004
H3K9/14ac 多克隆抗体-Premium	Diagenode	C15410200
H3K36me3 多克隆抗体-Premium	Diagenode	C15410058
H3K9me3 多克隆抗体-Premium	Diagenode	C15410193
兔 IgG	Diagenode	C15410206
蛋白 A 包被的顺磁珠	Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
MicroChIP DiaPure 色谱柱	Diagenode	C03040001
通用 SyberGreenMaster 混合物 1.25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Illumina 样品制备试剂盒，来自基因组 DNA	Illumina	FC-121-3001
Illumina True-seq 试剂盒 ChIP 文库制备试剂盒	Illumina	IP-202-1012
MicroPlex 文库制备试剂盒	Diagenode	C05010010
Agencourt AMPure XP 珠子	Beckman Coulter	A63881
Illumina 文库制备定量试剂盒	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star 紧凑型 自动化系统	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit 系统	Invitrogen	Q32857
Illumina Hiseq 系统	Illumina