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亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

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DOI：

10.3791/52155

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2015年1月8日

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1Department of Biochemistry, University of Leicester, 2Center for Fisheries, Environment and Aquaculture Sciences, 3ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

基因靶向技术可用于产生带有基因敲除、基因敲入和标记等位基因的转基因小鼠。本文中，我们描述了一种在大肠杆菌（E. coli）中进行重组工程的改进方法，我们称之为“亚克隆加插入”法，该方法可用于快速构建定制的基因靶向载体。

摘要

基因靶向是指利用同源重组对特定基因位点进行精确修饰的技术。采用该方法构建新的细胞系和转基因小鼠模型，需要构建一种“靶向”载体，该载体包含与目标基因同源的DNA序列，而这一载体构建步骤多年来一直是该过程中的限制性环节。载体构建可通过一种称为重组工程（recombineering）的技术在Escherichia coli细胞内in vivo完成，该技术利用噬菌体重组酶介导的同源重组实现。重组工程是亚克隆长同源序列（>4 kb）以及多种靶向元件（包括筛选标记）的首选方法，这些元件对于靶向载体与其对应基因组位点之间高效发生等位交换至关重要。典型的重组工程操作流程采用逐步迭代的方式，依次整合靶向元件，并需要中间的纯化和转化步骤。本文中，我们介绍一种基于多重策略的新型重组工程载体构建方法。该方法通过同时从小鼠细菌人工染色体（BAC）文库中捕获基因组序列，并插入双细菌和哺乳动物筛选标记，实现质粒缺口修复。这种亚克隆加插入的方法效率极高，获得的重组子中大部分均为正确重组产物。我们展示了利用该方法构建的不同类型的条件性基因敲除或基因敲入载体，以及BAC报告载体的实验数据。SPI载体构建方法极大地拓展了重组工程工具箱的应用范围，为构建这些高度复杂的载体提供了一种简便、快速且成本效益高的方法。

引言

基因靶向技术的发展使得构建细胞系和小鼠模型以研究不同的生物系统成为可能1-3。对基因组序列进行修饰的关键第一步是设计和构建基因靶向载体4。靶向载体是质粒结构，携带含有预期修饰的目标等位基因，该等位基因两侧包含选择标记（例如 neomycin）以及在哺乳动物细胞中实现高效同源重组所需的长基因组区域5。通过将靶向载体导入胚胎干细胞（ES细胞）6或体细胞7，可实现精确的基因修饰，此时靶向载体上的DNA序列与基因组位点之间的同源序列发生同源重组，从而通过基因转换将预期的修饰转移至基因组中8。这些经过修饰的ES细胞可被注射到小鼠囊胚中，产生嵌合体后代，后者可通过生殖系传递这些修饰后的等位基因9。另一种制备转基因小鼠的方法是将基因表达载体显微注射至单细胞小鼠受精卵中，导致载体随机整合到小鼠基因组中10。传统的载体构建方法依赖于使用限制性内切酶和DNA连接酶进行常规的“切割-粘贴”克隆，以将不同的选择标记和基因组片段克隆至载体骨架中。然而，传统克隆方法的一个固有局限性在于限制性酶切位点的位置和选择，尤其是在处理较长的DNA序列时。这通常需要进行多次亚克隆步骤，并且会向载体中引入额外的DNA序列，往往导致基因靶向效率降低。

重组工程（recombinogenic engineering）是一种DNA工程技术，通过利用噬菌体重组蛋白在E. coli细胞中介导的同源重组（HR）来克服上述限制11,12。由于同源序列的任何区域均可作为重组工程的底物，因此不再受限于限制性酶切位点的可用性。大段DNA序列可直接在体内无缝修饰，从而保持其结构完整性13。重组工程在短同源序列（50 bp）条件下效率很高14，因此同源臂（HA）可方便地整合到合成寡核苷酸序列中。在典型的重组工程实验中，将含有同源臂的寡核苷酸或双链DNA（dsDNA）片段通过电穿孔导入含有目标序列（位于染色体或质粒上）的重组工程感受态E. coli细胞中15。重组能力来源于噬菌体Red重组蛋白的可诱导表达16,17，或来源于rac前噬菌体的RecET蛋白18。Red/RecE外切核酸酶将线性dsDNA转化为单链DNA（ssDNA）中间体，随后由其伴侣蛋白Red/RecT（一种单链退火蛋白，SSAP）结合19。长ssDNA或短寡核苷酸与其复制叉滞后链上的互补靶序列退火，导致该序列整合至靶位点。滞后链ssDNA的重组是重组工程高效率的基础，可用“beta”重组模型加以描述20,21。

典型的基因靶向载体构建重组工程工作流程包含以下两种途径之一。一种途径是从小鼠BAC克隆中亚克隆目标基因组区域至质粒，随后依次插入LoxP重组位点、筛选标记22 等等，或者替代途径是通过多轮重组工程，利用不同的靶向载体元件靶向BAC基因组位点10,23 然后通过缺口修复克隆将修饰后的基因座亚克隆至质粒中24,25该方法的不同变体已被用于不同的高通量重组工程流水线中，作为大规模小鼠生产项目的一部分26,27然而，这些过程涉及复杂且耗时的步骤，需要使用专门的载体和 E. coli 菌株（例如， 表达Cre的细胞）并利用一个或多个中间步骤进行质粒DNA纯化和重新转化（表1）。亚克隆加插入（SPI）是一种新型的重组工程技术，将β重组与缺口修复克隆结合于单一过程之中（图1）。SPI载体组装简单、快速且灵活，相较于标准的重组工程方法具有显著改进表1在此，我们展示了使用SPI进行不同载体构建应用的简便性和实用性，尤其侧重于构建非标准且具有挑战性的载体设计。测试案例包括荧光报告基因敲入载体、双标签蛋白表达敲入载体、BAC荧光报告载体以及条件性基因敲除载体的构建。这些案例分别涉及细胞表面受体的定位、核蛋白复合物的纯化以及基因表达的条件性缺失等需求。

方案

1. 基因靶向设计

  1. 订购覆盖目标基因组区域的合适BAC克隆，并确保其与拟进行修饰的ES细胞类型具有同源性。 例如， 用于C57BL/6 ES细胞基因靶向的RPCI-23和RPCI-24 BAC克隆
  2. 设计靶向载体时，应遵循常规的基因靶向设计原则。关键参数包括：明确修饰是否需要组成型或条件型，确定基因敲除策略中需删除的关键外显子（CE），以及内含子中插入盒的间距与位置安排。
    注：上述各项已在其他地方进行了详细讨论10.
  3. 选择目标修饰位点上下游各5-6 kb的基因组区域。
    注意：亚克隆插入片段的大小通常为10–12 kb，但在使用p15A、pBR322等低拷贝亚克隆质粒时，上限可达80 kb，使用BAC载体时可高达200 kb。

2. 多重重组工程寡核苷酸

  1. 为质粒骨架（亚克隆质粒）和筛选标记（插入盒）设计引物。每条引物应包含180 bp的同源臂（HA），其侧翼为基因组靶位点，并包含20 bp的插入盒或亚克隆质粒特异性引物序列（图2）。
    注意：同源臂中不应包含任何重复元件，重复元件的存在将导致错误的靶向和亚克隆。可使用基于网络的工具（如“Repeat Masker”）检测重复元件。
  2. 在其中一个载体引物上引入一个独特的限制性内切酶（RE）位点，用于线性化基因靶向载体，以便进行胚胎干细胞（ES细胞）靶向（图2）。
  3. 使用引物分析程序检查引物参数。注意避免引物区域形成二级结构。
  4. 插入盒的较短同源臂（50 bp）可被接受，但重组子数量较低；需确保亚克隆质粒的同源臂始终较长（180 bp）。
  5. 使用基于网络的工具（如“cloneDB”）确定特定BAC克隆中基因组DNA插入片段的方向。通过查看BAC文库构建中所用BAC质粒骨架图谱，确定OriS处的复制方向。
    注意：对于所有常用BAC质粒，OriS通常与氯霉素（Chl）抗性标记的转录方向相反。
  6. 在BAC克隆复制方向相反一侧的引物5’端添加两个末端硫代磷酸酯（PTO）键。在反向引物上添加5’磷酸化修饰（图2）。
    注意：不对称硫代磷酸化的PCR盒经Red系统消化后可生成单链DNA（ssDNA）中间体，该中间体可启动复制叉的滞后链引物合成。
    注意：保护滞后链的盒式结构可观察到最高的多重重组频率。在某些基因座，保护前导链或双链均受保护的盒式结构可能无法产生同等的重组效率。
  7. 订购经PAGE或HPLC纯化的引物。

3. 使用 pSC101 BADgbaA 重组质粒转化 BAC 克隆。

  1. 为了制备 E. coli 携带BAC重组熟练的菌株，用含有Red基因的pSC101 BADgbaA质粒进行转化16.
    注意：pSC101 BADgbaA 质粒包含受阿拉伯糖诱导型启动子调控的 Red 和 RecA 基因 araC-PBAD 启动子、四环素筛选标记和温度敏感型pSC101复制子。
    1. 用无菌移液器吸头刺入BAC琼脂培养基，接种至5.0 ml含12.5 μg/ml氨苄青霉素的pH 8.0溶菌肉汤（LB）中-1 Chl。37 °C 培养 5 小时 以200 rpm振荡。
    2. 冷却10%（v/v) 甘油溶液、微量离心管和电穿孔比色皿置于冰上。将制冷大容量离心机和微量离心机预冷至 4 °C .
    3. 使用分光光度计测定培养物的光密度（OD），在600 nm处测量吸光度。当OD达到指定值时，制备电转感受态细胞（如下所述）。600 读数达到 0.3 至 0.8 时。
    4. 在大型离心机中，将细胞于50 ml离心管内以1,216 x g离心 4 °C下，5分钟，1000 × g离心 .
    5. 用1 ml预冷的10%甘油洗涤细胞，于17,949 x g离心沉淀细胞 4 °C下，20秒内离心g 总共进行3次洗涤步骤。
    6. 将细胞重悬于50 μl含10%甘油的溶液中，并加入10–200 ng pSC101 BADgbaA重组工程质粒。用移液器反复吹打数次以获得单细胞悬液，随后将细胞转移至预冷的1 mm间隙电穿孔比色皿中。
    7. 以1.8 kV、25 μF和200 Ω的参数对细胞进行电穿孔。
      注意：请检查每种品牌电穿孔仪的正确设置。电穿孔的时间常数若小于4，表明存在盐类及其他杂质。
    8. 立即用1 ml LB培养基重悬细胞，并将细胞转移至50 ml离心管中。
    9. 在30 °C下培养BAC gbaA菌液2小时 以200 rpm振荡。
      注意：当细胞在 37 °C 下培养时，由于温度敏感型复制因子 RepE 失活，pSC101 BADgbaA 质粒会丢失。为维持重组功能，应于 30 °C 培养 gbaA 细胞。
    10. 加入9 ml含有12.5 μg/ml-1 叶绿素和 4 μg/ml-1 向回收的 BAC gbaA 培养物中加入四环素（Tet）。将 BAC gbaA 培养物过夜培养 30时 200 rpm 振荡培养，温度为 °C。
      注意：电穿孔转染超螺旋 gbaA 质粒的转化效率足够高，可支持过夜饱和培养 在液体培养基中。

4. 插入盒的制备与亚克隆质粒

  1. 为了将HA插入到插入盒和亚克隆质粒中，使用下述长链修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应（PCR）。
    1. 可选：为防止质粒带入重组反应，可使用具有R6K复制起点或类似窄宿主范围的质粒模板来扩增插入片段。
    2. 或者，使用限制性内切酶（RE）消化将质粒模板线性化（表2）。选择一种在PCR扩增区域之外进行切割且可热失活的限制性内切酶（RE）。按照制造商的建议对该限制性内切酶进行热失活处理。
    3. 使用高保真热启动DNA聚合酶系统进行聚合酶链式反应（PCR）。按照以下说明配制PCR主混合液：表3）。按照所示条件进行热循环（表3).
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。上样1-5 μl 将每份PCR产物上样至含0.5 mg/ml溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶中-1 溴化乙锭 (EtBR)
    注意：非特异性扩增产物的存在不会干扰重组工程反应。但在某些情况下，引物二聚体可能会降低重组工程效率。
  3. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
    1. 可选：用 DpnI 处理以去除 PCR 产物中的质粒模板，随后进行 PCR 纯化。按制造商建议，用最小体积的无菌去离子水洗脱 DNA。
      注意：将 DpnI 加入未纯化的 PCR 反应体系会导致甲基化质粒 DNA 模板的切割效率降低。
  4. 通过与已知DNA标准品进行琼脂糖凝胶分析，定量PCR扩增的DNA 例如，λ HindIII 消化或使用 Nanodrop 分光光度计。

5. 亚克隆加插入

  1. 将过夜培养的 gbaA BAC 菌液稀释 50 倍，加入 200 μl 在10 ml LB+Chl+Tet中培养，30℃培养 200 rpm 振荡，°C 1小时50分钟。包括一个用作阴性对照的样本。
  2. 将所有重组工程材料和设备冷却至 4 °C，具体操作如步骤 3.1.2 所述。
  3. 倒入含有适当选择性抗生素的 LB 琼脂 pH 8 平板，抗生素浓度需正确，以确保既能筛选插入的 DNA 片段，又能筛选亚克隆载体表4).
    注意：某些抗生素对 pH 敏感。通常使用 pH 8 的 LB 琼脂。
  4. 配制10% (w/v)的L-阿拉伯糖溶液，使用0.2 μm针头滤器过滤除菌。
    注意：阿拉伯糖可诱导来自 gbaA 质粒的重组工程蛋白的表达。
  5. 使用分光光度计检测gbaA BAC菌液的OD值。当OD值达到指定数值时600 当达到 0.25–0.3 时，按照下一步所述诱导重组蛋白表达。
  6. 加入 200 μl 向10 ml BAC培养物中加入10%阿拉伯糖溶液，使阿拉伯糖的终浓度为0.2%。设置未诱导培养物（不加阿拉伯糖）作为阴性对照。
  7. 将BAC菌液转移至37 在37°C摇床培养箱中，以230 rpm转速振荡培养45分钟，诱导Red蛋白表达。
    注意：在 30 °C 下，红色蛋白的表达效率较低 .
  8. 离心收集细胞，并按照步骤3.1.5所述，用10%甘油洗涤3次。
  9. 向重组反应中加入600-1,000 ng的亚克隆质粒和插入盒（插入片段）各一份。设置仅含载体以及载体加单个插入片段的对照，以检测载体和插入盒的重组效率及完整性。
  10. 通过移液吹打获得单细胞悬液。按照步骤3.1.7所述进行电穿孔，并在37 °C下于1 ml LB培养基中复苏1小时（适用于多拷贝质粒），或在37 °C下于10 ml LB培养基中复苏3小时 用于BAC载体。
  11. 接种不同稀释度的回收培养物 例如， 90%、10%、1% 的双选琼脂平板上，于 37 ℃ 培养 °C 下孵育 16 小时。

6. 重组子分析

  1. 可选：挑取6至12个菌落，使用HA侧翼引物和插入片段特异性引物进行菌落PCR。设置亚克隆质粒、插入片段表达盒质粒以及亲本BAC克隆作为阴性对照。
    1. 对菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。通过观察是否出现预期大小的明亮条带，鉴定阳性克隆。
      注：SPI克隆技术具有高效率，通常可获得大多数正确的重组子。
  2. 将菌落接种至5 ml pH 8的LB培养基中（含选择性抗生素），在37 °C下过夜培养 。 
  3. 按照制造商说明书，使用柱纯化试剂盒制备质粒DNA小量提取物（miniprep）。
  4. 采用标准的酚-氯仿抽提法或类似方案，制备BAC质粒DNA小量提取物。
  5. 对小量提取的DNA进行限制性内切酶（RE）消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。分析限制性酶切图谱，筛选出具有预期片段大小的正确靶向载体克隆。选择一种能够清晰区分未插入载体与插入载体的限制性内切酶。
  6. 可选：为了获得不含BAC的细胞（在重组工程操作后，BAC仍存在于E. coli中），可将小量提取的质粒DNA转化至DH5alpha或DH10B E. coli感受态细胞中。
  7. 对HA标签和插入片段表达盒区域进行DNA测序，以检测寡核苷酸合成过程中可能存在的错误。

结果

基因敲入载体

基因敲入（knockin）靶向载体的设计旨在将新的序列特征引入基因组中，包括在蛋白质编码区引入单碱基对替换、将荧光标记或亲和标签与蛋白质融合，或整合基因表达盒。为了验证SPI技术在基因敲入载体构建策略中的应用，本研究考察了两个不同的测试案例。Dnttip1 编码脱氧核苷酸转移酶末端相互作用蛋白1A（TDIF1），该蛋白与I类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同组成有丝分裂去乙酰化酶复合物（MiDAC）28。为了研究Dnttip1 在细胞分裂中的作用，采用串联亲和标签技术以分离TDIF1相互作用的蛋白质。此前尝试使用含有长同源臂的p15A载体对Dnttip1 基因的一部分进行亚克隆时，出现了较低的缺口修复效率以及频繁的异常重组产物（数据未显示）。因此，在Dnttip1 位点构建基因敲入载体成为一项具有挑战性的重组工程任务。本研究设计了一种SPI策略，将跨越最后一个外显子（外显子13）的12 kb Dnttip1 基因片段亚克隆至低拷贝p15A载体中，同时将一个双亲和标签筛选盒插入外显子13，以替换终止密码子（图3A）。使用两端带有120 bp同源臂（靶向Dnttip1 终止密码子两侧）的双PTO修饰引物，从RE线性化的质粒中扩增出2×FLAG-钙调蛋白结合蛋白（CBP）连接的FRT-PGK-em7-新霉素（Neo）-BGhpA-FRT盒（2.0 kb）。构建了一个p15A zeoDnttip1 亚克隆载体（1.7 kb），其包含与待亚克隆Dnttip1 序列两端同源的200 bp区域。对该Dnttip1 亚克隆质粒进行RE线性化，并使用20 bp修饰引物进行PCR扩增，生成一条具有前导链保护的载体。PCR产物经DpnI处理、纯化后，共电穿孔转入具备重组能力的Dnttip1 BAC E. coli 细胞以及未诱导的对照细胞中。SPI反应产物接种于含Zeocin（Zeo）和卡那霉素（Kan）的琼脂平板上（图3B）。在分析的12个重组子中，SPI均成功生成了正确修饰的Dnttip1 基因敲入载体（图3C）。DNA测序证实，寡核苷酸合成或PCR扩增过程中未引入任何错误。

另一个SPI实例涉及在P2rx1基因中进行框内插入一个增强型黄色荧光蛋白（eYFP）连接的选择表达盒。该P2rx1基因编码一种G蛋白偶联受体，其功能为ATP门控离子通道29。与YFP荧光的连接使得可在多种功能实验中追踪细胞表面的P2x1受体。P2rx1是另一个难以操作的基因位点，传统重组工程技术在此位点曾遇到显著困难（数据未显示）。通过SPI技术，将包含末端外显子（外显子12）的12 kb P2rx1基因片段亚克隆至p15A zeo载体中，并通过协同插入一个两侧带有LoxP的eYFP-Neo表达盒以替换外显子12中的终止密码子，从而构建出P2rx1-eYFP基因敲入载体（图3D）。在此例中，滞后链保护的p15A载体（1.7 kb）含有230 bp同源臂，而eYFP表达盒含有50 bp同源臂且保持未修饰状态。eYFP插入片段（2.7 kb）通过重叠PCR拼接构建，其中eYFP基因由pEYFP-C1质粒PCR扩增获得，LoxP-PGK-em7-Neo-BGhpA-LoxP片段则由pL452质粒（NCI, Frederick）PCR扩增获得。SPI反应产生了数百个克隆菌落（数据未显示）。对11个克隆提取的质粒DNA进行限制性酶切（RE）分析，结果显示大多数克隆含有正确组装的P2rx1-eYFP基因敲入载体（图3E）。进一步的DNA测序验证表明eYFP表达盒被无错误插入。然而，部分克隆显示出在同一细胞中同时存在未标记的缺口修复质粒和标记的缺口修复质粒的条带模式（泳道6–9）。少数样本还包含错误缺口修复（泳道2）或错靶向质粒（泳道4和5）。部分SPI重组子在同时进行亚克隆与靶向时失败，凸显了当使用较大表达盒（> 3 kb）或较短同源臂（HA）时，SPI克隆效率的局限性，这源于Red介导的长DNA片段过程性受限30。事实上，将eYFP表达盒的同源臂延长至200 bp可显著提高SPI效率及表达盒的正确靶向率（数据未显示）。使用P2rx1-eYFP基因敲入载体对中国台湾JM8.N4小鼠胚胎干细胞（C57BL/6品系）进行基因靶向，共获得96个克隆，其中6个为阳性克隆，含有正确靶向的P2rx1-eYFP序列（图3F）。

BAC 报告基因载体

目标基因的BAC克隆通常包含所有必需的上游和下游调控元件，例如增强子、UTR等，以及能够以天然水平驱动基因表达的内源性启动子31。因此，BAC报告载体是重现基因内源性表达模式的首选载体32。然而，BAC质粒较大的尺寸（可达200 kb）在将完整BAC转染入细胞时带来了显著的实际困难33。通过BAC修剪技术34,35缩小BAC基因组插入片段的大小，同时保留基因所需的调控元件，可更便于操作BAC，并实现更高效的转染。目前的BAC工程技术通常需要多轮重组操作来实现这一目标35。为展示SPI在BAC修剪中的应用价值，使用pBeloBAC11 BAC载体对包含全长P2rx1基因的30 kb基因组序列进行亚克隆，该序列来源于168 kb的P2rx1 BAC，同时在P2rx1基因中插入一个eYFP表达盒（图4A）。含有180 bp同源臂（HA）的pBeloBAC11 zeo载体骨架（6.5 kb）通过修饰后的引物进行PCR扩增，生成具有滞后链保护的载体。同样使用此前构建P2rx1基因敲入载体时所用的eYFP Neo表达盒（3 kb），采用含有180 bp HA并具有滞后链保护的引物进行PCR扩增，并靶向P2rx1基因的第12号外显子，替换其终止密码子。将扩增的eYFP表达盒与pBeloBAC11 zeo载体共同电穿孔转入表达gbaA重组蛋白的P2rx1 BAC细胞中后，将菌液在10 ml LB培养基（pH 8）中于37°C恢复培养3小时，以实现BAC质粒的分离。通过Zeo和Kan抗性琼脂平板筛选获得纯合重组子，其频率为2 × 10-6。菌落PCR基因分型分析显示，在分析的6个克隆中，有3个成功实现了BAC修剪（图4B）。跨越eYFP插入位点的长片段PCR扩增证实，这三个阳性克隆中表达盒的正确插入（图4B）。另外三个缺失eYFP插入片段的克隆在5’端也发生了错误的缺口修复，尽管这些克隆中eYFP表达盒错靶的原因可能与5’端BAC末端的正确闭合无关。对三个eYFP阳性的BAC克隆进一步进行限制性内切酶（RE）消化分析，结果显示其酶切图谱符合预期的正确修剪后的eYFP重组BAC（图4C）。测序分析表明，在这三个阳性克隆中，仅有一个克隆的eYFP表达盒中未检测到突变。

条件性基因敲除（cko）载体

条件性敲除基因表达是研究发育过程或在特定时间点分析生物系统的重要工具。条件性基因敲除策略通常涉及在关键外显子（CE）两侧插入LoxP重组位点。当Cre表达或被激活时，关键外显子被删除，导致阅读框移位并产生提前终止密码子，进而引发无义介导的mRNA降解（NMD）。构建条件性基因打靶载体是一项复杂的工作，通常包括多个亚克隆、打靶和转化步骤22。SPI技术为简化这一过程提供了便捷的途径。作为验证案例，本研究采用SPI方法构建了Zrsr2基因的条件性等位基因（图5A）。Zrsr2基因编码一种剪接因子，其单拷贝位于X染色体上。在此情况下，实现基因删除的条件性控制尤为重要，可避免在组成型基因敲除打靶策略中，细胞在胚胎干细胞筛选过程中对Zrsr2缺失产生适应性。通过SPI技术，将一段10 kb的Zrsr2基因片段进行亚克隆，同时插入两个不同的LoxP侧翼筛选标记盒。使用含有180 bp同源臂（HA）的滞后链保护引物，从经RE酶切的pL451质粒中PCR扩增出FRT-PGK-em7-Neo-FRT-LoxP盒（2 kb），该同源臂靶向Zrsr2基因内含子2。另一个包含Rox-PGK-em7-杀稻瘟菌素（Bsd）-Rox-LoxP（2 kb）的筛选盒，使用含有180 bp同源臂的滞后链保护引物从R6K质粒中PCR扩增获得，该同源臂与内含子3下游区域一致。这两个LoxP位点侧翼包围外显子3，即关键外显子；当条件性激活Cre时，该外显子的删除将导致阅读框移位并引入提前终止密码子。使用含有与10 kb Zrsr2序列两端匹配的180 bp同源臂的滞后链保护引物，从RE线性化的p15A zeo质粒中PCR扩增获得1.6 kb的Zrsr2亚克隆质粒。SPI反应按前述方法进行，并将产物涂布于Zeo+Neo+Bsd平板上。在检测的12个重组克隆中，大多数成功组装了Zrsr2条件性打靶载体（图5B）。进一步的DNA测序分析表明，两个筛选标记均正确插入至Zrsr2 cko载体中。

DNA转化过程，BAC克隆图解，pSC101BADgbaA质粒编辑步骤，loxP位点。
图1. SPI克隆。 结合插入盒插入与亚克隆的SPI克隆流程示意图。 (A) 将BAC克隆用pSC101 BADgbaA质粒转化后，在30°C下培养。 (B) 加入阿拉伯糖诱导Red蛋白表达后，将不对称修饰的插入盒和亚克隆质粒导入BAC克隆，并利用插入标记和亚克隆标记双重筛选，获得最终载体。 请点击此处查看该图的放大版本。

Gene editing diagram showing homologous arms, restriction site, and primer locations.
图2. SPI 重组寡核苷酸设计示意图 亚克隆质粒和插入盒均通过PCR扩增获得，所用引物为末端修饰有PTO和磷酸基团的寡核苷酸。PCR产物经Red消化后 体内，产生一个ssDNA中间体，该中间体与复制叉的滞后链退火。如图所示，每个寡核苷酸中包含50-180 bp的基因特异性同源臂（HA）。箭头表示DNA复制跨越候选基因的方向。虚线表示未被纳入PCR产物中的亚克隆质粒序列。RE site，最终载体线性化的限制性内切酶位点；F，针对亚克隆质粒或插入盒的特异性正向序列（20 bp）；R，质粒或插入盒的反向互补序列（20 bp）；sm，筛选标记。 请点击此处以查看此图的放大版本。

带有质粒图谱、凝胶电泳和培养皿培养结果的基因编辑过程。
图3. SPI技术可实现难构建的基因敲入载体的构建。 (A) 构建Dnttip1双标签载体所用SPI策略的示意图。箭头表示BAC克隆上的复制方向。 (B) Dnttip1 SPI实验中未诱导和诱导样品的涂板结果。 (C) Dnttip1 SPI克隆的EcoRI酶切结果。M，1 kb DNA ladder（NEB）；C，缺失双标签盒的p15A Dnttip1缺口修复质粒。片段大小分别为：标记型，9.2+4.4+2.2 kb；对照型，9.2+4.6 kb。 (D) 基于SPI的P2rx1-eYFP基因敲入载体构建。 (E) P2rx1-eYFP SPI克隆的EcoRI酶切结果。M，1 kb+ DNA ladder（Invitrogen）；C，缺失eYFP盒的p15A P2rx1缺口修复质粒。片段大小分别为：标记型，8.3+4.4+3.1+0.03 kb；对照型，8.3+3.1+1.8+0.03 kb。 (F) JM8.N4胚胎干细胞中P2rx1-eYFP基因打靶的Southern印迹分析。上图：使用PshAI酶切并以3’端探针进行的Southern印迹。显示了5个克隆的筛选结果。下图：对3’端筛选获得的阳性克隆，使用5’端探针并进行SpeI酶切的Southern印迹结果。PshAI限制性内切酶位点：S，SpeI限制性内切酶位点。虚线表示载体同源臂的末端。黑框表示Southern探针。预期的限制性酶切片段大小为：PshAI：野生型（WT），8.9 kb；eYFP-neo，11.5 kb；SpeI：野生型（WT），6.9 kb；eYFP-neo，7.6 kb。 请点击此处查看该图的放大版本。

pBeloBAC11zeo P2rx1 eYFP；BAC 克隆示意图；PCR 结果；电泳分析。
图 4. 利用 SPI 简化 BAC 修剪。 (A) 利用 SPI 进行 BAC 修剪的概念示意图。符号说明见图 1。 (B) 对亚克隆插入片段的 5’ 和 3’ 末端以及 P2rx1-eYFP 插入位点进行 PCR 扩增。图中展示了每种 PCR 的筛选策略。M（上图），Hyperladder 25 bp；（下图），1kb+；P，P2rx1 BAC；S，pBeloBAC11 zeo 亚克隆质粒。 (C) 来自 (B) 的三个 eYFP 阳性 SPI BAC 克隆的 HindIII 酶切结果；E，修剪后 eYFP BAC 的预期 HindIII 限制性酶切图谱。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因编辑示意图；Zrsr2 启动子、Rox 位点及凝胶电泳结果；DNA 分析。
图 5. 利用 SPI 克隆技术构建条件性基因敲除载体。 (A) 在对 Zrsr2 等位基因进行亚克隆时，同时插入两个不同 LoxP 侧翼筛选标记盒的示意图。符号说明见图 1。(B) Zrsr2 SPI 克隆的 EcoRI 消化结果。L，1 kb DNA 标准分子量标记（NEB）；C1，p15A ZrSr2 缺口修复质粒；C2，含 neo 插入片段的 p15A ZrSr2 缺口修复质粒；C3，含 bsd 插入片段的 p15A ZrSr2 缺口修复质粒。片段大小分别为：cko，7.7+2.9+2.6+1.6 kb；C1，7.7+4.0 kb；C2，7.7+4.3+1.6 kb；C3，7.7+2.9+2.3 kb。请点击此处查看该图的放大版本。

步骤数传统重组工程流程a多重重组工程b
步骤 1将重组工程质粒转化至BAC宿主将重组工程质粒转化至BAC宿主。制备靶向盒和亚克隆载体。
步骤 2插入R1/R2 Gateway盒多重缺口修复克隆
步骤 3插入floxed Kan盒单菌落过夜培养
步骤 4缺口修复至R3/R4质粒质粒制备与验证
步骤 5转化至Cre+ E. coli
步骤 6质粒制备与验证
步骤 7过夜三片段Gateway反应
步骤 8将三片段Gateway反应产物转化至DH10B E. coli 细胞
步骤 9单菌落过夜培养
步骤 10质粒制备与序列验证
a基因敲除小鼠计划（KOMP）高通量载体构建流程。平均耗时3周获得经验证的克隆26。
b平均耗时4天获得经验证的克隆

表1：传统重组工程与SPI在构建条件性基因敲除载体中的比较。

RE 缓冲液5 μl
DNA1 μg 质粒或纯化的 PCR 产物
限制性内切酶（RE）1 μl（5 单位或以上）
TE 缓冲液加至 50 μl
37 °C 孵育至少 1 小时。根据生产商说明书进行热失活

表2：限制性内切酶消化。

PCR 材料终浓度
PCR 缓冲液1x
dNTP200 nM
MgSO41.5 mM
甜菜碱1.3 M
DMSO1%
正向引物200 nM
反向引物200 nM
DNA 聚合酶1 U
模板多重拷贝质粒为 10 ng，或基因分型 PCR 使用 2.5 μl 质粒小提 DNA
水加至 50 μla
a用于含多重拷贝质粒的标准 50 μl PCR 反应。长片段基因分型 PCR 采用 25 μl 反应体系。
PCR 条件
95°C2 分钟
92°C10 秒
55°C30 秒
72°C30 秒
30 个循环b
bBAC PCR 基因分型时循环数可延长至 35 次

表3：PCR 反应体系设置与反应条件。

抗生素浓度a (μg ml-1)
Ampicillin50
Blasticidinb40
Chloramphenicol12.5
Gentamicin2
Hygromycinc30
Kanamycinb15
Tetracycline4
Trimethoprimc10
Zeocin5
a建议在多重重组工程中联合使用BACs和多拷贝质粒时采用
bBlasticidin（35 μg ml-1）与Kanamycin（6 μg ml-1）联合使用时的推荐浓度
cHygromycin和Trimethoprim不建议用于单拷贝BAC的筛选

表4. SPI实验中推荐使用的抗生素浓度。

讨论

历史上，构建胚胎干细胞系和小鼠模型通常采用包含修饰等位基因的质粒载体进行基因靶向4。然而，这些复杂的基因靶向载体的构建已被证明是此类模型及时制备过程中的一个显著瓶颈。基于重组工程（recombineering）的载体构建策略的发展，使得载体设计得到改进，组装效率也有所提高。尽管如此，现有的重组工程方案仍涉及多个步骤，需要中间质粒的纯化，并使用不同的细菌菌株。加插亚克隆（Subcloning plus insertion, SPI）提供了一种新颖的载体构建方法，可在BAC宿主菌株中通过一次电穿孔操作完成。本文在多种载体构建应用中测试了SPI在基因靶向中的实用性。在所有检测的情况下，SPI均表现出高效性，并成功产生了正确的重组质粒。在大多数情况下，多个不同的表达盒均被正确插入到靶向载体中。SPI方案能够轻松容纳大片段DNA表达盒和载体，展示了该系统的灵活性。

SPI 依赖于长同源序列以及线性 DNA � cassette 的磷硫酰化（PTO）保护。PTO 修饰可使线性 DNA 免受外切核酸酶降解20,21，而较长的同源臂（HA）可提高重组效率，从而实现多重化操作。然而，合成较长的寡核苷酸序列会增加累积错误（尤其是缺失突变）的概率。如果突变发生在蛋白质编码区，可能对功能造成严重影响。因此，强烈建议对同源臂及插入 cassette 的全长进行 DNA 测序，以排除携带任何序列变异的克隆。同时建议使用高保真 DNA 聚合酶体系，以避免引入 PCR 扩增错误。相对于插入 cassette 而言，亚克隆质粒的同源臂长度和组成更为关键（数据未显示）。对于构建基因敲入载体等特别敏感的应用，若不能容忍外显子区域的任何突变，可缩短插入 cassette 的同源臂长度（50–120 bp），以规避长寡核苷酸带来的问题。插入 cassette 也可保持未修饰状态，或进行双端磷硫酰化修饰（适用于复制方向未知的情况）。但在这些情况下，多重化操作仍需要使用带有长保护性同源臂的亚克隆质粒。该策略的一个局限性在于多重化效率的降低，可能会影响 SPI 克隆在不同位点的效率。

插入盒的长度以及亚克隆质粒的长度是SPI克隆中的另一个重要参数。较大的DNA分子电穿孔效率较低，且由于需要将所有插入盒导入同一个细胞，这种效应具有累积性（数据未显示）。多重化操作在使用较小的插入盒时效率最高。大于3 kb的DNA片段还会限制Red介导的单链DNA加工，而该过程在片段长度不超过3 kb时效率最高30。超过3 kb的插入盒会发生双端切除，并通过一种β蛋白非依赖途径进行重组，效率较低20。因此，在这些情况下，筛选足够数量的菌落以鉴定正确克隆变得尤为重要。电穿孔后延长重组时间也有助于在较难的SPI实验中提高正确克隆的回收概率。在SPI过程中，最多可同时插入四个较小的插入盒（< 1.5 kb），但每增加一个插入盒，多重化效率就会下降（数据未显示）。然而，这反映的是理想SPI实验的结果，在使用多个较大插入盒时，应谨慎考虑多重化的极限。

像成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 核酸酶系统等基因组编辑工具的发展，使得新型基因组修饰的构建成为可能，并推动了更高效的基因组工程36。然而，这些新兴技术目前是对基因靶向载体的补充，而非取代。预计 CRISPR-Cas 系统有望替代抗生素筛选，并进一步优化多重重组工程操作流程。

披露

T.R.R 是一项关于多重重组工程技术的英国专利申请的发明人。

致谢

T.R.R. 提出了研究构想，设计并实施了实验，并撰写了论文。E.J.K. 和 S.E.M. 参与了实验操作。所有作者均对最终论文的形成作出了学术贡献。本研究由莱斯特大学创新研究员项目资助 SEM，以及由英国医学研究理事会（MRC）高级研究员项目资助 S.M.C.（项目编号：MR/J009202/1）。DNA 测序由莱斯特大学核心生物技术服务中心的蛋白质与核酸实验室（PNACL）完成。我们感谢 A. Francis Stewart 提供了 Rox 和 Dre 质粒。pL451 和 pL452 质粒来源于美国弗雷德里克国家癌症研究所（NCI）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
除 Zeocin 外的抗生素Sigma: http://www.sigmaaldrich.com氨苄青霉素（Ampicillin），A9518-5G；
氯霉素（Chloramphenicol），C1919-5G；杀稻瘟菌素（Blasticidin），15205-25MG；庆大霉素（Gentamicin），G1264-50MG；潮霉素（Hygromycin），H3274-50MG；卡那霉素（Kanamycin），K1876-1G；
盐酸四环素（Tetracycline hydrochloride），T7660-5G；甲氧苄啶（Trimethoprim），92131-1G
ZeocinInvivogen： ant-zn-1Zeocin 也可从 Life technologies/Fisher 公司获得
C57BL/6 BAC 克隆CHORI: https://bacpac.chori.org/ RPCI-23 或 RPCI-24 BAC 文库129/Sv BAC 克隆可从 Invivogen 或 Life technologies/Fisher 公司获得
KOD hotstart DNA 聚合酶系统Millipore: https://www.merckmillipore.com71086-3
L-阿拉伯糖（L-Arabinose）Sigma: http://www.sigmaaldrich.comA3256-25G
长链寡核苷酸（Long oligos）IDT: https://www.idtdna.com；Gene Link: https://www.genelink.comIDT Ultramers 或 Gene Link 长链寡核苷酸PTO 和磷酸化修饰可作为定制选项。强烈推荐对长链寡核苷酸进行 PAGE 纯化。
MinElute PCR 纯化试剂盒Qiagen: http://www.qiagen.com 28004优先选用最小洗脱体积的 PCR 纯化试剂盒。
QIAPrep Spin Mini Prep 试剂盒Qiagen: http://www.qiagen.com 27104推荐使用硅胶柱或类似基质的试剂盒。
限制性内切酶NEB: https://www.neb.comDpnI: R0176L详见 NEB 官网提供的限制性内切酶列表。

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