方法文章

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

7.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52158

⸱

2014年11月26日

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

本文内容

摘要

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。

摘要

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）可通过基于慢病毒的重编程方法获得。然而，由于潜在致癌基因可能在基因组的活跃转录区域中残留，限制了其在人类治疗应用中的潜力1。此外，源于干细胞重编程或分化为具有治疗意义的衍生物过程中的非人类抗原，也阻碍了这些hiPSCs在人类临床环境中的使用2。在本视频中，我们介绍一种重编程和分析无外源性转录因子且不含外源基因的hiPSCs的方法。随后可对含有慢病毒的特定内含子区域进行基因表达异常分析。该分析可采用高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）进行，相较于此前用于检测基因表达差异的低灵敏度技术具有优势3。完全转化为符合临床级良好生产规范（GMP）的条件，使这些细胞具备人类临床应用的相关性。我们的方案提供了另一种方法——前提是当前的安全港标准未来能够扩展并纳入无外源因子、经充分表征的hiPSC衍生物用于人类治疗应用——以获得GMP级hiPSCs，从而消除因非人类抗原引发的免疫原性风险。本方案广泛适用于任何类型的慢病毒重编程细胞，并提供了一种可重复的方法，将重编程细胞转化为GMP级条件。

引言

研究表明，通过基于慢病毒表达四种关键转录因子，成人人体细胞能够发生表观遗传重塑和重编程4,5。重编程领域的一项重要进展是使用单一可切除的慢病毒干细胞表达盒（STEMCCA），该载体包含全部四种重编程转录因子，可实现蛋白质表达的精确化学计量比6。此外，在特定感染复数范围内进行转导时，STEMCCA可在重编程过程中主要导致单一位点的基因组整合事件7。可切除型STEMCCA的引入利用了Cre/loxP技术，可在干细胞系建立后切除重编程载体，从而获得无外源因子的人诱导多能干细胞（hiPSC）系8。此外，为了增强hiPSC在治疗中的应用，亟需建立一种新型、快速且易于实施的方法，将含异源成分的细胞系转化为符合良好生产规范（GMP）级别的无异源成分细胞系。本文讨论了一种相关方法，可更精确地评估基因整合后的表达差异，特别是当基因整合至内含子时的情况，以及将临床级细胞系转化为潜在GMP条件的流程。

既往研究仅采用相对不敏感的微阵列转录分析来检测STEMCCA转导后整合基因的基因表达差异3,9。本文中，我们引入了高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）分析方法，以进一步深入研究整合基因的表达差异。尤为重要的是，当前的安全位点标准会剔除携带病毒整合基因的hiPSCs，从而限制了这些细胞在后续人类细胞治疗中的应用9。我们提出，使用经过全面表征且无外源基因整合的内含子重编程hiPSCs，可能改变这一现状。此外，我们还介绍了一种稳健的符合GMP标准的细胞转化方案，该方案可广泛适用于多种最初在含异种成分条件下获得的细胞类型10。这为未来需要在临床级条件下进行、以保持人类治疗相关性的细胞重编程实验提供了重要机遇。

这些方法为当前的安全港标准提供了基础，可据此扩展标准，纳入那些在整合的内含子中切除STEMCCA后仍保持正常基因表达谱的特征明确的STEMCCA重编程人诱导多能干细胞（hiPSC）系。此外，完全转换至无非人动物抗原的临床级培养条件，将有助于纳入更多此前仅在含异种成分条件下完成重编程和特征鉴定的细胞类型。上述方法相结合，为美国食品药品监督管理局（FDA）提供了有力依据，促使其考虑将目前仅限于人胚胎干细胞（ESC）衍生治疗产品的有限批准范围，扩展至hiPSC衍生治疗产品11。

我们近期详细阐述了一种无外源因子的hiPSC细胞系的建立过程，该细胞系已得到全面表征，并已转换至拟临床级培养条件10。本文中，我们详细描述了利用STEMCCA慢病毒进行hiPSC诱导的实验方案。这些干细胞随后经历基因切除过程，并进行基因表达特征分析。最后，通过逐步转换的方法将hiPSCs过渡至GMP级培养条件。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本方法已在 Awe et al.10 报道的研究中使用。

1. 使用 STEMCCA 重编程成人人类皮肤成纤维细胞

  1. 将第4代或更低代次的成人真皮人成纤维细胞（HUFs）在37 °C水浴中解冻2分钟，注意不要让水淹没冻存管顶部。
  2. 将1 ml人成纤维细胞悬液转移至15 ml锥形管中，逐滴缓慢加入4 ml已预热至37 °C的标准HUF培养基，以稀释二甲基亚砜（DMSO）并重悬细胞。
  3. 在室温下以200 × g离心10分钟。吸除上清液，用适量培养基重悬细胞，制成浓度为100,000个细胞/ml的悬液，然后将2 ml细胞悬液加入已预先用0.2%明胶包被20分钟的六孔板的一个孔中。
    注意：需在另一孔中接种相同数量的细胞，用于后续细胞计数和感染复数（MOI）计算。
  4. 轻轻左右及前后摇动培养板，使细胞均匀分布。置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
  5. 在转导当天，从六孔板的对应孔中获取细胞计数，时间约为初次接种HUF后约24小时。
  6. 解冻2 × 108 TU（或等效量）的慢病毒浓缩液（STEMCCA），并用HUF培养基稀释至1 × 108 TU/ml。
  7. 在含有8 µg/ml转导试剂的HUF培养基中，以MOI为10的比例进行细胞转导。轻轻混匀各孔，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
  8. 慢病毒转导约24小时后，将HUF培养基更换为标准的人多能干细胞（PSC）培养基。
  9. 第2至第6天，每天更换一次人PSC培养基。
  10. 第6天，在HUF培养基中接种两个经0.2%明胶包被的10 cm培养皿，每皿接种1.5至1.75 × 106个来自CF1小鼠的MEFs12。
  11. 第7天，注意离心力不得超过100 × g，使用室温胰酶消化六孔板中一个孔的第7天重编程成纤维细胞，按1:16比例传代，将全部细胞均匀接种至前一天已铺有MEFs的两个10 cm培养皿中，加入新鲜人PSC培养基。以顺时针螺旋方式分布细胞团块，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
  12. 重编程细胞接种至MEFs上约48小时后，以及此后每天，均需更换耗尽的培养基为新鲜人PSC培养基。
  13. 3至4周后，使用21号针头挑取具有典型胚胎干细胞（ESC）样形态的单个克隆，并将每个克隆约8至10个片段分别转移至已预先用来自CF1小鼠的MEFs包被、并加入人PSC培养基的0.2%明胶包被的24孔板的不同孔中进行亚克隆。
    注意：挑取并扩增后的克隆需通过拟胚体形成实验及多能性标志物在蛋白水平的表达分析，以确认其多能性。

2. 载体整合位点分析与STEMCCA切除

  1. 采用非限制性线性扩增PCR方法分析STEMCCA整合位点，具体操作如文献10所述。
  2. 检测确认基因组目标区域已发生单一位点整合后，通过吸除旧的人类ESC培养基来去除STEMCCA。然后，在3 ml标准PSC培养基中将45 µl浓缩的Adeno-Cre-PuroR病毒与8 µg/ml转染试剂混合，孵育24小时。
  3. 24小时孵育后，吸除混合病毒上清液，并用人类PSC培养基洗涤细胞两次。加入新鲜的人类PSC培养基及2 µg/ml嘌呤霉素，持续5天，每天更换新鲜培养基和抗生素。
  4. 5天后，使用21号针头将残留的克隆进行亚克隆，接种至已涂有0.2%明胶的12孔板中，该板预先包被了来自CF1小鼠的MEF细胞，并按上述方法进行扩增。
    注意：在获得足够扩增量以制备冻存样本后，需转换为无饲养层条件。预计至少有95%的干细胞克隆死亡，因为大多数细胞未成功转导，在5天抗生素孵育期间会死亡。尽管Adeno-Cre-PuroR在感染细胞宿主染色体中的整合效率为0.001–1%，但将一批无外源因子的克隆重新暴露于嘌呤霉素中，若观察到100%细胞死亡，则可确认无病毒整合发生13。
  5. 将预先分装的基底膜基质小瓶置于冰上缓慢融化约2小时（遵循制造商建议），直至基质呈液态，然后用冷的基础培养基稀释至1:30的终浓度。在六孔板中每孔加入1 ml进行包被，室温静置1小时。
  6. 使用18号针头或玻璃/塑料“尖头”对先前包被MEF的孔中至少20至30个克隆进行划线交叉处理。操作时注意尽量减少MEF的掀起及转移。
    1. 可通过多种方式制备划线工具，包括在明火上加热、拉制并修整玻璃巴斯德吸管的复杂方法，或简单使用无菌塑料移液器吸头，或如本实验所用的21号和/或18号针头。
  7. 孵育后吸除包被孔中的基质。
  8. 用200 µl移液器轻轻刮取旧培养板上的克隆碎片，小心转移至已包被基质的六孔板中含3 ml新鲜混合培养基1的孔内。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜孵育。传代后48小时更换培养基。
  9. 从已完成STEMCCA切除并转换为无饲养层条件的hiPSCs中提取基因组DNA，细胞融合度需超过80%，使用商业化DNA提取试剂盒进行操作。
  10. 使用针对STEMCCA慢病毒外源性整合特异的引物检测切除是否正确：gDNA-hendo-MycS-正向引物，5′-acgagcacaagctcacctct-3′；gDNA-hWPRE-反向引物，5′-tcagcaaacacagtgcacacc-3′。用PCR级水溶解冻干引物，配制成10 µM的储存液。
  11. 进行PCR扩增，采用以下五步程序：95 °C预变性3分钟；随后35个循环，每个循环包括：98 °C变性20秒，62 °C退火15秒，72 °C延伸15秒；最后72 °C单次终延伸3分钟。
  12. 配制3%琼脂糖凝胶：称取1.5克琼脂糖加入50 ml 1x TAE缓冲液中，微波加热至完全溶解，加入适量稀释的DNA凝胶染料，混匀后倒入凝胶模具，室温静置1小时使其凝固。
  13. 将12 µl PCR产物与3 µl上样染料混合后上样至3%琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳30分钟。
  14. 在紫外光下观察，若无条带出现，则表明切除正确。

3. 利用定量PCR检测hiPSCs在切除前后基因表达差异的定量分析

  1. 使用商业化RNA提取试剂盒，从去饲养层且已切除后的hiPSCs中提取总RNA。
  2. 按照制造商说明书，使用商业化试剂盒将最多1 µg的总RNA进行逆转录。使用锚定寡核苷酸(dT)18和随机六聚体引物。
    注意：确保PCR方案针对长度大于或小于4 kb的基因转录本进行优化。需针对STEMCCA最初整合的基因设计特异性引物。
  3. 用PCR级水溶解冻干引物，配制成20 µM的储存液。
  4. 每20 µl反应体系中加入5 ng样本，反应体系包含10 µM UPL探针、2x LightCycler 480 Probes Master以及20 µM的正向和反向引物。

4. 转化为GMP级条件

  1. 在将术后切除的 hiPSCs 转换至 GMP 级别培养条件的第一天，配制一种混合培养基，其中人 PSC 混合培养基 1（混合培养基 1）与临床级符合药品生产质量管理规范（GMP）的培养基（混合培养基 2）按 80:20 的比例混合。
  2. 吸除原有的混合培养基 1，加入 3 ml 预先温育的、按 80:20 比例配制的新混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
  3. 第 4 天，将混合培养基 1 和 2 按 50:50 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 50:50 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
  4. 第 7 天，将混合培养基 1 和 2 按 20:80 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 20:80 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
  5. 第 10 天，将混合培养基 1 和 2 按 0:100 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 0:100 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基。此时细胞已完全处于明确的无异源成分培养基中。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
    注意：在整个转换过程中，需常规使用 18 号针头进行传代，以维持适当的克隆大小和密度。应根据克隆大小、汇合度及分化情况，计划每 4 至 5 天传代一次。
  6. 按照生产商推荐的方法，使用一种明确的无异源成分基质对六孔板中的一个孔进行包被。
  7. 对已转换至无异源成分培养基条件的六孔板中汇合的细胞孔，使用 18 号针头进行机械传代。重要的是，在传代前需向细胞中加入新培养基（混合培养基 2）并添加 1× ROCK 抑制剂，孵育 1 小时，以预处理培养基。
  8. 吸除细胞将要转移至的新培养板上的合成基质溶液。将含有干细胞团块的全部旧培养基从原培养板中移除，并转移至新培养板中。
  9. 将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 2 天，期间尽量减少物理扰动（理想情况下，培养板一旦放入培养箱后不再直接触碰），以促进最大化的细胞贴附。
    注意：细胞需每日更换培养基。持续每 4 天传代一次至关重要。使用 21 号针头，仅传代具有最佳 ESC 样形态（高核质比）的克隆部分。这将确保筛选出能够良好生长并最终形成均一克隆的正确 hiPSC 克隆。从初始混合培养基更换开始，获得 ESC 样克隆的总体时间为 15 至 20 天。
  10. 冷冻保存 GMP 级别的术后切除 hiPSCs：首先使用 18 号针头在所有克隆上进行十字划线，然后用 200 µl 移液器将所有克隆碎片吹打下来，将含有细胞的全部培养基转移至 15 ml 锥形离心管中，在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
  11. 在细胞离心过程中，配制冻存液：将预冷的混合培养基 2 与冻存液按等体积混合，使终浓度为 7.5% DMSO。
  12. 细胞沉淀完成后，吸除旧培养基，逐滴加入冻存液重悬细胞沉淀。立即转移至冻存管中，并放入 −80 °C 冰箱中保存。

5. GMP级人诱导多能干细胞（hiPSCs）切除后表征

  1. 为确保转化后多能性标志物的正确表达，使用引物（见表1）并按照步骤3所述相同方法进行QPCR，定量检测关键多能性标志物（SOX2、OCT4 和 NANOG）的表达水平。QPCR方法遵循步骤3中列出的相同步骤。
  2. 根据试剂盒中列出的标准条件，使用流式细胞术检测非人类唾液酸 Neu5Gc（N-羟乙酰神经氨酸），方法如先前文献报道10。
  3. 使用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤含细胞的细胞培养板。
  4. 使用1×解离试剂在室温下孵育5分钟，使细胞集落解离。
  5. 在步骤5.4的5分钟孵育期间，将封闭剂（试剂盒提供）用预冷的PBS配制成0.5%的封闭溶液，以准备封闭液。
  6. 为流式细胞术分析标记以下一系列试管：未染色对照；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；对照抗体1:200；一抗1:200；二抗1:200驴抗鸡IgG（H+L）；MEF样本；基质上切除后的细胞样本；合成基底上切除后的细胞样本。
  7. 向步骤5.4所得细胞团块中加入2 ml封闭溶液，轻柔吹打使细胞团块悬浮，转移至15 ml锥形管中。在4 °C下以80 × g离心5分钟。
  8. 用封闭溶液洗涤细胞两次，离心条件同步骤5.7所述。
  9. 将约1 × 106个细胞用100 µl封闭溶液重悬，并加入相应稀释比例的各抗体。在4 °C下轻轻振荡孵育1小时。
  10. 重复步骤5.8中的洗涤步骤共三次。
  11. 对于步骤5.6中列出的第2、6、7和8号试管，将细胞沉淀重悬于400 µl稀释缓冲液（来自试剂盒）中，并加入1:100的DAPI。
  12. 将细胞通过40 µm滤网过滤后上机进行流式细胞术分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们介绍了一种利用基于STEMCCA慢病毒的重编程方法获得临床级无因子hiPSC的方案。图1A展示了在MEF饲养层上使用STEMCCA方法重编程后，三个不同未切除前hiPSC细胞系的代表性图像。STEMCCA重编程方法的主要优势在于，不同研究团队和不同地点的多位科研人员均能实现稳定且可重复的重编程效果。图1B展示了切除后的逆转录PCR凝胶结果，其中某一特定亚克隆（2.3）完全不含STEMCCA慢病毒，表现为缺乏针对STEMCCA内源性特异序列的扩增条带。图2A展示了在含异种成分基质上培养的重编程前hiPSC，以及在合成基质上培养的切除后无异种成分的GMP级hiPSC。通过qPCR对多能性相关标志因子（SOX2、OCT4和NANOG）进行定量分析的结果如图2B所示。如图2C所示，通过流式细胞术检测了重编程前及转化为GMP级条件后的hiPSC中唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（指示非人源抗原的存在）的表达情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们介绍了一种在无外源因子条件下诱导生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的方法，并通过将这些细胞转化为符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的培养条件，使其具备临床应用价值，为未来人类治疗中的下游细胞分化奠定基础。尽管本方案可广泛适用于多种细胞类型，但我们选择重编程人皮肤成纤维细胞，因其易于从患者体内获取，且适用于个体化人类治疗。一旦在完全分化为具有临床意义的终末细胞类型方面的局限性得到解决14，本文所述的向GMP级条件的转化将对更多不同类型的细胞具有更广泛的应用价值。

本研究的第一部分涉及使用STEMCCA慢病毒对人类成纤维细胞进行重编程。选择该技术在很大程度上是由于其可重复性高、重编程效率相对较高（0.02%），并且能够在多种不同细胞类型中稳健地实现重编程10。该技术优于其他重编程方法，例如仙台病毒、附加体质粒以及基于合成mRNA的重编程，后者存在重编程效率较低和可重复性差的问题10。尽管基于HIV的载体倾向于整合到基因活性热点区域15，但并不能保证其一定会整合到基因内部，更不用说整合到基因...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

James A. Byrne（JAB）和 Agustin Vega-Crespo 接受 Fibrocell Science, Inc. 的研究资助。JAB 担任 Fibrocell Science, Inc. 的科学顾问。其他作者均无任何竞争利益需要披露。

致谢

我们感谢 Patrick C. Lee、Cyril Ramathal 和 Saravanan Karumbayaram（SK）在诱导多能干细胞（iPSC）的衍生与鉴定实验中提供的帮助；感谢 Aaron Cooper 完成 iPSC 分析实验；感谢 Vittorio Sebastiano 和 Renee A. Reijo Pera 指导最初的重编程工作；感谢 SK、William E. Lowry、Jerome A. Zack 和 Donald B. Kohn 指导建立加州大学洛杉矶分校（UCLA）符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施，从而实现临床级 iPSC 的转化与鉴定；感谢 Gustavo Mostoslavsky 向我们提供了 STEMCCA 多顺反子重编程载体。本研究基于与 Fibrocell Science 及皮肤间充质来源衍生物临床研究计划（CIDMOD）的合作，旨在开发安全的个体化细胞治疗产品。本研究得到了加州大学洛杉矶分校再生医学与干细胞研究中心 Eli 和 Edythe Broad 中心、Phelps 家族基金会、Fibrocell Science 公司以及 UCLA 临床与转化科学研究所（CTSI）学者奖（授予 JAB）的资助支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养基与试剂
DMEM/F12（基础培养基）Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)11330057
胎牛血清Invitrogen16000044
最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸（NEAA），100倍浓缩液Invitrogen11140050
Glutamax，100倍浓缩液Invitrogen35050-061
青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液Invitrogen15140-122在 4 °C 下解冻，分装后于 −20 °C 保存
无血清替代物（Knockout serum replacement）Invitrogen10828028在 4 °C 下解冻，分装后于 −20 °C 保存
胰蛋白酶/EDTA，0.5%Invitrogen15400-054用 1× PBS 将原液稀释至 0.05%
碱性成纤维细胞生长因子GlobalStem (Rockville, MD, USA)GSR-2001用含 0.1% 牛血清白蛋白的 1× PBS 溶解，配制成 10 µg/ml 储存液，并于 −80 °C 保存
β-巯基乙醇Millipore (Billerica, MA, USA)ES-007-E
Matrigel（基底膜基质）BD Biosciences (San Jose, CA, USA)356231冰上操作，将 Matrigel 原液用 DMEM/F12 稀释 10 ml，实现 1:2 稀释。分装后于 −20 °C 保存。
CELLstart（合成基质）InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Cambridge, MA, USA)04-0012-02
嘌呤霉素InvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (Basel, Switzerland)4707494001
ProFreeze-CDM 培养基/冷冻保存液Lonza (Basel, Switzerland)12-769E
二甲基亚砜Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 bp DNA LadderInvitrogen15628019
SYBR Safe DNA 凝胶染料，10,000倍InvitrogenS33102
琼脂糖Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)161-3101
明胶（来源于猪皮）Sigma-AldrichG1890-100G用 PBS 配制成 0.2% 储存液，高压灭菌后室温保存。
mTeSR1StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)5850将 5 倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于 4 °C 保存，最多可使用 2 周。
Stemedia NutriStem XF/FF 培养基Stemgent05-100-1A在 4 °C 下过夜解冻，分装后于 4 °C 保存，最多可使用 2 周。
PrimocinInvivoGen (San Diego, CA, USA)ant-pm-1
Accutase（解离试剂）InvitrogenA1110501
驴抗鸡 IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)703-546-155
聚凝胺/转染试剂MilliporeTR-1003-G
耗材
12 孔板VWR (West Chester, PA, USA)29442-038
6 孔板VWR29442-042
10 cm 培养皿Sigma-AldrichZ688819
18 号针头Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)148265D
21 号针头Fisher Scientific14-829-10D
设备
BD LSRII 流式细胞仪KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva 软件，版本 6.1.3BD Biosciences
试剂盒
PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒InvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR 试剂盒KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)KK2601
High Pure RNA 提取试剂盒Roche11828665001
Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒Roche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc 基础试剂盒Sialix (Newton, MA, USA)Basic Pack
培养基
混合培养基 1StemCell Technologies 和 Stemgent由等体积的 mTeSR1 和 Nutristem 组成
混合培养基 2StemCell Technologies 和 Stemgent由等体积的 TeSR2 和 Nutristem 组成
HUF 培养基Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F12 [DMEM/F12]，添加 10% 胎牛血清、1× 非必需氨基酸、1× Glutamax 和 1× Primocin
人多能干细胞培养基DMEM/F12 添加 20% 无血清替代物、1× Glutamax、1× 非必需氨基酸、1× Primocin、1× β-巯基乙醇和 10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子。
DMEM/F12：Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F12；PBS：磷酸盐缓冲液。

参考文献

  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

hiPSCs DNA Cre GMP hiPSCs

相关文章