我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。
我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。
人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）可通过基于慢病毒的重编程方法获得。然而，由于潜在致癌基因可能在基因组的活跃转录区域中残留，限制了其在人类治疗应用中的潜力1。此外，源于干细胞重编程或分化为具有治疗意义的衍生物过程中的非人类抗原，也阻碍了这些hiPSCs在人类临床环境中的使用2。在本视频中，我们介绍一种重编程和分析无外源性转录因子且不含外源基因的hiPSCs的方法。随后可对含有慢病毒的特定内含子区域进行基因表达异常分析。该分析可采用高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）进行，相较于此前用于检测基因表达差异的低灵敏度技术具有优势3。完全转化为符合临床级良好生产规范（GMP）的条件，使这些细胞具备人类临床应用的相关性。我们的方案提供了另一种方法——前提是当前的安全港标准未来能够扩展并纳入无外源因子、经充分表征的hiPSC衍生物用于人类治疗应用——以获得GMP级hiPSCs，从而消除因非人类抗原引发的免疫原性风险。本方案广泛适用于任何类型的慢病毒重编程细胞，并提供了一种可重复的方法，将重编程细胞转化为GMP级条件。
研究表明，通过基于慢病毒表达四种关键转录因子，成人人体细胞能够发生表观遗传重塑和重编程4,5。重编程领域的一项重要进展是使用单一可切除的慢病毒干细胞表达盒（STEMCCA），该载体包含全部四种重编程转录因子，可实现蛋白质表达的精确化学计量比6。此外，在特定感染复数范围内进行转导时，STEMCCA可在重编程过程中主要导致单一位点的基因组整合事件7。可切除型STEMCCA的引入利用了Cre/loxP技术，可在干细胞系建立后切除重编程载体，从而获得无外源因子的人诱导多能干细胞（hiPSC）系8。此外，为了增强hiPSC在治疗中的应用，亟需建立一种新型、快速且易于实施的方法，将含异源成分的细胞系转化为符合良好生产规范（GMP）级别的无异源成分细胞系。本文讨论了一种相关方法，可更精确地评估基因整合后的表达差异，特别是当基因整合至内含子时的情况，以及将临床级细胞系转化为潜在GMP条件的流程。
既往研究仅采用相对不敏感的微阵列转录分析来检测STEMCCA转导后整合基因的基因表达差异3,9。本文中，我们引入了高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）分析方法，以进一步深入研究整合基因的表达差异。尤为重要的是，当前的安全位点标准会剔除携带病毒整合基因的hiPSCs，从而限制了这些细胞在后续人类细胞治疗中的应用9。我们提出，使用经过全面表征且无外源基因整合的内含子重编程....
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注意：本方法已在 Awe et al.10 报道的研究中使用。
1. 使用 STEMCCA 重编程成人人类皮肤成纤维细胞
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我们介绍了一种利用基于STEMCCA慢病毒的重编程方法获得临床级无因子hiPSC的方案。图1A展示了在MEF饲养层上使用STEMCCA方法重编程后，三个不同未切除前hiPSC细胞系的代表性图像。STEMCCA重编程方法的主要优势在于，不同研究团队和不同地点的多位科研人员均能实现稳定且可重复的重编程效果。图1B展示了切除后的逆转录PCR凝胶结果，其中某一特定亚克隆（2.3）完全不含STEMCCA慢病毒，表现为缺乏针对STEMCCA内源性特异序列的扩增条带。图2A展示了在含异种成分基质上培养的重编程前hiPSC，以及在合成基质上培养的切除后无异种成分的GMP级hiPSC。通过qPCR对多能性相关标志因子（SOX2、OCT4和NANOG）进行定量分析的结果如图2B所示。如图2C所示，通过流式细胞术检测了重编程前及转化为GMP级条件后的hiPSC中唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（指示非人源抗原的存在）的表达情况。
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我们介绍了一种在无外源因子条件下诱导生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的方法，并通过将这些细胞转化为符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的培养条件，使其具备临床应用价值，为未来人类治疗中的下游细胞分化奠定基础。尽管本方案可广泛适用于多种细胞类型，但我们选择重编程人皮肤成纤维细胞，因其易于从患者体内获取，且适用于个体化人类治疗。一旦在完全分化为具有临床意义的终末细胞类型方面的局限性得到解决14，本文所述的向GMP级条件的转化将对更多不同类型的细胞具有更广泛的应用价值。
本研究的第一部分涉及使用STEMCCA慢病毒对人类成纤维细胞进行重编程。选择该技术在很大程度上是由于其可重复性高、重编程效率相对较高（0.02%），并且能够在多种不同细胞类型中稳健地实现重编程10。该技术优于其他重编程方法，例如仙台病毒、附加体质粒以及基于合成mRNA的重编程，后者存在重编程效率较低和可重复性差的问题10。尽管基于HIV的载体倾向于整合到基因活性热点区域15，但并不能保证其一定会整合到基因内部，更不用说整合到基因.......
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James A. Byrne（JAB）和 Agustin Vega-Crespo 接受 Fibrocell Science, Inc. 的研究资助。JAB 担任 Fibrocell Science, Inc. 的科学顾问。其他作者均无任何竞争利益需要披露。
我们感谢 Patrick C. Lee、Cyril Ramathal 和 Saravanan Karumbayaram（SK）在诱导多能干细胞（iPSC）的衍生与鉴定实验中提供的帮助；感谢 Aaron Cooper 完成 iPSC 分析实验；感谢 Vittorio Sebastiano 和 Renee A. Reijo Pera 指导最初的重编程工作；感谢 SK、William E. Lowry、Jerome A. Zack 和 Donald B. Kohn 指导建立加州大学洛杉矶分校（UCLA）符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施，从而实现临床级 iPSC 的转化与鉴定；感谢 Gustavo Mostoslavsky 向我们提供了 STEMCCA 多顺反子重编程载体。本研究基于与 Fibrocell Science 及皮肤间充质来源衍生物临床研究计划（CIDMOD）的合作，旨在开发安全的个体化细胞治疗产品。本研究得到了加州大学洛杉矶分校再生医学与干细胞研究中心 Eli 和 Edythe Broad 中心、Phelps 家族基金会、Fibrocell Science 公司以及 UCLA 临床与转化科学研究所（CTSI）学者奖（授予 JAB）的资助支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基与试剂 | |||
| DMEM/F12（基础培养基） | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 16000044 | |
| 最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸（NEAA），100倍浓缩液 | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax，100倍浓缩液 | Invitrogen | 35050-061 | |
| 青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液 | Invitrogen | 15140-122 | 在 4 °C 下解冻，分装后于 −20 °C 保存 |
| 无血清替代物（Knockout serum replacement） | Invitrogen | 10828028 | 在 4 °C 下解冻，分装后于 −20 °C 保存 |
| 胰蛋白酶/EDTA，0.5% | Invitrogen | 15400-054 | 用 1× PBS 将原液稀释至 0.05% |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 1× PBS 溶解，配制成 10 µg/ml 储存液，并于 −80 °C 保存 |
| β-巯基乙醇 | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel（基底膜基质） | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | 冰上操作，将 Matrigel 原液用 DMEM/F12 稀释 10 ml，实现 1:2 稀释。分装后于 −20 °C 保存。 |
| CELLstart（合成基质） | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM 培养基/冷冻保存液 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA 凝胶染料，10,000倍 | Invitrogen | S33102 | |
| 琼脂糖 | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| 明胶（来源于猪皮） | Sigma-Aldrich | G1890-100G | 用 PBS 配制成 0.2% 储存液，高压灭菌后室温保存。 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | 将 5 倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于 4 °C 保存，最多可使用 2 周。 |
| Stemedia NutriStem XF/FF 培养基 | Stemgent | 05-100-1A | 在 4 °C 下过夜解冻，分装后于 4 °C 保存，最多可使用 2 周。 |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase（解离试剂） | Invitrogen | A1110501 | |
| 驴抗鸡 IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| 聚凝胺/转染试剂 | Millipore | TR-1003-G | |
| 耗材 | |||
| 12 孔板 | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6 孔板 | VWR | 29442-042 | |
| 10 cm 培养皿 | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18 号针头 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21 号针头 | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| 设备 | |||
| BD LSRII 流式细胞仪 | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva 软件，版本 6.1.3 | BD Biosciences | ||
| 试剂盒 | |||
| PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒 | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR 试剂盒 | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA 提取试剂盒 | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒 | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc 基础试剂盒 | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| 培养基 | |||
| 混合培养基 1 | StemCell Technologies 和 Stemgent | 由等体积的 mTeSR1 和 Nutristem 组成 | |
| 混合培养基 2 | StemCell Technologies 和 Stemgent | 由等体积的 TeSR2 和 Nutristem 组成 | |
| HUF 培养基 | Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F12 [DMEM/F12]，添加 10% 胎牛血清、1× 非必需氨基酸、1× Glutamax 和 1× Primocin | ||
| 人多能干细胞培养基 | DMEM/F12 添加 20% 无血清替代物、1× Glutamax、1× 非必需氨基酸、1× Primocin、1× β-巯基乙醇和 10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子。 | ||
| DMEM/F12：Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F12；PBS：磷酸盐缓冲液。 |
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