本文介绍了一套灵活且具有策略性的实验方案，可通过病毒载体操控少突胶质前体细胞，使其过表达目标蛋白，从而特异性地探究这些蛋白在少突胶质细胞中的功能 体外 中枢神经系统髓鞘形成模型
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
髓鞘形成是一个复杂的过程，涉及神经元以及形成髓鞘的胶质细胞，后者在中枢神经系统（CNS）中为少突胶质细胞，在周围神经系统（PNS）中为施万细胞。我们使用一种 体外 髓鞘化检测，一种研究中枢神经系统髓鞘化的既定模型 体外为此，将少突胶质前体细胞（OPCs）添加至纯化的原代啮齿类动物背根神经节（DRG）神经元中，以建立可形成髓鞘的共培养体系。为了特异性地研究少突胶质细胞所表达的特定蛋白质在髓鞘形成过程中发挥的作用，我们开发了一套实验方案：在将OPCs接种到DRG神经元之前，利用慢病毒选择性地转导这些细胞，使其过表达野生型、组成型活性或显性负性蛋白。该方法使我们能够特异性地探究这些少突胶质细胞蛋白在调控髓鞘形成中的功能。该技术方案也可应用于其他细胞类型的研究，从而提供一种可选择性操控特定细胞类型（如少突胶质细胞）所表达蛋白的策略，用于靶向研究信号通路及代偿机制。综上所述，结合 体外 利用慢病毒感染的少突胶质前体细胞进行髓鞘化检测，为分析参与髓鞘形成过程的分子机制提供了一种有效的研究工具。
引言
轴突的髓鞘化对于中枢和外周神经系统中动作电位的快速高效传导至关重要。在外周神经系统中，由施万细胞（Schwann cells）在中枢神经系统中由少突胶质细胞（oligodendrocytes）这些特化的细胞环绕轴突并形成髓鞘，有效隔离神经纤维，促进跳跃式传导1髓鞘形成过程可以被研究 体外 使用视网膜神经节细胞2，工程化纳米纤维3，或与施万细胞共培养的背根神经节神经元4 或少突胶质细胞5-7。该 体外 髓鞘化检测是一种研究神经系统髓鞘化的成熟模型，可复制髓鞘化过程中发生的多种基本生物学过程 体内5-8该实验涉及将纯化的背根神经节（DRG）神经元与少突胶质前体细胞（OPCs，用于中枢神经系统髓鞘形成）或施万细胞（Schwann cells，用于外周神经系统髓鞘形成）共培养。在特定条件下，这些髓鞘形成细胞会以有序的、经超微结构验证的多层板状绝缘质膜包裹DRG轴突，并表达与体内相同的髓鞘特异性蛋白组合。 体内
研究中枢神经系统髓鞘形成的最常用细胞模型 体外 背根神经节神经元与少突胶质前体细胞的共培养体系，已被成功用于研究神经营养因子等外源性因素对中枢神经系统髓鞘形成的影响 体外5,6外源性因素，如生长因子或小分子药理学抑制剂，....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本研究使用的所有动物均为混合性别，由墨尔本大学解剖学与病理学系及弗洛里神经科学与心理健康研究所的动物饲养设施培育。所有动物实验程序均经墨尔本大学动物实验伦理委员会批准。
1. 2K7 慢病毒载体的克隆
- 在将目的基因克隆到 2K7 慢病毒载体之前，使用标准分子生物学技术将目的基因亚克隆至 pENTR 载体（3637 bp，卡那霉素抗性）中11。亚克隆时使用 EcoRI 和 SacII 限制性酶切位点。
- 2K7 慢病毒载体的扩增
- 通过将 100 ng 质粒 DNA 与感受态细胞轻柔混合，并在冰上孵育 30 分钟，转化 2K7 慢病毒载体 DNA。
- 在 42 °C 下热激 DNA/感受态细胞混合物 90 秒，随后将其涂布于含有氨苄青霉素（100 µg/ml）和氯霉素（15 µg/ml）的 LB-琼脂平板上，在 37 °C 下培养 16–18 小时。
注：使用氯霉素可防止长末端重复序列之间的重组。 - 次日，将筛选出的细菌克隆在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）和氯霉素（15 µg/ml）的 LB 培养基中，于 37 °C 培养 16–18 小时。按照制造商说明书，使用商业质粒 DNA 大量提取试剂盒提取 DNA。
- 从 pENTR 载体亚克隆至 2K7 慢病毒载体（图 1<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
用于慢病毒生产的带有标签的细胞外信号调节激酶1（Flag-Erk1）构建体，通过限制性酶切对所用构建体进行验证，包括2K7构建体以及病毒生产所需的包装和辅助构建体（图3）。
图3：DNA构建体的验证。用于慢病毒生产的全部DNA构建体均从Stbl3细菌中提取纯化，并通过限制性酶切进行验证。如图所示，辅助载体和包装载体使用NcoI和EcoRI进行酶切，并与未切割的质粒进行比较(A)。2K7-GFP使用SpeI和SacII进行酶切(A)。2K.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
轴突的髓鞘化是脊椎动物中枢神经系统和周围神经系统发挥最佳功能的关键过程。髓鞘化轴突的生成与维持是一个复杂且协调的过程，涉及神经元、胶质细胞（来自施万细胞或少突胶质细胞）以及细胞外基质蛋白之间的分子相互作用。体内和体外髓鞘化实验均涉及多种细胞类型，因此该实验方案的重要性和应用价值在于，它能够在混合共培养体系中对特定细胞类型的蛋白质进行操控。使用非特异性的药理学工具来阻断特定蛋白质或信号通路的活性，无法明确揭示这些蛋白质从神经元或胶质细胞角度对髓鞘化过程的具体影响，除非该蛋白质仅由一种细胞类型特异性表达。因此，将体外髓鞘化实验与利用慢病毒特异性转导少突胶质前体细胞（OPCs）的方法相结合，使我们能够探究少突胶质细胞来源的蛋白质对髓鞘化的影响。我们已成功使用2K7慢病毒在少突胶质细胞中特异性过表达特定蛋白质，用于体外髓鞘化实验，以解析少突胶质细胞信号对中枢神经系统（CNS）髓鞘化的影响9。
为获得转导少突胶质前体细胞（OPC）中可重复的实验结果 体外 髓鞘化检测实验中，从克隆、.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明本研究不存在利益冲突。
致谢
本工作由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC 奖学金 #454330 支持 JX，项目资助 #628761 支持 SM，APP1058647 支持 JX）、澳大利亚多发性硬化症研究基金会（MSRA #12070 支持 JX）、墨尔本大学研究资助支持计划以及墨尔本研究 CI 奖学金（支持 JX），以及澳大利亚研究生奖学金（支持 HP 和 AF）共同资助。 我们谨此致谢澳大利亚维多利亚州创新、产业与区域发展部的运营基础设施计划。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2K7 慢病毒载体 | 由 Suter 博士惠赠9 | ||
| 5-氟-2′-脱氧尿苷 | 西格玛-奥德里奇 | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 羊抗小鼠 IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 羊抗兔 IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| 氨苄青霉素 | 西格玛-奥德里奇 | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 神经元补充剂 | 干细胞技术公司 | 5711 | |
| BDNF（人源） | Peprotech | PT450021000 | |
| 生物素（d-生物素） | 西格玛-奥德里奇 | B4639 | |
| Bradford 试剂 | 西格玛-奥德里奇 | B6916-500ML | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 西格玛-奥德里奇 | A4161 | |
| 氯霉素 | 西格玛-奥德里奇 | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO 荧光封片剂 | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM，高糖，含丙酮酸盐，不含谷氨酰胺 | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | 西格玛-奥德里奇 | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS，含钙、镁 | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| 启动子和目的基因的入门载体 | 根据方案 1-2 制备 | ||
| 胎牛血清 | 西格玛-奥德里奇 | 12003C | |
| 佛司可林 | 西格玛-奥德里奇 | F6886-50MG | |
| 葡萄糖（D-葡萄糖） | 西格玛-奥德里奇 | G7528 | |
| 甘油 | Chem Supply | GL010-500M | 参见储备溶液 |
| 羊抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| 羊抗小鼠 IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| 羊抗大鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | 西格玛-奥德里奇 | I3021-100ML | |
| 胰岛素 | 西格玛-奥德里奇 | I6634 | |
| 卡那霉素 | 西格玛-奥德里奇 | 60615 | |
| 层粘连蛋白 | Life Technologies | 23017015 | |
| LB 培养基 | 参见储备溶液 | ||
| LB-琼脂 | 参见储备溶液 | ||
| L-半胱氨酸 | 西格玛-奥德里奇 | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Life Technologies | 11415064 | |
| L-谷氨酸 | 西格玛-奥德里奇 | G1626 | |
| L-谷氨酰胺 - 200 mM (100x) 液体 | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus 酶 | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM，非必需氨基酸，不含谷氨酰胺 | Life Technologies | 10370088 | |
| 小鼠 α βIII 微管蛋白 | Promega | G7121 | |
| 小鼠 αMBP（单克隆） | Millipore | MAB381 | |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | 西格玛-奥德里奇 | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal 培养基 | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF（小鼠源） | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 抗体 - 小鼠抗 O1 | Millipore | MAB344 | 若无法获得 O1 杂交瘤细胞，可作为替代 |
| O1 杂交瘤细胞 | 用于免疫筛选的含抗 O1 抗体的条件培养基 | ||
| O4 抗体 - 小鼠抗 O4 | Millipore | MAB345 | 若无法获得 O4 杂交瘤细胞，可作为替代 |
| O4 杂交瘤细胞 | 用于免疫筛选的含抗 O4 抗体的条件培养基 | ||
| 感受态细胞 | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl 感受态细胞 | Life Technologies | C7373-03 | |
| 木瓜蛋白酶悬浮液 | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | 由 Denham 博士惠赠10 | ||
| PDGF-AA（人源） | Peprotech | PT10013A500 | |
| 青霉素-链霉素 100x 溶液 | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 聚-D-赖氨酸 | 西格玛 | P6407-5MG | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | 西格玛-奥德里奇 | 408727-100ML | |
| 聚-L-鸟氨酸 | 西格玛-奥德里奇 | P3655 | |
| 孕酮 | 西格玛-奥德里奇 | P8783 | |
| 蛋白酶抑制剂片剂（Complete mini） | 罗氏 | 11836153001 | |
| 蛋白酶 K | 随 Clonase 酶提供 | ||
| 腐胺 | 西格玛-奥德里奇 | P-5780 | |
| 兔 α 神经丝蛋白 | Millipore | AB1987 | |
| 兔 αMBP（多克隆） | Millipore | AB980 | |
| Ran2 杂交瘤细胞 | ATCC | TIB-119 | 用于免疫筛选的含抗 Ran2 抗体的条件培养基 |
| 大鼠抗 CD140A/PDGFRa 抗体 | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC 培养基 | 随感受态细菌提供 | ||
| 亚硒酸钠 | 西格玛-奥德里奇 | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202S | |
| T4 DNA 连接酶缓冲液 | NEB | B0202S | |
| TE 缓冲液 pH8 | 参见储备溶液 | ||
| TNE 裂解缓冲液 | |||
| 微量元素 B | Cellgro | 99-175-CI | |
| 转铁蛋白（人源脱铁转铁蛋白） | 西格玛-奥德里奇 | T1147 | |
| 吐温 X-100 | 西格玛-奥德里奇 | T9284 | |
| 胰蛋白酶 | 西格玛-奥德里奇 | T9201-1G | |
| 鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂 | 罗氏 | 10109878001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红 (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| 未结合的裂叶山扁豆素 BSL-1 | Vector Laboratories | L-1100 | |
| 尿苷 | 西格玛-奥德里奇 | U3003-5G |
参考文献
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelinati....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
