方法文章

造型粘膜念珠菌在斑马鱼幼虫通过鳔注射

DOI：

10.3791/52182

⸱

2014年11月27日

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

本文内容

摘要

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在现有的脊椎动物宿主中，病原体和免疫防御在粘膜水平的体内时空相互作用不容易成像。这里介绍的方法描述了一个多功能平台，用于使用幼年斑马鱼的鱼鳔作为感染部位来研究活体脊椎动物的粘膜念珠菌病。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对粘膜病原体的早期防御由双方的上皮屏障和先天免疫细胞。两者的免疫竞争，他们的互通，是极为重要的保护，防止感染。上皮细胞和先天免疫细胞与病原体的相互作用被最佳研究在体内 ，其中复杂的行为展开在时间和空间。然而，现有的模式不允许与病原体战斗在粘膜水平易时空成像。

这里开发的模型创建粘膜感染通过直接注射的真菌病原体， 白色念珠菌 ，进入斑马鱼幼鱼的鳔的。所得感染使上皮和先天免疫细胞行为高分辨率成像贯穿粘膜病的发展。该方法的多功能性允许主机的询问来探测免疫事件导致的pH的详细序列agocyte招募和检查特定的细胞类型并在保护分子途径中的作用。此外，病原菌的免疫攻击的功能的行为可以同时使用荧光蛋白表达C.成像白色念珠菌 。所述宿主 - 病原体相互作用的增加的空间分辨率，也可以使用所描述的快速鳔夹层技术。

这里所描述的粘膜感染模型很简单，重现性好，使其成为粘膜念珠菌病的研究中一个有价值的工具。该系统还可以是大致平移的其他粘膜病原体如结核分枝杆菌，细菌或病毒的微生物，通常通过上皮表面感染。

引言

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由于上皮屏障受损，粘膜感染会导致危及生命的血流感染，上皮屏障使病原体能够进入全身环境1,2。此外，即使被外部控制，粘膜感染也会引起明显的免疫病理学3-5。共生单细胞真菌白色念珠菌存在于口腔和其他粘膜部位的大多数人群中6-9。虽然通常受到先天性和适应性免疫反应的控制，但先天免疫缺陷和医疗干预可导致严重的粘膜念珠菌病。对上皮屏障的攻击导致危及生命的播散性疾病和免疫病理学的风险增加，如外阴阴道念珠菌病，此外，白色念珠菌定植与肺免疫稳态有关10,11。播散性念珠菌病现在是重症监护病房中第四大最常见的血流感染12，死亡率高达 40% 使其成为一个主要问题。由于自身免疫性疾病、癌症或器官移植患者的免疫调节治疗增加，必须了解这种病原体与粘膜免疫隔室之间的相互作用。

关于白色念珠菌-粘膜水平细胞相互作用的大多数细胞生物学进展来自体外13-15 和小鼠模型16-18。这两种方法都有明显的优势，但在完整宿主中以高分辨率对活细胞进行成像的能力限制了感染的时间和空间特征。对于这些研究，需要一个体内模型，在该模型中，病原体、先天免疫和上皮细胞的相互作用可以在完整的脊椎动物宿主中可视化。

斑马鱼已成为了解人类疾病的宝贵工具，这主要是由于其透明度和对基因作的适应性。细胞和器官发育被详细成像，这导致了对新型免疫细胞行为的描述，例如发育中的胸腺中的 T 细胞行为19 或细胞内分枝杆菌和吞噬细胞之间的战斗20-22。最近的工作描述了斑马鱼的肠道微生物与宿主相互作用，并表明肠道的微生物定植会影响宿主肠道生理学和对其他感染的抵抗力23,24。此外，已针对几种病原体描述了通过肠道上皮的感染。

与肠道相比，鱼鳔代表了一种更加孤立和互补的粘膜模型。该器官是发育中的肠管的延伸，在肝脏和胰腺前方形成25,26。它产生表面活性剂、粘液和抗菌肽27,28，在解剖学和个体发育上，该器官被认为是哺乳动物肺的同源物29,30。由于气管仍然与斑马鱼的肠道相连，这使得浸入式感染自然发生。值得注意的是，唯一已知的念珠菌鱼类自然感染是鱼鳔中的白色念珠菌感染31。我们最近描述了一种实验性浸没感染模型，其中白色念珠菌感染鱼鳔，发现这种感染概括了白色念珠菌体外上皮相互作用的一些特征 32,33。

在此处介绍的方法中，通过将白色念珠菌直接注射到受精后 4 天 （DPF） 斑马鱼的鱼鳔中，改进了原始的浸没感染模型。这允许对感染进行精确的时间控制以及高度可重复的接种物。它允许进行详细的活体成像，再加上斑马鱼模型的多功能性。作为使用这种方法可以做什么的一个例子，我们展示了白色念珠菌生长的时空动力学以及中性粒细胞募集到感染部位。由于斑马鱼鱼鳔组织难以活体内成像，我们还提出了一种快速鱼鳔解剖技术，可提高荧光信号和显微分辨率。这些方法扩展了真菌、免疫学和水产养殖研究的工具箱，并描述了一种新的感染途径，该途径可以转化为模拟粘膜表面的其他真菌、细菌或病毒感染。

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方案

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注：所有斑马鱼护理协议和实验按照根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议A2012-11-03 NIH的指导方针进行。

1.斑马鱼饲养到4天受精后

  1. 收集AB斑马鱼，或任何其他的转基因系中，第一3小时受精后内，如图另一视频34。
  2. 120孵育鸡蛋含有150ml E3媒体15cm的培养皿（5毫米氯化钠，0.17毫米氯化钾，0.33毫米氯化钙2; 0.33毫米氯化镁2 2毫米的HEPES，pH值6.8）与亚甲蓝（0.3微克/毫升决赛浓度）在33°​​C培养箱12/12光/暗光周期。
  3. 6小时与E3 + PTU（1-苯基-2-硫脲，10微克/毫升最终浓度）后更换介质并除去死卵。
  4. 孵育4天，在33℃下，2天后交换用新鲜的E3 + PTU介质。

2.jection微针准备

  1. 拉硼硅毛细管（外径1.2毫米; ID0.69毫米）插入用针拔出器具有以下设置的微针（550热; 0拉; 130速度; 110时间）。
    注：设置将有所不同，从灯丝到灯丝，得到类似形状的微针晶（ 见图1），并将需要重新调整每当一个新的灯丝安装。
  2. 填充的微针与3微升的0.4微米过滤的磷酸盐缓冲盐水（PBS; 137mM的氯化钠; 2.7毫米氯化钾; 10毫的Na 2 HPO 4; pH值7.4; 1.8毫KH 2 PO 4）用20微升微加载移液器提示。
  3. 设置在连接到一压力喷射系统的显微上的微量夹持微针。设置注射压力到30 PSI和脉冲持续时间为30毫秒。
  4. 使用培养皿用蒸馏水，降低微针，直到针的1/5是在水中。夹在微针的WiTH略低于水位细镊子。使微针出来的水，并推踏板几次直到大丸剂出现。
  5. 通过降低上层叠用一滴类型的浸油血球微针测量丸药的直径。调整的脉冲持续时间，以获得所需的体积（ 见表1）。
  6. 为丸将背压保持稳定的油（降低的压力，如果推货量增加，增加的背压，如果药量减少）。记录脉冲的持续时间对于每个微针。
  7. 通过使用微加载枪头吸它从微针除去PBS中并排出遗留PBS中通过将其背面上的注射器和翻转的连续脉冲开关。保留每个微针。

3. 念珠菌准备

  1. 连胜白色念珠菌转化密码子优化dTomato，GFP，BFP，EOS或远端红色从冷冻的储存（-80℃的库存中的25％的甘油），使用无菌的木销钉到酵母peptine葡萄糖（YPD）琼脂板（10克/升酵母提取物，将20g / L的蛋白胨20克/升的葡萄糖20克/升琼脂;高压灭菌并倾25毫升在培养皿中），并孵育过夜，在30℃。
  2. 使用无菌木销钉挑选一个菌落，接种到5ml YPD液体（10克/升酵母提取物，将20g / L的蛋白胨20克/升葡萄糖的，高压灭菌并在无菌条件下等分在5毫升在16×150毫米的玻璃培养管）。
  3. 孵育过夜，在30℃的辊筒在60rpm。
  4. 收集1毫升C的白色念珠菌培养和移植到1.7毫升无菌离心管中。
  5. 离心机在5000 XG一对夫妇秒。清空上清液，彻底地加入1毫升无菌PBS，旋涡。重复此两次。
  6. 在无菌PBS 1000：通过稀释1毫升股票1计数使用血球殖民地。

4.注射在斑马鱼在鳔

  1. 用于在33℃的培养箱中30分钟，温热的注入培养皿（2％琼脂糖）。
  2. 在所需的时间，从含有鱼用25毫升吸管没有吸引任何斑马鱼来注入15厘米培养皿取出的150毫升E3 + PTU 100。
  3. 麻醉4单丝旦斑马鱼加入2毫升4毫克/毫升的缓冲三卡因甲磺酸库存（TR）至其余的50毫升介质（最终浓度200微克/毫升），并等待15分钟。
  4. 在解剖显微镜下，用一个充气的鳔鱼的选择。鱼，也可以在那个时候筛选均匀的表型，如在MPO中性粒细胞的分布：使用表面荧光解剖显微镜GFP线。
  5. 淡化C.白念珠菌库存从其原始浓度（ 步骤3.8），以1.5×10 7菌落形成每毫升（CFU / ml）的单元在PBS。
  6. 转移30斑马鱼上使用塑料移送管注入培养皿TTE并取出多余的介质。
  7. 用钓鱼线工具（0.012英寸直径的渔线超粘成硼硅毛细管），使3系的10条鱼，通过举办注射菜纵向和垂直定向的鱼。
  8. 取出多余的介质。
  9. 彻底涡管1.5×10 7 CFU /毫升C.白色念珠菌 。
  10. 填写一个微针3微升的C.使用白色念珠菌新的微加载枪头，并设置脉冲持续时间，以适当的设置（见步骤2.9）。
  11. 旋转注入培养皿进行的微针和鱼的头部之间20°的角度，针对向着鳔（ 图3A）的背面。
  12. 推微针插入鳔，确保针的孔是在管腔，并按下踏板一次。
  13. 重复每个鱼和充斥菜E3的转移到恢复盘（25毫升E3 + PTU）ð排空进入复苏菜。
  14. 另外30鱼转移到注塑菜。
  15. 重复注射了新的微针充满了彻底涡旋C.白色念珠菌 。
  16. 完成注射PBS对照，如果需要的话，使用不同的喷射盘以避免污染，并转移到一个单独的恢复盘（ 步骤4.10）。

5.筛选鱼的期望接种

  1. 制备40毫升0.4％低熔点琼脂糖溶液（LMA）加入160毫克低熔点琼脂糖至40的E3毫升，通过微波直至溶解，并冷却到37℃沸腾。添加400微升的TR（最终浓度200微克/ ml）的一次冷却的。
  2. 30分钟后恢复，如所述（ 步骤4.3仅使用1毫升TR入25毫升的E3 + PTU，最终浓度200微克/毫升）麻醉的鱼。
  3. 转让30鱼（用尽可能少的媒体越好）〜2毫升LMA的重量船。
  4. 抽吸个体鱼用移液管和板用1滴的LMA的鱼到96井板成像，仅​​使用10×6的中央的孔中。
  5. 重复，直到所有的鱼屏幕加载到成像板。
  6. 让媒体在室温下固化5分钟。
  7. 位置就在自己身边的鱼，确保他们在与玻璃底部接触。
  8. 使用20X客观上倒落射荧光/共聚焦显微镜和适当的过滤器，记录C.数量白色念珠菌酵母细胞中的每条鱼的鳔。
  9. 选择具有15-25酵母细胞的鱼在鳔（或期望的接种物），安乐死非选择鱼（TR在E3的800微克/毫升），并通过用50 E3 + PTU毫升选定鱼返回深培养皿加入3滴的E3到成像板选择的孔和用塑料移液管吸出鱼。
  10. 孵育在33℃下进行所需的持续时间。

6.成像鱼后筛选

  1. 在所需的时间，除去25的50毫升E3 + PTU介质从含有鱼图像深培养皿。
  2. 如所述（ 步骤4.3仅使用1毫升TR成25毫升E3 + PTU剩余，最终浓度200微克/毫升）麻醉的鱼。
  3. 鱼板放入96孔成像板和位置适当（ 步骤5.3 - 5.7）。
  4. 图像扫描使用适当的激光器和发射滤光片共聚焦显微镜。第一焦点上使用下微分干涉对比（DIC）的4X物镜鱼和取得的使用20X物镜与所述共焦激光扫描模式感兴趣区域的用2微秒/像素的速度和1024×600像素的宽高比的图像。收购Z-堆栈与1微米的步长，应用3帧的卡尔曼滤波模式。
  5. 返回到深培养皿用50毫升E3 + PTU或进入individua升井（24孔培养皿，3毫升E3 + PTU）和孵化在33°C。

7.剖析鳔

  1. 填有10毫升注射器利用高真空润滑脂。
  2. 准备2％LMA（ 步骤5.3琼脂糖8毫升E3 160毫克低熔点的）。
  3. 在所需的时间，麻醉鱼（ 步骤5.2）。
  4. 转移10鱼到1.7毫升离心管中，用1ml的E3，并通过添加200微升4毫克/毫升三卡因（最终浓度800微克/毫升）至离心管中，并温育15分钟，在室温下安乐死。
  5. 通过将4滴真空润滑脂中的正方形，1厘米相距上的MicroSlide（75×25毫米， 图2）制备成像载玻片。
  6. 将2滴2％LMA在广场中央。
  7. 将一条鱼在一个单独的载玻片在解剖显微镜下，并确认心脏已经停止了跳动，去除多余的水分。
    8. 使用细镊子解剖鳔通过保持头中与左镊子的固定位置和向下拉动前肠与右镊子（ 图4A）。
  8. 拿起鳔通过气动导管与左镊子，它从消化道分离，并且将其放置在2％的LMA的中心其固化之前。
  9. 放置盖玻片（18×18 mm）公摄像载玻片的顶部并推动它直到它触及真空润滑脂以及向LMA（ 图2）。
  10. 在清扫10分钟的图像，如步骤6.4中所述。重复步骤7.7 - 7.11与其他鱼类。

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结果

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在注射后鳔

这里介绍的实验方法描述在注射C的一致剂量白念珠菌的酵母细胞在4鳔DPF斑马鱼。以前的工作与浸入式模型表明，到C的鳔免疫反应白色念珠菌是类似于哺乳动物粘膜念珠菌32。在这里，我们展示了修改后的感染的方法是比较简单的，重复性好，快速;几百斑马鱼的可以注射和内几个小时进行筛选。

所述鳔的准确和可重复的感染是由显微注射靶向器官的后部区域来完成的。注入鳔是更容易学习比幼虫或胚胎斑马鱼（ 如静脉或后脑心室），其他大多数显微注射路线。鱼注射前的准备是西米拉尔到，对于其他注射部位，不同之处在于在鳔需要被充气所以鱼是老年人。大约75％的在33℃下所提出的鱼有一个膨胀鳔由4旦（数据未显示）。需要被斜切的鳔位于下用于注入鱼的表皮以及薄肌肉层和微针。在该鱼被注入的角度（ 图3A）也大大改善了过程的速度和易用性。喷射弹丸在鳔的背面的是重要的，因为它允许所有筛选当酵母细胞的可视化，并且避免酵母细胞对鳔两侧的...

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讨论

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在鳔显微注射疾病模型的研究进展和限制

这里提出的模型是在Gratacap 等人描述的粘膜念珠菌浸没模型的扩展（2013）。它增加了一个控制感染时间的优点，一个高度重复性感染的剂量，并因此提高效率。我们在这里表明，允许感染动力学的非常详细的非侵入性颞文档以及鳔的更高分辨率离体成像的新方法。这些程序应有利于C的研究白色念珠菌 -innate免疫系统的相互作用动力学的黏膜。粘膜感染车型数量有限，在斑马鱼进行了描述，都局限于消化道紊乱/感染24,43。这里提出的鳔模型扩展感染的位点，以共享一些相似之处至肺，并提供一个密闭部位的器官感染，对病原体较少可能性被冲走。

存在必须掌握这些技术时必须考虑到几个重要的因素。最重要的一点是用于充气鳔的要求。这就要求鱼被老化至5旦在28℃或4单丝旦在33℃。当饲养这个较高的温度用于加速鱼的发育和更好近似生理范围的哺乳动物上皮温度（小...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者感谢乐郑氏博士和博士托宾慷慨地提供了α-catenin的：黄水晶鱼线和比尔·杰克曼允许我们做的拍摄在他的实验室。作者承认的资金来源国立卫生研究院（资助5P20RR016463，8P20GM103423和R15AI094406）和美国农业部（项目＃ME0-H-1-00517-13）。此稿件发布为主要农林试验站出版物号3371。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 ml管AxygenMCT-175-C
深培养皿Fisher Scientific89107-632
移液管Fisher Scientific13-711-7M
酵母提取物VWR Scientific90000-726
蛋白胨VWR Scientific90000-264
葡萄糖Fisher ScientificD16-1
琼脂VWR Scientific90000-760
细镊子 （Dumont Dumoxel #5）精细科学工具11251-30
木销VWR Scientific10805-018
低熔点琼脂糖VWR Scientific12001-722
火焰棕色微量移液器拉拔器Sutter InstrumentsP-97
硼硅酸盐毛细管Sutter InstrumentsBF120-69-10
MPPI-3 进样系统Applied Scientific InstrumentationMPPI-3
背压装置Applied Scientific InstrumentationBPU
微量移液器支架套件Applied Scientific InstrumentationMPIP
脚踏开关Applied Scientific仪器FSW
显微作器Applied Scientific InstrumentationMM33
磁性底座Applied Scientific Instrumentation磁性底座
三卡因甲烷磺酸盐Western Chemical Inc.MS-222
解剖显微镜奥林巴斯SZ61 顶部 SZX-ILLB2-100 基座
共聚焦显微镜奥林巴斯IX-81 配备 FV-1000 激光扫描共聚焦系统
20 倍显微镜物镜奥林巴斯UPlanSApo 20x/0.75
滚轮滚筒New Brunswick ScientificTC-7
Microloader 移液器吸头Eppendorf930001007
玻璃培养管 （16 x 150 mm）VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES（康宁）VWR ScientificBDH4520-500GP
儿童粘土 （Play-Doh）孩之宝
CaCl2Fisher ScientificC69-500
亚甲蓝VWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
培养皿Fisher ScientificFB0875712
血细胞计数器 （Hausser scientific）VWR Scientific15170-172
A 型浸油Blue Marble Products51935
离心机Eppendorf5424
涡旋精灵VWR Scientific14216-184
琼脂糖 （Lonza）VWR Scientific12001-870
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
钓鱼线Stren
96 孔成像板（Sensoplate）Greiner Bio-One655892
高真空润滑脂（道康宁）VWR Scientific59344-055
微玻片 （25 x 75 mm）VWR Scientific48300-025
盖玻片 （18 x 18 mm），No 1.5VWR Scientific48366-045
15 cm 培养皿（奥林巴斯塑料）Genesee Scientific32-106
甘油（EMD 化学品）VWR ScientificEMGX0185-5
24 孔培养皿（奥林巴斯塑料）Genesee Scientific25-107
配重船 （8.9 cm）VWR Scientific89106-766

参考文献

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