需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

16.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52184

⸱

2014年12月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CREA, Diagnostics Department, Spedali Civili di Brescia

本文内容

摘要

本文介绍了一种同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）的方法。TREC/KREC检测可作为胸腺和骨髓输出功能的标志物。

摘要

T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）是在T细胞和B细胞受体形成过程中，通过基因重排产生的环状DNA片段。由于TRECs和KRECs无法自我复制，每次细胞分裂后其数量都会被稀释，因此它们在细胞中持续存在。外周血中TRECs和KRECs的数量可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。通过将已建立并广泛应用的TREC检测方法与改良版KREC检测方法相结合，我们开发了一种双重定量实时PCR技术，可在单次检测中同时定量新生成的T淋巴细胞和B淋巴细胞。TREC和KREC的数量通过标准曲线获得，该标准曲线由含有TREC和KREC信号连接区的细菌质粒进行系列稀释制备，同时包含一段T细胞受体α链恒定区基因片段作为参考基因。结果以每106个细胞或每毫升血液中TREC和KREC的数量表示。这些DNA片段的定量检测已被证实可用于监测儿童和成人造血干细胞移植后的免疫重建过程，有助于更准确地表征免疫缺陷疾病，或更深入地理解某些免疫调节药物的作用机制。

引言

T细胞受体切除环（TRECs）和κ基因删除重组切除环（KRECs）是分别在部分T细胞和B细胞中，于基因组DNA重组过程中被切除的小型环状DNA片段，该过程导致T细胞和B细胞受体高度多样化的库的形成。这些环状DNA无明确功能，但由于其结构稳定且无法复制，每次细胞分裂后会被稀释，仅保留在两个子代细胞中的一个。因此，外周血中TRECs和KRECs的水平可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。

尽管TREC检测在过去15年中已广泛用于评估胸腺输出水平1，而KREC检测最初是为测量B细胞增殖及其在健康和疾病状态下对B细胞稳态的贡献而开发的2，但直到最近才被提议作为骨髓输出的标志物3,4。本文中，我们描述了所建立的用于同时定量TREC和KREC的方法4。

通过这种联合方法，使用含有TREC、KREC和T细胞受体α恒定区（TCRAC）基因片段的三插入质粒，以1:1:1的比例稀释制备单一标准曲线，从而消除了实时PCR法DNA定量相关的变异性。这使得对TREC和KREC拷贝数的评估更加准确。此外，在同一反应中同时定量两个靶标还可降低试剂成本。

所提出的TREC/KREC检测可用于测量患有严重联合免疫缺陷（SCID）4、常见变异型免疫缺陷5、自身免疫性疾病6-8以及HIV感染9的儿童或成人中T细胞和B细胞新生的程度。此外，该检测还可用于监测造血干细胞移植10、酶替代治疗11以及抗病毒9或免疫调节治疗6-8后的免疫系统重建情况。最后，由于无论潜在的遗传缺陷如何，均可通过TREC检测识别SCID患者，而无丙种球蛋白血症患者可通过KREC定量检测被发现，因此TREC/KREC检测也可用于新生儿筛查项目中免疫缺陷病的检出12。在此情况下，检测必须在从滤纸上采集并干燥的微量血斑中提取的DNA上进行，且必须对目标疾病具有高灵敏度和特异性，同时具备高度可重复性和成本效益。

在检测中引入KREC定量分析应能提高对免疫缺陷病进行新生儿筛查的性能。自2008年威斯康星州率先在其产后筛查项目中开展TREC分析以来，这项筛查已在美国部分地区（WI、MA、CA）常规实施。13

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：伦理声明：本方案遵循本机构布雷西亚市民医院的指导方针

1. “三重插入”质粒的制备

  1. 选择和准备合适的起始材料：
    1. 获取含有极可能通过 PCR 检测到 TRECs 和 KRECs 的细胞样本，例如采集到 EDTA 管中的健康年轻受试者的外周血。
      注：最初，我们使用胸腺细胞检测 TRECs，使用扁桃体碎片中的单个核细胞检测 KRECs，但健康个体通常含有足够量的 TRECs 和 KRECs，足以通过 PCR 检测。因此，外周血应是一种有效且更易获取和操作的替代样本。考虑到 TRECs 尤其会随健康成年人年龄增长而减少，建议使用年轻成人甚至儿童的外周血。
    2. 采用标准密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。
  2. DNA 提取：
    1. 使用商业化的 DNA 血液微量提取试剂盒从 PBMC 中提取 DNA。按照制造商说明书操作，并进行如下所述的少量修改。
      1. 将样品在 70 °C（而非 56 °C）下以 1,400 rpm 振荡孵育 10 分钟。
      2. 向柱中加入预热至 70 °C 的洗脱缓冲液，在 70 °C 孵育 5 分钟，然后按照制造商说明书通过离心洗脱 DNA。通过 260/280 nm 处的分光光度法测定提取 DNA 的浓度。
  3. 构建含有 TREC 和 KREC 信号接头（SJ）以及 TCRAC 参考基因插入片段的质粒：
    1. 使用针对 TRECs、KRECs 和 TCRAC 的特异性引物（见表 1），对从 PBMC 提取的 DNA 进行扩增，以获得 TREC-SJ、KREC-SJ 和 TCRAC 片段。
      注：KREC 和 TCRAC 特异性引物的 5’端含有 HindIII 和 SpeI 限制性酶切位点（在表 1所示序列中为小写字母），并带有适当数量的侧翼附加核苷酸（以斜体标示）；这些特征在经典的 KREC 和 TCRAC 序列中并不存在。
TRECs上游引物5’-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3’
下游引物5’-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3’
KRECs上游引物5’-CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3’
下游引物5’-CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3’
TCRAC上游引物5’-Gac tag tAT GAG ACC GTG ACT TGC CAG-3’
下游引物5’-Gac tag tGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3’

表1. 克隆实验所用引物。 5'-端小写字母表示对应限制性内切酶识别位点的核苷酸，斜体字母表示额外添加的侧翼核苷酸。

    1. 在最终体积为 25 μl 的体系中进行 PCR 反应，反应体系包含 1x Buffer II、1.5 mM MgCl2、dNTP 混合物（每种 200 µM）、引物（终浓度为 900 nM）、AmpliTaq DNA 聚合酶（2.5 U/25 μl）以及 100 ng DNA。
    2. 采用以下 PCR 程序：95 °C 预变性 10 分钟；随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。PCR 产物长度应为：TRECs 380 bp，KRECs 166 bp，TCRAC 381 bp。
    3. 将 TREC-SJ 的 PCR 产物插入 pCR2.1-TOPO 载体的 T-A 接受位点。按照细胞说明书提供的方案，通过热激法将质粒 DNA 转化至 XL1-blue 感受态细胞。在因氨苄青霉素抗性而生长的菌落中，筛选携带插入片段的菌落（因 β-半乳糖苷酶互补功能丧失而呈白色），并将其接种至主培养皿中。最后通过 PCR 鉴定含有 TREC 片段的菌落。
    4. 挑取一个阳性菌落进行扩增，并使用质粒小提试剂盒按照制造商说明书纯化质粒 DNA。用 SpeI 限制性内切酶对质粒 DNA 和 TCRAC 扩增产物进行酶切，随后将 TCRAC 片段连接至 SpeI 酶切位点。
    5. 将重组质粒 DNA 转化至 XL1-blue 细胞，并通过 PCR 鉴定含有 TCRAC 片段的菌落。挑取一个阳性菌落进行扩增，并使用质粒小提试剂盒纯化质粒 DNA。
    6. 用 HindIII 酶切质粒 DNA 和 KREC 扩增产物，将 KREC-SJ 片段克隆至 HindIII 酶切位点。将质粒 DNA 转化至 XL1-blue 细胞，并通过 PCR 鉴定含有第三个插入片段的菌落。
    7. 通过直接测序验证三个插入片段的存在及无突变情况。最终三重插入质粒的图谱见图 1。

基因组DNA序列分析；包含KREC、TCRAC、TREC重组序列的质粒图谱。
图1. 三插入片段质粒图谱。三插入片段质粒图谱，显示TREC、KREC、TCRAC序列的位置及限制性内切酶位点。请点击此处查看该图的高清版本。

    1. 扩增一个已鉴定的菌落，使用质粒中量提取试剂盒纯化质粒DNA。通过260/280 nm处的分光光度法测定质粒DNA浓度，并通过凝胶电泳检测DNA质量。将适量质粒分装后于-80 °C保存（例如，每份50 μl）。

2. 标准曲线制备

注意：所有稀释步骤均须在专用于防止 DNA 污染的区域中，使用 0.1x TE 缓冲液进行配制。

  1. 计算目标质粒拷贝数的质量（参见表2），需考虑质粒大小为4,846 bp，每个碱基对的平均质量为1.096 × 10-21 g/bp，因此：mp = (4,846 bp) × (1.096 × 10-21 g/bp) = 5,311.216 × 10-21 g = 5.311 × 10-18 g。
拷贝数x 5.311 x 10-18 g质粒DNA质量 (g)
1 x 1065.311 x 10-12
1 x 1055.311 x 10-13
1 x 1045.311 x 10-14
1 x 1035.311 x 10-15
1 x 1025.311 x 10-16

表2. 每个标准曲线稀释点所需的质粒质量。

  1. 通过将所需质粒质量除以每反应中要移取的体积（5 μl）来计算质粒DNA的浓度（见表3）。
质粒DNA质量 (g)÷ 5 μl质粒DNA终浓度 (g/μl)
5.311 x 10-121.062 x 10-12
5.311 x 10-131.062 x 10-13
5.311 x 10-141.062 x 10-14
5.311 x 10-151.062 x 10-15
5.311 x 10-161.062 x 10-16

表3. 每个稀释点所需质粒浓度的计算。

  1. 解冻一份质粒。线性化 2 μg 用XhoI酶切质粒DNA，并在260/280 nm处通过分光光度法测定其浓度。
  2. 制备线性化质粒DNA的适当稀释液，以获得便于起始操作的工作浓度溶液（例如， 100 ng/μl = 0.1 μg/μl = 1 × 10-7 克/μl). 将剩余的线性化质粒 DNA 储存于 -80 °C.
  3. 进行适当次数的1:10或1:100稀释，将质粒浓度调整至更易操作的1 x 10-10 克/μl.
  4. 使用公式 C1V1 = C2V2 用于计算稀释体积（V2 – V1) 用于制备系列标准曲线第一个点（1 × 106 拷贝数，对应于 1.062 x 10-12 克/5 μl；参见 表 4).
初始浓度 (g/μl) 质粒 DNA 体积 (μl) 稀释液体积 (μl) 终体积 (μl) 终浓度 (g/μl) 每 5μl 质粒 DNA 的最终拷贝数 
C1V1V2-V1V2C2
1 x 10-7 5 μl45 μl50 μl1 x 10-8N/A
1 x 10-85 μl495 μl500 μl1 x 10-10N/A
1 x 10-105 μl465 μl470 μl1.062 x 10-121 x 106
1.062  x 10-1250 μl450 μl500 μl1.062 x 10-131 x 105
1.062  x 10-1350 μl450 μl500 μl1.062 x 10-141 x 104
1.062  x 10-1450 μl450 μl500 μl1.062 x 10-151 x 103
1.062 x 10-1550 μl450 μl500 μl1.062 x 10-161 x 102

表4. 稀释计算。

  1. 进行一系列常规的1:10梯度稀释，以获得标准曲线的其余点。
    注意：每次进行下一步稀释前，务必短暂涡旋振荡每种质粒稀释液。
    注意：标准曲线的最高稀释度（10拷贝/5 μl）必须在进行检测前立即配制，因为如此微量的质粒DNA稳定性不足，无法长期保存以供后续使用。
  2. 将三种质粒的稀释液分装于不同的离心管中，于-80 °C保存至使用。稀释后的三重质粒DNA在至少6个月内高度稳定。

3. 从目标样本中提取 DNA

  1. 采用密度梯度分离法，从收集于EDTA管中的外周血中分离PBMC。
    注意：也可使用其他合适的起始材料（例如，分选的淋巴细胞亚群、全血）作为目标样本。
  2. 按照步骤1.2所述方法，从目标样本的PBMC中提取DNA。

4. 用于TRECs和KRECs定量的实时PCR

  1. PCR板的准备与加样：
    1. 准备一个PCR板，为每个待分析样本设置至少两个重复孔：标准曲线（A→F 1→4）、阳性对照（CTRL+；G1→4）和无模板对照（NTC；H 1→4）。
      注意：参见表5中的典型布局，但也可设计其他格式。请注意，TRECs和KRECs将在同一孔中共同扩增，与TCRAC的孔分开。
TRECs+KRECsaTCRACbTRECs+KRECsTCRACTRECs+KRECsTCRAC
123456789101112
A106 拷贝106 拷贝106 拷贝106 拷贝11119999
B105 拷贝105 拷贝105 拷贝105 拷贝222210101010
C104 拷贝104 拷贝104 拷贝104 拷贝333311111111
D103 拷贝103 拷贝103 拷贝103 拷贝444412121212
E102 拷贝102 拷贝102 拷贝102 拷贝555513131313
F10 拷贝10 拷贝10 拷贝10 拷贝666614141414
GCTRL+CTRL+CTRL+CTRL+777715151515
HNTCNTCNTCNTC888816161616

表5. 实时PCR反应板示例。

    1. 计算所需的总孔数（额外增加 1 - 2 孔以弥补可能的移液误差），并分别配制TRECs/KRECs和TCRAC的预混液（见表6）。
      注意：TRECs、KRECs和TCRAC特异性引物和探针见表7。引物和探针的终浓度分别为900 nM和200 nM。
TRECs/KRECsTCRAC
H2O2 μlH2O4.75 μl
KRECs 正向引物（20 pmol/μl）1.125 μlTCRAC 正向引物（20 pmol/μl）1.125 μl
KRECs 反向引物（20 pmol/μl）1.125 μlTCRAC 反向引物（20 pmol/μl）1.125 μl
KRECs 探针（10 pmol/μl）0.5 μlTCRAC 探针（10 pmol/μl）0.5 μl
TRECs 正向引物（20 pmol/μl）1.125 μl2x TaqMan Universal PCR Master Mix12.5 μl
TRECs 反向引物（20 pmol/μl）1.125 μl
TRECs 探针（10 pmol/μl）0.5 μl
2x TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 μl

表6. 指定孔所需的试剂体积。

TRECs上游引物5’-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3’
下游引物5’-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3’
探针5’-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3’
KRECs上游引物5’-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
下游引物5’-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3’
探针5’-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC上游引物5’-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3’
下游引物5’-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
探针5’-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3’

表7. 实时PCR检测中引物和探针的序列。

    1. 向每个反应混合物（TRECs/KRECs 和 TCRAC）中加入 20 µl。离开试剂准备室前，用光学粘性封膜密封反应板。
    2. 在核酸提取室中，揭开粘性封膜，向各孔中加入 5 µl 基因组 DNA 样本（400 - 500 ng）。向 CTRL+ 孔中加入 5 µl 基因组 DNA（即从脐带血 PBMC 提取的 DNA）。
      注意：除脐带血外，也可使用来自已知阳性外周血样本或样本池的 DNA，或通过将确定量的三插入质粒与 TREC 和 KREC 阴性细胞系的基因组 DNA 混合，制备“人工”阳性标准品。
    3. 向 NTC 孔中加入 5 µl 水。再次用光学粘性封膜密封反应板。
    4. 转移至可防止质粒 DNA 污染的区域；仅在使用前解冻质粒 DNA 标准曲线的每个稀释点，并制备最高稀释度（10 拷贝/5 µl）。仅揭开 A→H 1→4 孔的粘性封膜，向各孔加入 5 µl 对应稀释点的质粒 DNA 标准品。再次密封粘性封膜。
    5. 检查孔底部是否存在气泡，确保试剂完全沉降至孔底。
    6. 在实时 PCR 系统上运行检测。标准程序包括：50 °C 孵育 2 分钟，95 °C 初始加热 10 分钟，随后进行 45 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，以及 60 °C 引物/探针退火与延伸 1 分钟。
    7. PCR 程序结束后保存数据。
      注意：为避免 DNA 交叉污染，在设置实时 PCR 检测时，请遵循定量 PCR 的常规良好实验室规范：在不同区域/房间分别进行核酸提取、试剂准备、质粒操作和扩增反应；使用独立的移液器；根据需要更换手套和实验服。
  2. 结果与计算：
    注意：以下步骤基于我们使用《材料表》中所述实时 PCR 仪器配套软件的经验，但通常也适用于其他实时 PCR 分析平台和软件。请注意，即使使用相同软件，通常也有多种方式执行所需操作（例如 图标、快捷键）。
    1. 在软件中打开保存的结果文件，点击“结果”标签页。在窗口顶部点击“分析”菜单，选择“分析设置”。通过选择“所有”检测器和“自动 Ct”（Ct = 阈值循环），让软件自动确定阈值。默认情况下，让软件设置“自动基线”以消除背景信号。
    2. 点击“扩增曲线”标签页，在窗口最右侧的下拉菜单中选择三个“检测器”之一（例如 从 TRECs 开始）。在其下方选择“手动 Ct”以手动设置阈值；转至窗口下部，选择对应检测器的标准曲线稀释点所在的孔，以显示扩增曲线。只需在表格中点击并拖动鼠标选择相应单元格即可。
      1. 如需手动调整阈值，上下拖动红色阈值线，然后点击“分析”以重新分析结果。为检查阈值设置对结果的影响，切换至“报告”标签页，查看相应标准曲线稀释点的 Ct 值。调整阈值时，请尽量遵循以下建议以实现最佳设置。
      2. 返回“扩增曲线”标签页，确认阈值位于指数扩增区域，且明显高于背景噪声但低于平台期。若扩增曲线未以对数刻度显示，可右键点击图表调出“图形设置”，将运行后 Y 轴设置为“log”，将阈值置于曲线线性部分的中点，并观察各扩增曲线是否大致平行。
      3. 点击“报告”标签页查看 Ct 结果。确保阈值设置使每个标准曲线稀释点的两个重复孔结果具有最大精确度。
      4. 检查阈值是否设置在最能反映标准曲线稀释点极端数量级的位置（最佳灵敏度）。对剩余两个检测器（KRECs 和 TCRAC）重复步骤 4.2.2及后续子步骤。
      5. 进入“报告”标签页，再次在窗口下部的表格中拖动鼠标，选择所有检测器（TRECs、KRECs、TCRAC）标准曲线对应孔。确认三个靶标在同一稀释点的 Ct 值非常接近（例如 差异不超过 0.5 Ct）。如有需要，重新调整阈值并再次检查。
        注意：由于三插入质粒每个靶标仅含单拷贝，理论上扩增比例应接近 1:1:1。在某些情况下，可能需要手动调整一个或多个检测器的基线以获得更佳结果。只需重新调出“分析设置”窗口，选择需调整的检测器，设置“手动基线”，并自定义起始和终止循环数（通常为 3 至 15）。然后点击“确定并重新分析”，并重新检查前述各项。
    3. 仅在确认以下条件后，方可接受该实验批次：
      1. 点击“报告”标签页，进入窗口下部，选择 NTC 孔并确认其对应 Ct 值为“Undet”（即 NTC 孔无扩增信号）。
      2. 选择“标准曲线”标签页，查看图表窗口右侧，从下拉菜单中选择检测器，确认报告的标准曲线斜率在 -3.55 至 -3.32 之间（对应 PCR 效率为 91 - 100%）。
      3. 通过读取斜率和截距下方的数值（在同一“标准曲线”标签页中，选择每个检测器后），确认决定系数（R2）高于 0.998（图 2）。
        注意：需特别关注极端稀释点，因其偏离可能更容易影响斜率（对回归线具有较高“杠杆”效应）。尤其需注意，最高浓度质粒稀释液可能比预期更快降解。但只要条件允许，建议不要轻易剔除这些点，因为可合理地将 100 视为定量检测限：即对于 10 至 100 之间的样本，结果可报告为 <100 或“阳性但不可定量”；若超出曲线范围（<10），则可报告为 0 或“不可检测”。
        注意：保留以往标准曲线稀释点的 Ct 值档案可能有助于计算每个稀释点的平均值，作为未来实验的参考范围或内部质量控制依据（例如 计算均值和标准差以构建 Shewhart 控制图）。类似地，保留阳性对照以往 Ct 值的档案也可能有所帮助。

TREC、KREC 和 TCRAC 对数浓度图，含线性回归方程及 R 平方值。
图 2. TRECs、KRECs 和 TCRAC 的标准曲线。 TRECs（A）、KRECs（B）和 TCRAC（C）的标准曲线点图及对数回归线估计图用于验证是否符合理想的指数扩增速率（斜率 = 3.32），该速率对应 100% 的扩增效率。Ct：阈值循环；R2：决定系数。 请点击此处查看该图的高清版本。

      1. 单击“Report”（报告）选项卡，核对阳性对照的 Ct 值（可在图表下方对应表格单元格中找到）是否与之前使用相同已知阳性对照所获得的检测结果一致。
        注意：“Report”（报告）选项卡显示的是软件根据相应的标准曲线，通过插值法从设定好阈值和基线后的 Ct 值计算得出的样本中 TRECs、KRECs 和 TCRAC 含量（若重新设定阈值或基线进行分析，结果将发生变化）。要查看插值在标准曲线上的具体位置，可切换至“Standard Curve”（标准曲线）选项卡，选择目标孔位，并观察回归线上出现的黑色“X”标记，其纵坐标值即为插值得到的数量。若始终使用相同的阳性对照，可根据以往测定的阳性对照数值建立相应的参考范围和/或质量控制图。
    2. 单击“File”（文件）菜单，选择“Save”（保存），然后选择“Export”（导出）为 .csv 文件，以将所有孔位的定量结果导出为包含逗号分隔值的文本文件。
    3. 将 .csv 文件导入电子表格软件，并通过设置以下公式，计算每 106 个 PBMC 中 TRECs 或 KRECs 的数量：[(TRECs 或 KRECs 的平均含量) / (TCRAC 平均含量 / 2)] × 106
      注意：TCRAC 平均含量需除以 2，因为每个细胞中含有两个 TCRAC 基因拷贝，e.g., 每条染色体各一个。
      注意：可参考阳性对照最终 TRECs 和 KRECs 数量的一致性，但需注意，由于标准曲线稀释点引入的额外变异性，数值不会完全一致。若出现显著偏差，可能需要重复实验。同样，可建立控制图以设定合适的参考范围。
    4. （可选，但推荐）若已知全血细胞计数结果，可使用以下公式计算每毫升血液中 TRECs 或 KRECs 的数量：
      (TRECs 或 KRECs 每 1 × 106) × (每毫升血液中淋巴细胞与单核细胞总数) / 106 = 拷贝数/毫升。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在87名健康对照者（42名0至17岁儿童（男性/女性：25/17）和45名24至60岁成人（男性/女性：29/16））的代表性样本中进行了检测。结果以每106个PBMC中的TREC和KREC数量表示，随后计算出每毫升血液中的TREC和KREC数量。

由于胸腺退化，TREC 的数量随年龄增长而减少4，特别是在0至3-4岁期间急剧下降。在成人中，TREC 数量还与性别有关，因其在男性中的下降速度比女性更快5。这可能在设定适当的参考范围时带来问题，若需对正常值进行非常精确的估计，则应根据年龄并可能结合性别进行区分。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

TREC 和 KREC 的定量可作为评估近期胸腺和骨髓输出功能的良好指标，但需考虑一些注意事项。尽管采用标准曲线的绝对定量方法需要更多的试剂以及占用更多的实时 PCR 反应板空间，但由于未知样本的量是通过已知起始量构建的标准曲线进行插值计算，因此该方法能够确保高度准确的定量结果。此外，该方法更适用于检测低丰度的目标分子。从方法学角度来看，一个关键问题是对应标准曲线各点的冻存质粒稀释液可能比预期更快降解。因此，每次实验前都需要从最初保存的质粒重新制备新的稀释液，尤其是最高稀释度的样本。在最终计算中，以淋巴细胞加单核细胞计数来估算外周血单个核细胞（PBMC）数量时，若存在不完全等效的情况，可能会在每 106 个细胞与每毫升血液之间的数值换算中引入一定偏差。可通过直接从全血提取的已知量 DNA 中测定两个目标物（TRECs 和 KRECs）的量来改进该方法，从而无需进行单核细胞与淋巴细胞计数14。在此特定情况下，严格来说无需使用参考基因进行定量，但可将其作为 DNA 质量和数量的额外质控指标。

结果解读可能受到一些因素的影响。首先，应考虑到参考...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 ML密度梯度分离法
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)QIAGEN51106DNA 提取
未修饰 DNA 寡核苷酸 HPSF 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l 将冻干产物重悬至 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA 聚合酶：包含 10x Buffer II 和 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP 混合液 (100 mM)Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
用于亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒Invitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue 亚克隆级感受态细胞Stratagene200130
PureYield 质粒小量提取系统PromegaA1223
SpeI 500UNew England BiolabsR0133S
HindIII-HF 10,000 UNew England BiolabsR3104S
PureYield 质粒中量提取系统PromegaA2492
XhoI 5,000 UNew England BiolabsR0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTASigma Aldrich SRLE5134
TE 缓冲液 (1 mM TRIS 和 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR 主混合液Applied Biosystems/Life-Technologies4364338
双标记探针 HPLC 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l 将冻干产物重悬至 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c 分光光度计ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 热循环仪Applied Biosystems/Life-Technologies4359659
Fast 7500 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS 序列检测软件 1.4Applied Biosystems/Life-Technologies

参考文献

  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
  2. Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
  3. Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
  4. Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
  5. Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
  6. Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
  7. Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
  8. Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493(2012).
  9. Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94(2012).
  10. Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188(2013).
  11. Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
  12. Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
  13. Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
  14. Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
  15. De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

TREC KREC 定量实时 PCR 检测胸腺骨髓输出双重定量 PCR标准曲线制备外周血单个核细胞TCR α 恒定区基因免疫重建监测
通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。