方法文章

T细胞受体删除环同时定量（TRECs）和K-删除重组删除环（KRECs）通过实时PCR

DOI：

10.3791/52184

⸱

2014年12月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CREA, Diagnostics Department, Spedali Civili di Brescia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们描述了一种同时定量 T 细胞受体切除环 （TREC） 和 K 缺失重组切除环 （KREC） 的方法。TREC/KREC 测定可用作胸腺和骨髓输出的标志物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T 细胞受体切除环 （TREC） 和 K 缺失重组切除环 （KREC） 是在重组过程中形成的环状 DNA 元件，可产生 T 细胞和 B 细胞受体。 由于 TREC 和 KREC 无法复制，因此它们在每次细胞分裂后都会被稀释，因此会持续存在于细胞中。 它们在外周血中的含量可以被认为是胸腺和骨髓输出量的估计值。通过将成熟且常用的 TREC 检测与 KREC 检测的改良版本相结合，我们开发了一种双重定量实时 PCR，允许在单次检测中定量新产生的 T 和 B 淋巴细胞。TREC 和 KRECs 的数量是使用通过连续稀释细菌质粒中克隆的 TREC 和 KREC 信号接头以及用作参考基因的 T 细胞受体 α 恒定基因片段制备的标准曲线获得的。结果报告为 TREC 和 KREC 的数量/106 个细胞或每毫升血液。这些 DNA 片段的定量已被证明可用于监测儿童和成人骨髓移植后的免疫重建，以改善免疫缺陷的表征，或更好地了解某些免疫调节药物活性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T细胞受体删除环（TRECs）和K-删去重组切除圆（KRECs）是切下在T细胞和B细胞，分别在基因组DNA重组过程中的比例小环化的DNA分子，从而导致形成T形的一个高度多元化剧目和B细胞受体。他们没有的功能，但因为它们是稳定的，并且不能被复制，它们稀释每次细胞分裂后，从而持续仅在两个子细胞中的一个。因此，它们在周边血液水平可以假定为胸腺和骨髓输出的估计。

而TREC测定已大量使用在过去15年来评价胸腺输出的范围内，1 KREC测定，这是最初开发用于测量B细胞增殖和B细胞稳态在健康和疾病的贡献，2-已经是最近才提出作为骨质米的标记箭头的输出。3,4在这里，我们描述我们开发了既TRECs和KRECs的同时定量的方法。4

与此相结合的方法，通过实时PCR关联到DNA的定量变异是通过使用通过稀释含有TRECs，KRECs和T细胞受体的α常数的片段三重插入片段的质粒而获得的独特标准曲线（TCRAC），去除基因在以1：1：1的比例。这允许的TREC和KREC拷贝数的更准确的评价。此外，在相同的反应中的两个目标的同时定量能够降低试剂成本。

所提出的TREC / KREC测定可以是有用的测量T-的程度和B细胞的新生产的儿童或成人重症联合免疫缺陷（SCID），4-普通变异型免疫缺陷，5自身免疫性疾病，6-8和HIV感染9此外，它可以用于监测造血干细胞移植，10酶替代，11和抗病毒药9或免疫调节疗法后免疫恢复6-8最后，因为SCID病人正在使用的TREC测定尽管潜在的遗传缺陷识别，丙种球蛋白血症患者可使用KREC量化被识别中，TREC / KREC测定也可以用于检测免疫缺陷在新生儿筛查计划。12在这种情况下，该测试必须对DNA从血液涂抹小斑点萃取执行，并且在滤纸上干燥，必须是高度敏感和特异的目标疾病，以及高度重复性和成本效益。

KREC定量测试中的引入应该改善新生儿筛查的免疫缺陷，这经常被美国（WI，MA，CA）自2008年以来的一些地方进行表演时，威斯康星州成为第一个引种TRECs电子在其出生后的筛查方案的分析。13

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注：伦理学声明：此协议符合我们的机构，Spedali Civili di Brescia酒店的指引

1.准备一个“三将”质粒

  1. 选择和制备合适的起始物质：
    1. 获得含有细胞很容易有TRECs和KRECs检测的PCR技术，如收集到EDTA管中，年轻健康受试者的外周血样品。
      注：最初，我们已经开发了使用胸腺细胞对TRECs和单核细胞从扁桃体片段为KRECs的方法，但健康受试者通常具有TRECs和KRECs足以允许它们的检测通过PCR的量。因此，外周血应是一个有效的替代方案中，更容易获得，并进行工作。考虑到TRECs，特别是减少与年龄的健康成人，外周血从年轻的成人，如果不从一个儿童，被劝告。
    2. 独立外周血mononuc利尔细胞（PBMC）通过标准密度梯度分离方法。
  2. DNA提取：
    1. 使用商业DNA血液迷你试剂盒提取DNA PBMC。按照下面描述的一些修改的制造商的说明。
      1. 使用震荡培养箱在1400转孵育样品在70℃（而不是56℃）下10分钟。
      2. 加在70℃下加热至柱中洗脱缓冲液，孵育5分钟，在70℃，并通过离心洗脱的DNA根据制造商的说明。确定由分光光度法估算提取的DNA浓度260/280纳米。
  3. 准备含TREC和KREC信号接头（SJ）和TCRAC参照基因的插入质粒：
    1. 扩增从PBMC提 ​​取（以获得TREC-SJ，KREC-SJ及TCRAC片段）与特异于TRECs，KRECs和TCRAC引物的DNA（ 见表1）。
      注：在5'末端，所述KREC-和TCRAC特异性引物含有HindIII和SpeI位限制性位点（小写中所示的表1的序列）具有侧翼的额外核苷酸的适当数量（以斜体表示）;这两个功能是不存在的典型KREC和TCRAC序列。
TRECs 前锋 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3'
逆转 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3'
KRECs 前锋 5'-CCC AAG CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3'
逆转 5'-CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3'
TCRAC 前锋 5'- 摹交流标记TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3'
逆转 5'- 摹交流标签TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3'

使用表1的引物对克隆过程。在5'末端，在小写示核苷酸相应于限制性内切酶位点，而斜体字示出为加侧翼核苷酸。

    1. 在25微升的最终体积进行PCR反应，由1×缓冲液II，1.5毫的MgCl 2，dNTP混合物（各200μM的），引物，在900纳米，的AmpliTaq DNA聚合酶（2.5单位/ 25微升）的最终浓度，和100纳克的DNA。
    2. 使用下面的PCR参数：95℃进行10分钟的第一步骤，接着是95℃30秒，40个循环; 60℃，30秒; 72℃30秒，72℃最后1 10分钟的循环。 PCR产物的长度应为：380碱基对TRECs，166碱基对在K区域经济共同体，381基点的TCRAC。
    3. 插入TREC-SJ的PCR产物中的pCR2.1-TOPO载体的TA受体位点。通过热休克变换在XL1-蓝色化学感受态细胞的质粒DNA下面设置有细胞的协议。其中生长，因为氨苄青霉素抗性菌落，找出那些携带插入，这将出现，因为失去了β半乳糖苷酶互补白，接种成主盘。最后，确定包含TREC片段通过PCR殖民地。
    4. 扩大所识别菌落之一，并使用质粒小量制备试剂盒纯化质粒DNA，并遵循制造商的说明进行操作。消化的质粒DNA和TCRAC扩增产物用SpeI限制性内切酶和结扎TCRAC片段插入SpeI位限制性位点。
    5. 变换XL1-蓝色细胞质粒DNA并确定含有TCRAC片段通过PCR殖民地。展开鉴定殖民地之一，净化质粒DNA使用质粒小量制备试剂盒。
    6. 消化的质粒DNA和KREC扩增产物用HindIII和克隆KREC-SJ片段插入HindIII限制性位点。变换XL1-蓝色细胞质粒DNA，并确定含PCR第三个片段的克隆。
    7. 验证，通过直接测序，三个刀片的存在和不存在的突变。最终的三重插入片段的质粒的图谱示于图1。

figure-protocol-1
图1.三插入质粒图谱。三插入片段的质粒地图显示TREC，KREC，TCRAC序列和限制性酶切位点的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

    1. 扩大所识别菌落之一，纯化使用质粒midiprep试剂盒的质粒DNA。确定由分光推定质粒DNA浓度二百八十○分之二百六十〇nm和通过凝胶电泳将DNA质量。存储所述质粒的适当等分在-80℃下（ 例如 ，每次50微升）。

2.标准曲线准备

注：准备在0.1倍TE缓冲液稀释所有在专门设计的DNA结转遏制地方。

  1. 计算感兴趣的质粒拷贝数的质量（ 见表2），考虑到该质粒大小是4846碱基对，并且每碱基对的平均质量是1.096×10 -21克/碱基对，并因此：米P =（ 4846 BP）×（1.096×10 -21克/ BP）= 5,311.216×10 -21克= 5.311×10 -18克。
副本＃ X 5.311×10 -18克质粒DNA的质量（g）
1×10 6个 5.311×10 -12
1×10 5个 5.311×10 -13
1×10 4个 5.311×10 -14
1×10 3 5.311×10 -15
1×10 2 5.311×10 -16

表2.质量需要每个标准曲线稀释点质粒。

  1. 通过将所需要的质粒群众由卷（5微升）被吸移到每个反应计算质粒DNA的浓度（ 见表3）。
质粒DNA的质量（g） ÷5微升质粒DNA的终浓度（g /微升）
5.311×10 -12 1.062×10 -12
5.311×10 -13 1.062×10 -13
5.311×10 -14 1.062×10 -14
5.311×10 -15 1.062×10 -15
5.311×10 -16 1.062×10 -16

表3.计算所需的每个稀释点的质粒的浓度。

  1. 解冻质粒的等分试样。线性化2微克质粒DNA用XhoⅠ和确定其浓度BŸ分光光度估计在260/280纳米。
  2. 制备适当的稀释线性质粒DNA，以实现一种方便的工作原液从（ 例如，100毫微克/微升= 0.1微克/微升= 1×10 -7克/微升）启动。存储的线性化质粒DNA的其余部分在-80℃下。
  3. 执行1:10或1的便利号：100的稀释液，使该质粒在1×10 -10克/微升的更可行的浓度。
  4. 用式C 1 V 1 = C 2 V 2计算稀释体积（V 2 - V 1）需要准备该系列的第一个标准曲线的点（1×10 6个拷贝，相当于1.062×10 -12克/ 5微升; 见表4）。
初始浓（克/微升） 质粒DNA体积（微升） DilueNT卷（微升） 最终卷。 （微升） 最终的浓度。 （克/微升） 质粒DNA的最终拷贝数/ 5微升
Ç1 V 1 V 2 -V 1 V 2 C 2
1×10 -7 5微升 45微升 50微升 1×10 -8 不适用
1×10 -8 5微升 495微升 500微升 1×10 -10 不适用
1×10 -10 5微升 465微升 470微升 1.062×10 -12 1×10 6个
1.062×10 -12 50微升 450微升 500微升 1.062×10 -13 1×10 5个
1.062×10 -13 50微升 450微升 500微升 1.062×10 -14 1×10 4个
1.062×10 -14 50微升 450微升 500微升 1.062×10 -15 1×10 3
1.062×10 -15 50微升 450微升 500微升 1.062×10 16 1×10 2

表4.稀释计算。

  1. 与常规一系列1:10稀释进行到获得剩余标准曲线点。
    注意：不要忘记执行下一个前短暂涡旋每个质粒稀释。
    注：最高稀释圣昂达尔曲线（10个拷贝/5μl的）必须只是在进行试验之前制备，因为这样小的量的质粒DNA是不够稳定，以被存储以供将来使用。
  2. 存储三重质粒稀释点在-80℃下在单独的管中，直到使用。将稀释的三质粒DNA为至少6个月的高度稳定。

3. DNA提取目标样本

  1. 从外周血分离的外周血单个核细胞收集到使用密度梯度分离法EDTA管中。
    注意：可替换地，可以使用其他合适的起始材料（ 例如，分类淋巴细胞亚群，全血），为目标样品。
  2. 提取目标样本PBMC的DNA报告步骤1.2。

4.实时PCR检测TRECs和KRECs定量

  1. 板准备和装载：
    1. 安排一个PCR板包括至少两个重复为每个样品待分析：标准曲线（A→˚F1→4），阳性对照（Ctrl +; G1→4）和无模板对照（NTC; H 1→4）。
      注：观察一个典型方案在表5中，但也可以创建不同的格式。请记住，TRECs和KRECs将在相同的孔中，从那些TCRAC鲜明一起扩增。
TRECs + KRECs 一个 TCRAC B TRECs + KRECs TCRAC TRECs + KRECs TCRAC
1 2 3 4 五 6 7 8 9 10 11 12
一 10份6 10份6 10份6 10份6 1 1 1 1 9 9 9 9
B 10 5人副本 10 5人副本 10 5人副本 10 5人副本 2 2 2 2 10 10 10 10
Ç 10 4份 10 4份 10 4份 10 4份 3 3 3 3 11 11 11 11
ð 10 3份 10 3份 10 3份 10 3份 4 4 4 4 12 12 12 12
Ë 10 2份 10 2份 10 2份 10 2份五五五 13 13 13 13
˚F 10副本 10副本 10副本 10副本 6 6 6 6 14 14 14 14
摹 CTRL + CTRL + CTRL + CTRL + 7 7 7 7 15 15 15 15
ħ NTC NTC NTC NTC 8 8 8 8 16 16 16 16

表5.样品的实时PCR板。

    1. 计算所需井总数（包括1 - 2个额外的井占可能的移液错误），并准备主结构的TRECs / KRECs和TCRAC在单独的管（ 见表6）。
      注：该引物和探针特异性TRECs，KRECs和TCRAC提及表7中的引物和探针的终浓度为900纳米和200纳米，分别。
TRECs / KRECs TCRAC
H 2Ø 2微升 H 2Ø 4.75微升
KRECs 20皮摩尔/微升 1.125微升 TCRAC 20皮摩尔/微升 1.125微升
KRECs转速20皮摩尔/微升 1.125微升 TCRAC转速20皮摩尔/微升 1.125微升
KRECs探头10皮摩尔/微升 0.5微升 TCRAC探头10皮摩尔/微升 0.5微升
TRECs 20皮摩尔/微升 1.125微升 2倍的TaqMan通用PCR预混 12.5微升
TRECs转速20皮摩尔/微升 1.125微升
TRECs探头10皮摩尔/微升 0.5微升
2倍的TaqMan通用PCR预混 12.5微升

表6.体积所需的指示的井中的试剂。

TRECs 前锋 5'-CAC一TC CCT TTC AAC CAT GCT-3'
逆转 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3'
探测器 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3'
KRECs 前锋 5'-TCC CTT GGC AGT ATT ATT TGT ATC ACT-3
逆转 5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3'
探测器 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC 前锋 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3'
逆转 5'-TTT GGA AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
探测器 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3'

表7.引物序列和探针的实时计算机ř检测。

    1. 加入20微升的每个组合（TRECs / KRECs和TCRAC）的。临走试剂准备室，密封反应板与光学胶盖。
    2. 在核酸提取室，提起粘合剂覆盖，并添加5微升基因组DNA样品的（400 - 500纳克）到孔中。添加5微升基因组DNA（ 即从脐带血中获得PBMC准备）到CTRL +井。
      注意：作为一种替代脐带血，利用DNA来自同一公知的，积极的外周血样品的样品或池，或通过混合所确定的三重插入质粒量与来自TREC-基因组DNA制备的“人工”阳性标准和KREC阴性细胞系。
    3. 加入5微升水到NTC孔中。与光学胶盖密封再次反应板。
    4. 移动到的地方，确保质粒DNA结转的遏制;解冻每个稀释POIN质粒DNA的标准曲线只有在使用前T和准备的最高稀释度（10拷贝/ 5微升）。只有从A→高1→4口井抬起粘合盖，并添加5微升每个点稀释质粒DNA的标准曲线的。再次密封粘接盖。
    5. 验证的情况下的气泡上的孔的底部，从而保证试剂被定位在底部。
    6. 运行在实时PCR系统的检测。所述标准协议包括第一步骤，在50℃进行2分钟，在95℃下的初始加热10分钟，接着45个循环变性95℃15秒，和一个组合的引物/探针退火和延伸率60℃下1分钟。
    7. 保存的数据在PCR程序的结束。
      注：为避免DNA交叉污染，记住：按照通常的良好实验室规范建议定量PCR设置时实时PCR检测：使用独立的区域/间的核酸提取，试剂配制，质粒操纵，扩增反应;使用不同的吸管套;更换手套/大衣适当。
  2. 结果与计算：
    注意：下面的步骤基于使用设置有在材料表中提到的实时PCR仪，但是，在一般的软件我们的经验，应该适用于其他的实时PCR分析的平台和软件。请记住，即使使用相同的软件，通常存在执行所需的命令（ 如图标，快捷方式）的方法不止一种。
    1. 在软件中打开保存的结果文件，并单击“结果”选项卡上。在窗口的顶部，单击“分析”菜单，选择“分析设置”。让软件选择“全部”探测器和“自动CT”（=的Ct阈值循环自动确定的门槛。让软件设置“自动基线”;背景消除默认。
    2. 点击名为“扩增曲线”选项卡上，并在窗口的最右边的部分，选择在相应的下拉菜单中的三个“探测器”一（ 例如，开始TRECs）。正下方，选择“手动CT”手动设置阈值;转到窗口的下部，并选择对应于所选择的检测器的标准曲线稀释点，以显示扩增曲线的孔中。要做到这一点只需点击并拖动鼠标在桌子上的相应细胞。
      1. 要手动调整门槛，拖动红色阈值线向上和向下，然后单击“分析”来重新分析结果。要检查设置的阈值影响的结果，选择“报告”选项卡，请参见相应的标准曲线稀释点的产生的Ct。当移动的门槛，尽量遵守以下建议，以获得最佳的位置。
      2. 回到“扩增曲线”选项卡，并确认阈值在指数扩增足够高于背景噪声，但低于高原阶段的一个区域。如果扩增曲线是不是在对数刻度显示，对剧情右键单击调出“图形设置”，并设置后运行Y轴设置为“日志”，设置门槛中途在的线性部分积，并观察扩增曲线大致彼此平行。
      3. 点击“报告”选项卡上看到的CT检测结果。确保阈放置产生的结果是最大限度地发挥各自的标准曲线稀释点的两个重复的精度。
      4. 检查该阈值被放置在它最能反映标准曲线稀释点（最佳灵敏度）的数量级的极端订单点。其余的两个探测器（KRECs和T重复步骤4.2.2和剩余的子步骤CRAC）。
      5. 转到报告选项卡，在该表再次拖动鼠标在窗口的下半部分，选择相应的标准曲线对所有探测器（TRECs，KRECs，TCRAC）的孔细胞。验证结果的三个目标的Ct非常类似于在相同稀释度点（ 例如，相差不超过0.5克拉）。如果需要调整阈值并重新检查。
        注：由于三重插入质粒含有各目标，因此，一个单拷贝的扩增比率在理论上应该是接近1：1：1。在某些情况下，可能有必要手动也调整基线为一个或一个以上的检测器，以获得更好的结果。回想起刚才的“分析设置”窗口中，选择其中的调整是必要的检测，然后设置“手动基线”，并开始和结束周期（一般为3〜15）插入自定义值。然后点击“OK及重新分析”，并重新检查以前的点。
      6. 只有验证以下后，接受实验的会话：
        1. 点击“报告”选项卡上，转到窗口的下部，选择NTC井，检查相应的CT是“Undet”（ 即没有放大是目前在NTC井）。
        2. 选择“标准曲线”选项卡，然后看向绘图窗口的权利;从下拉菜单中选择检测，看看是否-3.55和-3.32之间的报道标准曲线的斜率范围（对应于PCR 91效率 - 100％）
        3. 确保测定（R 2）的系数比0.998（ 图2）更高，通过读取右斜率和截距低于其值（在相同的“标准曲线”标签中，选择各检测器之后）。
          注：更容易注意的极度稀释点，因为他们不对可能会影响斜率（它们具有很高的“LEVE愤怒“的效果在回归线）。特别是，要记住，最高的质粒稀释可能会降低比预期更快。但是，只要有可能不丢弃它们，因为合理的方法可以考虑100作为定量检测限是非常有用的：换句话说，对于样品10和100之间，其结果可以被报告为<100或“正但不定量的“，而如果该曲线范围（<10）的外面也可以被报告为0或”不可检测“。
          注意：这可能是有用的，以保持先前的标准曲线稀释的Ct值的存档，以便计算每个稀释点的平均值，以保持作为一种用于以后的实验最优“参考”的范围或内部质量检查（ 例如，计算平均值和SD建立休哈特控制图）。类似地，也可能是有帮助的，以保持与阳性对照的以往的Ct的存档。

      3. figure-protocol-2
      图2.标准曲线TRECs，KRECs和TCRAC。标准曲线分地块和登录回归线估计为TRECs（A），KRECs（B），和TCRAC（C）在建造时，验证是否符合理想的指数扩增率（斜率= 3.32），这将对应于100％的效率。 CT：循环阈值; R 2：确定回归系数请点击此处查看该图的放大版本。

          1. 点击“报告”选项卡上，确认阳性对照（在图下表的相应细胞中发现的）的Ct值与先前实验对SA的结果是一致的我知道阳性对照。
            注：“报告”标签显示TRECs，KRECs和样品的TCRAC量被测试，该​​软件已经从相应的标准曲线内插来计算，使用阈值和基线后获得的Ct值已被正确地设置（一新的分析与新阈值/基线会改变这些结果）。看到这里的插值发生在标准曲线上，选择“标准曲线”选项卡，然后选择所需的水井，并寻找黑“X”出现在回归线。他们的y轴值是插值量。如果使用始终相同的阳性对照，适当的参考范围和/或质量控制图可以建的基础上，对阳性对照确定先前的值。
        2. 点击“文件”菜单中的“保存”，然后“出口”到.csv文件导出所有井的数量在TE包含逗号分隔值XT文件。
        3. 导入the.csv文件在电子表格软件，并计算通过适当设定下述式TRECs的每10 6个PBMC的数量或KRECs：[（平均TRECs或KRECs的量）/（平均TCRAC / 2的量）]×10 6个
          注：TCRAC的平均数量除以2，因为在每个小区中有两个TCRAC基因拷贝， 例如，一个用于每个染色体。
          注：TRECs和阳性对照KRECs的最终数量的一致性可以认为，但请记住，值将不完全匹配，因为标准曲线稀释点的增加变异。在的情况下的总发散，该实验可能需要重复。再次，控制图可以内置到设置适当的参考范围。
        4. （可选的，但推荐）如果可用的全血计数的结果，计算出每毫升血液使用下式的TRECs或KRECs：
          TRECs或每1×10 6）×（淋巴细胞+单核细胞计数KRECs在1ml的血液）/ 10 6 =拷贝/ ml。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

87健康对照组有代表性的样本进行化验：0岁儿童42 - 17（男/女：17分之25）和45岁的成年人24 - 60（男性/女性：一十六分之二十九）。得到的结果作为分别计算TRECs和每10 6个PBMC中KRECs，然后每毫升血液中TRECs和KRECs。

TRECs的数量随着年龄减少由于胸腺衰退，4特别是在一个非常尖锐的方式从0到3 - 4年。在成年人中，TREC数量还取决于性别，因为它降低更迅速在男性比女性5这可以创建在设置适当的参考范围，应该区分的年龄和性别可能的基础上，如果一个非常精确的问题需要估计常态。

figure-results-1
图3. TREC定量在做健康 NORs的。TRECs的量被确定为TRECs / 10

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TREC 和 KREC 定量可以被认为是对近期胸腺和骨髓输出量的良好估计，前提是考虑到一些注意事项。尽管采用标准曲线的绝对定量方法需要更多的试剂和实时荧光定量 PCR 反应板上的更多空间，但它确保了高度准确的定量结果，因为未知样品量是从基于已知量的起始材料构建的标准曲线中插值的。此外，这种方法更适合检测少量目标。从方法学的角度来看，一个关键点是与标准曲线点相对应的冷冻质粒稀释液可能比预期更早降解。这要求在每次实验程序之前需要从最初储存的质粒中制备新的稀释液，特别是最稀释的质粒。在最终计算中，淋巴细胞加单核细胞计数之间的非完全等价作为 PBMC 量的估计值可能会在每 106 表示的值与每毫升血液表示的值之间的转换中增加一些偏差。可以改进从直接从全血中提取的已知量的DNA中确定两个靶标（TREC 和 KREC）的数量，从而消除了单核细胞和淋巴细胞计数的需要。14 在这种特定情况下，参考基因并不是执行定量的绝对必要条件，但可以用作额外的 DNA 质量和数量检查。

结果解释可能会受到某些问题的影响。首先，应该考虑到参考范围会随着性别和年龄的变化...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 ML密度梯度分离方法
QIAamp DNA 血液小量套装 （250）QIAGEN51106DNA 提取
未修饰的 DNA 寡核苷酸 HPSF 0.01 mmolEurofins MWG纵子/Carlo Erba 试剂 S.r.l 将冻干产品重悬至 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA 聚合酶：包括 10x 缓冲液 II 和 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP 混合物 （100 mM）Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒Invitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue 亚克隆级感受态细胞Stratagene200130
PureYield 质粒小量制备系统PromegaA1223
SpeI 500U新英格兰生物实验室R0133S
HindIII-HF 10,000 U新英格兰生物实验室R3104S
PureYield 质粒中量制备系统PromegaA2492
XhoI 5,000 U新英格兰生物实验室R0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTASigma Aldrich SRLE5134
TE 缓冲液（1 mM TRIS 和 0.1 mM EDTA）
TaqMan 通用 PCR 预混液Applied Biosystems/Life-Technologies4364338
双标记探针 HPLC 0.01 mmolEurofins MWG纵子/Carlo Erba 试剂 S.r.l 将冻干产品重悬至 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c 分光光度计ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 热循环仪Applied Biosystems/Life-Technologies4359659
Fast 7500 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS 序列检测软件 1.4Applied Biosystems/Life-Technologies
用于

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  7. Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
  8. Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493(2012).
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