通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

摘要

所述的耳后手术入路可实现快速、直接地将药物递送至小鼠耳蜗的鼓阶，同时最大限度减少出血量和动物死亡率。该方法可通过圆窗膜向新生后小鼠递送分子、药物及病毒，用于耳蜗治疗。

摘要

基因治疗可用于实现感音神经性耳聋的功能恢复，有望加深对导致听力损失的潜在分子和遗传机制的理解。将载体导入内耳时，必须确保药物在耳蜗内广泛分布，同时尽量减少对现有结构的损伤。本文描述了一种经耳后入路的手术方法，可用于对出生后第10天及以上的幼鼠通过圆窗膜（RWM）途径进行分子、药物及病毒载体的递送，以实现小鼠耳蜗治疗。该手术方法可快速、直接地将药物输送至鼓阶，同时减少出血并避免动物死亡。该技术对内耳和中耳的重要结构以及颈部肌肉造成的损伤可忽略不计或完全无损伤，并能完整保留听力功能。为展示该手术技术的有效性，将以囊泡型谷氨酸转运蛋白3基因敲除（VGLUT3 KO）小鼠为例，说明一种先天性耳聋小鼠模型在通过腺相关病毒（AAV-1）将VGLUT3递送至内耳后恢复听力的过程。

引言

基因治疗长期以来被认为是遗传性听力损失的一种潜在治疗方法，但该领域尚未取得成功¹。迄今为止，由于病毒介导的方法理论上能够靶向相对难以接近的耳蜗内特定细胞类型，因此在该领域占主导地位。腺病毒（AV）和腺相关病毒（AAV） 均已被用于耳蜗基因递送。AAV在耳蜗中具有多项优势：它们是复制缺陷型病毒，能够高效地将转基因分子递送至多种细胞类型，包括神经元——这是多种听力损失病因的重要靶点。AAV进入细胞依赖于特定受体²；因此，特定血清型的选择必须与待转导的细胞类型相匹配。AAV可有效转染毛细胞³，并整合至宿主基因组，从而实现转基因蛋白的稳定、长期表达以及细胞表型的改变⁴。尽管长期表达对于毛细胞再生等短期应用未必具有优势，但对于遗传缺陷的稳定挽救至关重要。由于AAV不与任何人类疾病或感染相关，且未表现出耳毒性^5,6,7，因此是用于遗传性听力损失基因治疗的理想候选载体⁸。

利用病毒载体将外源遗传物质导入哺乳动物内耳的研究在过去十年中不断深入，该技术正逐渐成为治疗遗传性和获得性听力损失的一种有前景的方法⁹。耳蜗作为基因治疗的靶点具有若干潜在优势：1）其体积小，所需病毒用量有限 ；2）其相对独立于其他器官系统，有助于限制副作用；3）其充满液体的腔室有利于病毒在整个迷路结构中的扩散^10,

方案

注意：所有实验操作和动物处理均符合美国国立卫生研究院（NIH）伦理指南以及加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准的方案要求。

1. 手术前动物准备

1. 在洁净、专用的空间内进行手术操作。所有手术器械在使用前需经高压灭菌，并用玻璃珠灭菌器进行灭菌 。
   注：本实验方案中使用出生后第10至12天（P10-12）的FVB小鼠。可根据具体研究需求选用不同年龄和品系的小鼠。P40以上的小鼠操作难度较大，因为鼓室骨会变得更坚硬。
2. 通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）、盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）和乙酰丙嗪（2 mg/kg）的混合物对小鼠进行麻醉。待动物对疼痛刺激（如脚趾夹捏）无反应后，方可开始手术准备。必要时可追加麻醉混合液（剂量为初始剂量的五分之一），以维持原有的麻醉深度。
   注：此步骤需格外谨慎，因该年龄段小鼠的大多数死亡案例均由麻醉过量引起。
3. 在麻醉期间，使用保护性眼膏覆盖动物眼睛，以保持眼球湿润，防止因眨眼反射受抑而造成角膜干燥。
4. 在整个手术过程中，将小鼠颈部伸展置于加热垫上，直至其完全苏醒，以预防麻醉后低体温。
5. 使用电动剃毛器剃除左侧耳后区域的毛发，并在手术操作前用70%乙醇和聚维酮碘进行消毒。

2. 手术操作与载体注射

1. 采用耳....

结果

为了验证经耳后入路进行耳蜗分子治疗的技术特点和实用性，通过圆窗膜（RWM）将 AAV1-VGLUT3、AAV1-GFP 和 AAV2-GFP 递送至出生后10-12天（P10-12）小鼠的内耳。该方法可在不引起耳蜗器（organ of Corti）明显损伤的情况下，实现内毛细胞（IHC）（VGLUT3 图1 和 GFP 图2 以及 GFP 图3A）、外毛细胞（OHC）（GFP 图2）和支持细胞（GFP 图2 和 图3A）²⁶ 中的外源基因有效表达。耳蜗全埋染免疫荧光图像中观察到不同细胞类型表达 GFP（图2 和 图3A），表明所选用的 AAV 血清型必须与目标转导细胞类型相容。图1、图2 和 图3A²⁶ 显示，使用 AAV1 .......

讨论

在本研究中，我们详细描述了一种可用于耳蜗基因治疗的技术，旨在恢复或挽救因遗传缺陷而受损的正常听觉功能。由于该方法通常具有无创性，因此在耳蜗基因转导或其他潜在的分子治疗中具有良好的安全性³⁰。已有其他耳蜗治疗途径被报道，包括腹侧入路²⁴、耳蜗开窗术^31,32以及通过内淋巴囊给药³³，这些方法应用于小鼠和豚鼠模型。根据我们的经验，经耳后入路操作更快捷、更简便，且造成的损伤更小，动物死亡率更低。此外，经耳后入路可更清晰地观察圆窗膜（RWM），降低创伤风险及由此导致的听力损失^34,35,36。本报告通过经圆窗膜向内耳递送AAV1-VGLUT3，展示了该经耳后入路在耳蜗分子治疗中的技术细节与应用价值，实现了VGLUT3和GFP的转基因表达（图1、图2和图3A），并在这一先天性耳聋小鼠模型中实现了听力功能的恢复。以往关于基因递送方法的研究仅在柯蒂氏器的关键区域观察到有限的转基因表达^{12,37,38,39,40,41}。这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Butler Schein
赛拉嗪	AnaSed
乙酰丙嗪	由 UCSF LARC 提供
卡洛芬镇痛剂	由 UCSF LARC 提供
聚维酮碘	Betadine Puredue Pharma
地塞米松眼膏（TobraDex）	Alcon
加热垫	Braintree scientific, inc.
25G 针头	BD	305127
硼硅酸盐毛细移液管	World precision instruments, inc.	1B100F-4
PDS*plus 抗菌缝线	Ethicon	PDP149
组织胶（Vetcode）	Butler Schein	31477
兔抗绿色荧光蛋白抗体	Invitrogen	A11122
解剖显微镜	Leica		MZ95
Flaming/Brown 微量移液器	Sutter Instrument Co
拉针仪 P-97 型
TDT BioSig III 系统	Tucker-Davis Technologies