通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

摘要

所述的耳后手术入路可实现快速、直接地将药物递送至小鼠耳蜗的鼓阶，同时最大限度减少出血量和动物死亡率。该方法可通过圆窗膜向新生后小鼠递送分子、药物及病毒，用于耳蜗治疗。

摘要

基因治疗可用于实现感音神经性耳聋的功能恢复，有望加深对导致听力损失的潜在分子和遗传机制的理解。将载体导入内耳时，必须确保药物在耳蜗内广泛分布，同时尽量减少对现有结构的损伤。本文描述了一种经耳后入路的手术方法，可用于对出生后第10天及以上的幼鼠通过圆窗膜（RWM）途径进行分子、药物及病毒载体的递送，以实现小鼠耳蜗治疗。该手术方法可快速、直接地将药物输送至鼓阶，同时减少出血并避免动物死亡。该技术对内耳和中耳的重要结构以及颈部肌肉造成的损伤可忽略不计或完全无损伤，并能完整保留听力功能。为展示该手术技术的有效性，将以囊泡型谷氨酸转运蛋白3基因敲除（VGLUT3 KO）小鼠为例，说明一种先天性耳聋小鼠模型在通过腺相关病毒（AAV-1）将VGLUT3递送至内耳后恢复听力的过程。

引言

基因治疗长期以来被认为是遗传性听力损失的一种潜在治疗方法，但该领域尚未取得成功¹。迄今为止，由于病毒介导的方法理论上能够靶向相对难以接近的耳蜗内特定细胞类型，因此在该领域占主导地位。腺病毒（AV）和腺相关病毒（AAV） 均已被用于耳蜗基因递送。AAV在耳蜗中具有多项优势：它们是复制缺陷型病毒，能够高效地将转基因分子递送至多种细胞类型，包括神经元——这是多种听力损失病因的重要靶点。AAV进入细胞依赖于特定受体²；因此，特定血清型的选择必须与待转导的细胞类型相匹配。AAV可有效转染毛细胞³，并整合至宿主基因组，从而实现转基因蛋白的稳定、长期表达以及细胞表型的改变⁴。尽管长期表达对于毛细胞再生等短期应用未必具有优势，但对于遗传缺陷的稳定挽救至关重要。由于AAV不与任何人类疾病或感染相关，且未表现出耳毒性^5,6,7，因此是用于遗传性听力损失基因治疗的理想候选载体⁸。

利用病毒载体将外源遗传物质导入哺乳动物内耳的研究在过去十年中不断深入，该技术正逐渐成为治疗遗传性和获得性听力损失的一种有前景的方法⁹。耳蜗作为基因治疗的靶点具有若干潜在优势：1）其体积小，所需病毒用量有限 ；2）其相对独立于其他器官系统，有助于限制副作用；3）其充满液体的腔室有利于病毒在整个迷路结构中的扩散^{10,11,12,13,14,15}。

先天性耳聋的小鼠模型可用于多种研究方法，以系统性、可重复的方式监测内耳的发育过程。尽管小鼠耳蜗体积较小，给手术操作带来一定困难，但小鼠在遗传性听力损失的研究中仍具有极其重要的地位，并相较于其他物种具有多项实验优势¹⁶。小鼠模型可通过遗传连锁分析、详细的形态学观察以及致病场景模拟，评估多种特征；因此，它们是病毒介导基因治疗的理想候选模型。结合广泛的小鼠遗传学研究与技术进步，目前已在不同实验室中实现了以可重复方式构建基因修饰小鼠^{17,18,19,20,21}。此外，小鼠中已存在大量获得性和遗传性听力损失表型的模型，可在该动物模型中进行严格的测试验证^22,23,24。因此，在小鼠模型中利用病毒介导的基因治疗来纠正听力，是探索人类疾病治疗方法的恰当第一步。

我们先前已证实，缺乏囊泡型谷氨酸转运蛋白3（VGLUT3）的转基因小鼠由于内毛细胞带状突触处无法释放谷氨酸而出生即聋²⁵。由于该突变不会导致感觉毛细胞的原发性退变，因此这些突变小鼠 可能是用于测试先天性耳聋耳蜗基因治疗的理想模型。

迄今为止，已有多种用于耳蜗基因治疗的病毒递送技术被报道，包括圆窗膜扩散法、经圆窗膜注射法以及通过耳蜗开窗术递送法。这些方法各自具有潜在的优势与局限性⁹。

本文报道了一种通过圆窗膜（RWM）对VGLUT3基因敲除（KO）小鼠内耳进行病毒介导基因递送的外科手术方法。经耳后入路的RWM注射方法具有微创性，能良好地保留听力，且操作相对快速。正如我们先前所发表的研究，为了在此小鼠模型中恢复听力，我们在出生后第12天（P12）将携带VGLUT3基因的AAV1载体（AAV1-VGLUT3）注入聋鼠耳蜗，成功恢复了其听力²⁶。通过听觉脑干反应（ABR）检测验证了VGLUT3基因敲除小鼠的听力恢复情况，而转基因蛋白的表达则通过免疫荧光（IF）进行验证。该方法表明，病毒介导的基因治疗能够纠正原本会导致耳聋的遗传缺陷。

方案

注意：所有实验操作和动物处理均符合美国国立卫生研究院（NIH）伦理指南以及加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准的方案要求。

1. 手术前动物准备

1. 在洁净、专用的空间内进行手术操作。所有手术器械在使用前需经高压灭菌，并用玻璃珠灭菌器进行灭菌 。
   注：本实验方案中使用出生后第10至12天（P10-12）的FVB小鼠。可根据具体研究需求选用不同年龄和品系的小鼠。P40以上的小鼠操作难度较大，因为鼓室骨会变得更坚硬。
2. 通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）、盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）和乙酰丙嗪（2 mg/kg）的混合物对小鼠进行麻醉。待动物对疼痛刺激（如脚趾夹捏）无反应后，方可开始手术准备。必要时可追加麻醉混合液（剂量为初始剂量的五分之一），以维持原有的麻醉深度。
   注：此步骤需格外谨慎，因该年龄段小鼠的大多数死亡案例均由麻醉过量引起。
3. 在麻醉期间，使用保护性眼膏覆盖动物眼睛，以保持眼球湿润，防止因眨眼反射受抑而造成角膜干燥。
4. 在整个手术过程中，将小鼠颈部伸展置于加热垫上，直至其完全苏醒，以预防麻醉后低体温。
5. 使用电动剃毛器剃除左侧耳后区域的毛发，并在手术操作前用70%乙醇和聚维酮碘进行消毒。

2. 手术操作与载体注射

1. 采用耳后入路暴露鼓室骨。用小剪刀切开皮下组织，暴露耳后肌。将切口后侧的脂肪组织向后牵拉，将肌肉向切口左右两侧垂直分离，以暴露颞骨。确保切口足够长，以便操作时视野充分、操作舒适。
2. 用25 G针头穿刺鼓室骨，并根据需要使用镊子向后剥离骨组织以扩大穿刺孔，从而进入耳蜗基回，随后进一步扩大开口，以便观察镫骨动脉和圆窗膜（RWM）。
3. 用硼硅酸盐玻璃毛细移液管在圆窗膜中心处轻轻穿刺。此时可见液体自圆窗膜流出，此现象正常。等待流出液稳定（用无菌滤纸吸干耳蜗流出的液体）。
   注意：持握和推进玻璃针时应小心操作，使圆窗膜穿孔尽可能小。根据所用显微镜类型，可使用显微操作器或手持移液管夹持器来固定移液管。
4. 使用拉针仪制备注射用移液管，制备方法与膜片钳移液管相同。确保移液管尖端直径较大（约15 µm），以便于病毒溶液的吸入和推出。
5. 吸取1至2 µl的AAV1-VGLUT3、AAV1-GFP或AAV2-GFP至注射移液管中。待液体流出稳定后（5至10分钟），通过先前在圆窗膜上制造的同一穿孔，将固定体积的病毒溶液微量注射入鼓阶。
6. 拔出移液管后，立即用一小块肌肉封闭圆窗隐窝，并在肌肉上滴加少量组织粘合剂固定，以防止圆窗处发生渗漏。
   注意：移除针头后，必须用一小块肌肉塞紧密封该孔 ，以防止耳蜗外淋巴液泄漏——此步骤对保护听力至关重要。若圆窗膜未完全封闭，将导致渐进性听力损失。
7. 注射完成后，用脂肪组织覆盖听泡上的穿孔，将耳后肌和脂肪组织复位至正常位置，并使用6-0或更细的可吸收铬肠线逐层缝合切口。
8. 用聚维酮碘对伤口进行消毒。

3. 术后护理

1. 将小鼠置于温暖的笼子中，并在完全恢复之前不得无人看管 将它们与母鼠放回一起。建议在将幼鼠放回母鼠身边之前，先将雄鼠从笼中移除。
2. 术后皮下注射卡洛芬（2 mg/kg）以缓解疼痛，之后每24小时给药一次，持续3天，以控制炎症和疼痛。每天监测动物是否有痛苦、异常体重减轻、疼痛或感染的迹象。通常在第3天^rd 手术后第二天，所有小鼠均应表现正常。若小鼠在术后第3天出现任何痛苦或疾病迹象^rd 当天，应根据机构指南对小鼠实施安乐死。

4. 利用听觉脑干反应（ABR）记录评估病毒递送后的耳蜗功能

注意：听觉脑干反应（ABR） 是一个 听觉诱发电位 从大脑持续的电活动中提取，通过放置在头皮下的电极记录。动物接受声音刺激。所得到的记录包含五个波形，反映在听觉刺激开始后的前10毫秒内，听觉通路中相继位点的电活动。

1. 按照本方案第1.2节所述方法，通过腹腔注射盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的混合物对小鼠进行麻醉，但不使用乙酰丙嗪。
2. 在整个听力测试过程中将小鼠置于加热垫上，直至小鼠完全清醒，以防止麻醉后低体温。
   注意：本实验使用以下声刺激：短声（持续时间5毫秒；呈现频率31 Hz）。
3. 将皮下针电极置于头顶（有源）、左耳耳廓下方（参考电极）和对侧耳下方（接地电极），并在隔音室内按照先前所述方法开始记录听性脑干反应（ABR）^27,28。从最大反应幅度开始，以5 dB声压级为间隔递减记录ABR波形。
4. 在病毒递送后最早于术后第4天测定ABR阈值。
   注意：阈值定义为在视觉检查中可清晰且重复观察到I–V波反应峰的最低刺激强度。
5. 测量I波以分析耳蜗神经的活动。能够引出可检测ABR波形的最低刺激强度即定义为阈值。

5. 使用免疫荧光法检测耳蜗转基因蛋白表达

1. 按照本方案第1.2节所述方法，通过腹腔注射过量的盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪混合物麻醉小鼠，但不使用乙酰丙嗪。
2. 仅在动物对疼痛刺激（如脚趾夹捏）不再产生反应后，进行断头操作。
3. 解剖取出耳蜗，并按照文献²⁶所述方法进行整体免疫荧光染色。使用抗VGLUT3和抗Myosin 7a抗体进行耳蜗整体免疫荧光染色的详细方案 见Akil et al., 2013²⁹。
4. 对于GFP标记，将耳蜗整体样本在4 °C下用1:250稀释的兔抗GFP抗体孵育过夜。
5. 用PBS冲洗耳蜗两次，每次10分钟，然后在含1:4,000稀释的Cy2标记的 goat抗兔IgG中4 °C孵育2小时。
6. 用PBS冲洗耳蜗两次，每次10分钟，再加入DAPI孵育15分钟。
7. 将耳蜗样本置于载玻片上，通过共聚焦免疫荧光显微镜观察。

结果

为了验证经耳后入路进行耳蜗分子治疗的技术特点和实用性，通过圆窗膜（RWM）将 AAV1-VGLUT3、AAV1-GFP 和 AAV2-GFP 递送至出生后10-12天（P10-12）小鼠的内耳。该方法可在不引起耳蜗器（organ of Corti）明显损伤的情况下，实现内毛细胞（IHC）（VGLUT3 图1 和 GFP 图2 以及 GFP 图3A）、外毛细胞（OHC）（GFP 图2）和支持细胞（GFP 图2 和 图3A）²⁶ 中的外源基因有效表达。耳蜗全埋染免疫荧光图像中观察到不同细胞类型表达 GFP（图2 和 图3A），表明所选用的 AAV 血清型必须与目标转导细胞类型相容。图1、图2 和 图3A²⁶ 显示，使用 AAV1 ...

讨论

在本研究中，我们详细描述了一种可用于耳蜗基因治疗的技术，旨在恢复或挽救因遗传缺陷而受损的正常听觉功能。由于该方法通常具有无创性，因此在耳蜗基因转导或其他潜在的分子治疗中具有良好的安全性³⁰。已有其他耳蜗治疗途径被报道，包括腹侧入路²⁴、耳蜗开窗术^31,32以及通过内淋巴囊给药³³，这些方法应用于小鼠和豚鼠模型。根据我们的经验，经耳后入路操作更快捷、更简便，且造成的损伤更小，动物死亡率更低。此外，经耳后入路可更清晰地观察圆窗膜（RWM），降低创伤风险及由此导致的听力损失^34,35,36。本报告通过经圆窗膜向内耳递送AAV1-VGLUT3，展示了该经耳后入路在耳蜗分子治疗中的技术细节与应用价值，实现了VGLUT3和GFP的转基因表达（图1、图2和图3A），并在这一先天性耳聋小鼠模型中实现了听力功能的恢复。以往关于基因递送方法的研究仅在柯蒂氏器的关键区域观察到有限的转基因表达^{12,37,38,39,40,41}。这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Butler Schein
赛拉嗪	AnaSed
乙酰丙嗪	由 UCSF LARC 提供
卡洛芬镇痛剂	由 UCSF LARC 提供
聚维酮碘	Betadine Puredue Pharma
地塞米松眼膏（TobraDex）	Alcon
加热垫	Braintree scientific, inc.
25G 针头	BD	305127
硼硅酸盐毛细移液管	World precision instruments, inc.	1B100F-4
PDS*plus 抗菌缝线	Ethicon	PDP149
组织胶（Vetcode）	Butler Schein	31477
兔抗绿色荧光蛋白抗体	Invitrogen	A11122
解剖显微镜	Leica		MZ95
Flaming/Brown 微量移液器	Sutter Instrument Co
拉针仪 P-97 型
TDT BioSig III 系统	Tucker-Davis Technologies