过碘酸雪夫染色是一种用于显示组织中多糖含量的技术。本文展示了适用于从人外周静脉血中纯化的外周血单个核细胞的过碘酸雪夫染色方案。此类样本富含淋巴细胞及免疫系统中的其他白细胞。
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本文内容
摘要
摘要
过碘酸雪夫（Periodic acid Schiff，PAS）染色是一种应用于肌肉活检及血液样本诊断的免疫组织化学技术。多糖类物质（如糖原、糖蛋白和糖脂）经染色后呈亮洋红色，便于在组织中统计阳性与阴性细胞的数量。在肌肉细胞中，PAS染色用于测定不同类型肌细胞中的糖原含量；而在血细胞样本中，PAS染色已被探索作为多种疾病状态的诊断工具。血液中含有一定比例属于免疫系统的白细胞。关于免疫系统细胞是否含有糖原并将其作为能量来源的观点，尚未得到广泛研究。本文中，我们描述了一种改良的PAS染色方案，适用于人外周静脉血来源的单个核免疫细胞。观察到体积较小、含有PAS阳性颗粒的细胞，以及体积较大、呈现弥散性PAS染色的细胞。使用淀粉酶处理样本可消除上述染色模式，证实了染色的特异性。另一种基于酶消化的技术进一步验证了样本中糖原的存在及其含量。该方案对于研究血液来源淋巴细胞中多糖含量的血液学或免疫学研究人员具有实用价值。
引言
过碘酸雪夫（PAS）染色是一种广泛应用于肌肉研究和诊断的免疫组织化学技术，也可作为血液样本的诊断工具。该技术通过将过碘酸溶液作用于样本，使多糖内部的结构单元发生氧化，生成醛基；这些醛基与无色的雪夫试剂发生反应，从而产生深紫红色产物。该操作步骤如图1所示。该染色可使所有含多糖的物质呈现紫红色，包括糖原、糖蛋白、糖脂、黏蛋白或其他具有多糖部分的分子。
过碘酸雪夫（PAS）染色常用于检测肌纤维中的糖原水平。肌肉组织切片非常适合该技术，因为它们能牢固地附着在载玻片上，并能耐受多次洗涤和染色步骤。糖原主要存在于快缩型II型肌纤维中，这类肌纤维对快速生成ATP有较高需求，需要糖原来实现最佳功能1,2。糖原是一种葡萄糖的支链聚合物，可通过糖原磷酸化酶的作用分解为游离葡萄糖。在休息和营养充足状态下，糖原通过糖原生成过程得以补充；而在营养缺乏或高能量需求时，糖原则通过糖原分解代谢为葡萄糖。自20世纪50年代起，临床科研人员已开始探索在血液样本上应用PAS染色，以分析多种疾病中的糖原含量3-7。例如，在庞贝病——一种明确的糖原累积病中，白细胞会积聚大量糖原，显著区别于健康对照者8。
本视频文章展示了一种改良的过碘酸-雪夫染色法（PAS染色），适用于健康人外周静脉血单个核细胞（PBMC）样本。PBMC主要包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，以及其他免疫细胞，如自然杀伤细胞和单核细胞。第一步纯化过程可去除红细胞、中性粒细胞及其他粒细胞。该技术可富集淋巴细胞群体，从而比使用全血涂片更可靠地对PAS阳性细胞进行计数。
图1：PBMC上进行PAS染色的逐步方法学。 (A) 首先通过Ficoll密度梯度法分离PBMC，左图显示离心前的准备状态，右图显示离心后的状态，其中含有PBMC的白膜层位于试管中央。 (B) 使用甲醛-乙醇固定液将分离的PBMC固定在载玻片上。用塑料洗瓶中的蒸馏水轻轻冲洗载玻片。 (C) 然后将载玻片置于盛有约50 ml淀粉酶溶液的100 ml烧杯中，以溶解糖原。随后轻轻冲洗载玻片。 (D) 载玻片用高碘酸溶液处理，使糖类发生氧化反应。轻轻冲洗载玻片，以去除多余的高碘酸并终止氧化步骤。 (E) 当加入希夫试剂后，该试剂将与氧化步骤中产生的醛基发生反应。这种无色试剂会生成深红色品红产物。轻轻冲洗载玻片以去除多余的希夫试剂。
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方案
涉及人类血液样本的研究已获得康考迪亚大学伦理审查委员会批准，批准证书编号为10000618。小鼠肌肉相关研究已获得康考迪亚大学伦理审查委员会批准，批准证书编号为2010BERG。
1. 从全血中分离外周血单个核细胞
注意：此操作应在生物安全柜中进行，并使用无菌技术及制造商已灭菌的设备。
- 小心地将 10–15 ml 抗凝（肝素化）采血管中的全血倒入 50 ml 无菌锥形管中。对于少量血液溢出，用 ddH₂O 擦拭即可2使用清洁纸巾，依次用 O 和 70% 乙醇擦拭。
- 将锥形管中的血液用磷酸盐缓冲液（PBS 1x，pH 7.4）按1:1比例稀释，确保总体积不超过30 ml。
- 使用移液枪轻轻混匀，避免产生气泡。
注意：切勿通过倒置试管的方式混匀，以避免血液在管盖处积聚，并在离心过程中发生渗漏。 - 加入13 ml Ficoll-paque （参见 材料 和 设备表)，转移至一个新的50 ml离心管中。将离心管直立放置于管架中。
- 使用移液管吸取稀释后的血液，将移液管管尖接触试管内壁靠近顶部的位置。以缓慢而稳定的压力，沿试管内壁将血液转移，使血液在蔗糖层上方形成一层。重复此步骤数次，直至所有血液均被转移完毕。
- 盖紧管盖，在室温下使用水平转子，以700 × g离心30分钟，加速度设为5，减速度设为ZERO。
- 缓慢取出试管，避免扰动各层，将其放回生物安全柜中。
- 使用移液管小心收集位于PBS/血浆层与Ficoll层之间的白膜层（薄而浑浊的白色层），该层含有PBMCs。避免收集蔗糖层，且不要扰动红细胞层。
- 将白膜层转移至新的50 ml无菌锥形管中。可能需要重复多次 步骤 1.8 收集所有 PBMC。
- 向含有PBMC的离心管中加入pH 7.4的PBS，定容至45 ml刻度线。充分振荡混匀，禁止涡旋振荡。
- 洗涤1：在480 × g下离心15分钟，加速度和减速度均设为9。观察锥形管底部单个核细胞（PBMC）沉淀的形成。
- 将 PBS（上清液）弃入含 10 ml 漂白剂的塑料烧杯中。
- 轻轻将细胞沉淀在波浪状表面来回摇动以松散细胞团块（即， 空架子）。切勿涡旋震荡。
- 向试管中加入 25 ml 新鲜的 PBS（pH 7.4）。如果同时处理多个试管，此步骤中将各管的沉淀物合并在一起。
- 洗涤2：将离心管在480 × g下离心12分钟，加速度和减速度均设置为9。
- 将 PBS（上清液）倒入含漂白剂的塑料烧杯中。
- 轻轻在波纹状表面来回滚动即， 空架子）。不要涡旋震荡。
- 向试管中加入 25 ml 新鲜的 PBS。
- 取出50 µl细胞，转移至微量离心管中用于活率计数。
- 加入等量（50 µl）的台盼蓝（一种活率染料），轻轻吹打混匀。
- 取出10 µl，转移至血细胞计数板，检测每毫升细胞的存活率。记录细胞数/ml。
- 取出所需数量的细胞，将离心管以480 × g离心12分钟，加速度和减速度均设置为9。
- 将 PBS（上清液）弃入含漂白剂的烧杯中。
- 轻轻在波纹状表面来回摇动（即， 空架子）。向试管中加入 80 µl PBS。
2. 制备PBMC玻片
- 取80 µl细胞悬液置于显微镜载玻片上，用另一张载玻片辅助涂布；或在载玻片两端各加40 µl的细胞悬液两滴。
- 将载玻片放置于生物安全柜中自然干燥，并用铅笔在磨砂面标记载玻片。
3. 将样本固定在载玻片上
- 通过将 0.5 ml 的 37% 甲醛与 4.5 ml 的 99% 乙醇混合，配制固定液。
- 载玻片干燥后，取 2 ml 新配制的固定液，倒入载玻片上，使其完全覆盖载玻片表面。
- 让溶液在载玻片上停留 1 分钟，然后用自来水冲洗载玻片 1 分钟，并使其自然晾干。
4. 制备阴性对照用淀粉酶溶液
- 取0.25 g淀粉酶粉末，溶于50 ml蒸馏水中。将溶液倒入洁净的100 ml烧杯中。
- 将玻片浸入烧杯中，使玻片的一半接受处理，另一半保持未处理状态，然后在室温下孵育15分钟（图1C）。
- 记录玻片上接受淀粉酶处理的一侧，并在玻片背面画一条线，标示处理区与对照区的边界。
- 用ddH2O清洗玻片以去除淀粉酶溶液，然后让玻片自然晾干。
5. 进行过碘酸雪夫（PAS）染色与成像
注意：PAS试剂吸入有毒且具有腐蚀性，因此操作步骤必须在化学通风橱中进行，并根据机构规定妥善处理废弃物。
- 将载玻片置于平坦表面，在样本上加入 1.50–2.00 ml 高碘酸溶液，室温孵育 5 分钟。
- 用多批次蒸馏水冲洗载玻片。
- 在载玻片上加入 1.50–2.00 ml 希夫试剂，室温孵育 15 分钟。
- 用蒸馏水洗涤载玻片 5 分钟，随后静置晾干。
- 在载玻片上滴加 10 µl 封片介质，并用两张小盖玻片覆盖；或滴加 50 µl，使用一张大盖玻片。
- 在盖玻片边缘涂抹透明指甲油，室温静置过夜干燥。
6. 使用100倍物镜通过双目光学显微镜获取图像
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结果
为了验证试剂和基本技术，按照制造商说明书对小鼠比目鱼肌切片进行了PAS染色。染色在动物处死后当天进行，染色的最后一步使用二甲苯固定切片。已知比目鱼肌中约含有35%的糖原阳性细胞9。染色后的肌细胞显示出两种明显的PAS阳性特征：细胞内的点状颗粒，以及沿细胞膜分布的连续线条（图2A）。点状颗粒的存在与糖原储存一致，因此被用于定义阳性肌细胞。经淀粉酶处理后，这些点状颗粒消失，进一步证实其成分为糖原（图2B）。
图 2：采用光学显微镜分析PAS染色的小鼠肌肉切片。 小鼠比目鱼肌切片经...
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讨论
本视频文章的关键步骤在于细胞的洗涤和淀粉酶处理过程。在洗涤载玻片时，关键操作是使用塑料可挤压洗瓶，让水流轻轻流过载玻片上的样本，而不能直接对准样本冲洗。即使轻微的直接水压也会导致细胞从载玻片上脱落。另一个关键步骤是使用同一张载玻片进行有无淀粉酶（±amylase）的对比处理。在PBMCs细胞贴附于载玻片后，将载玻片小心地放入烧杯中，使涂片仅有一半暴露于淀粉酶溶液中。该步骤提供了可靠的对照，因为血细胞来自同一张载玻片，从而最大限度地减少了因微小时间差异可能引起的混杂变量。细胞在未经特殊处理的情况下贴附良好，因此无需额外花费和时间进行聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）或聚乙二醇（polyethylene glycol）包被等处理。
通过排除故障确定了淀粉酶的最佳活性。对于肌肉切片，观察到淀粉酶的最佳活性出现在孵育1小时之内；孵育时间过长会导致肌肉切片逐渐从载玻片上脱落，而时间过短则淀粉酶无法充分去除PAS信号。对于PBMC载玻片，淀粉酶孵育时间需比肌肉样本（1小时）显著缩短至仅15分钟；孵育时间过长会导致PBMC从载玻片脱落，而时间过短则无法有效消除PAS信号。对PAS染色标...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现项目基金资助，项目编号为 RGPIN 418522-2013。我们感谢 R. Kilgour 提供的有益讨论，以及 Katelin Gresty 和 A. Berghdal 博士提供的小鼠肌肉切片。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 过碘酸雪夫试剂盒 |  Sigma-Aldrich | 395B | 使用前需恢复至室温。本试剂盒中的材料具有毒性且有害，使用时需谨慎。 |
| α-淀粉酶（来源于猪胰腺） | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| 双目显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| 糖原检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | 非离子型蔗糖合成聚合物。 |
| 离心机 | 用于PBMC分离，使用摆动转子。 |
参考文献
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