研究自然动情周期雌性大鼠条件性恐惧消退的实验方案

摘要

雌激素等性腺激素在多种实验范式中调节记忆形成，包括恐惧消退记忆。本方案描述了一组用于研究性腺激素在自然动情周期雌性动物消退过程中特异性作用的方法，包括动情周期监测和外源性雌激素给药。

摘要

条件性恐惧的消退在雄性啮齿类动物中已得到广泛研究。近年来，越来越多的研究表明，某些行为任务和反应行为的神经机制在雌性和雄性之间存在差异。在研究中使用雌性动物可能带来挑战，原因是其动情周期中性腺激素水平存在波动。本实验方案描述了经过验证的成熟方法，可用于研究雌二醇在雌性大鼠恐惧消退记忆巩固中的作用。动情周期的阶段以及在消退训练前给予外源性雌激素，均可能影响24小时后的消退记忆回忆。本文所述的阴道涂片技术用于识别动情周期阶段，有助于检测和调控自然周期中的性腺激素水平。利用这一基础啮齿类动物模型，可进一步阐明雌激素在雌性中调节恐惧消退记忆的潜在机制。

引言

在人类和啮齿类动物中，多种认知行为和学习范式均观察到固有的性别差异。例如，已有报道表明，女性通常具有更强的语言能力和细节关注能力，而男性则具有更好的空间能力^1-3。这些性别差异可能部分归因于性腺激素的影响。高水平的雌二醇可提高女性擅长任务中的表现，但会降低男性通常表现较好的任务中的成绩^4-6。尽管这些证据具有说服力，但人类研究中难以完全控制实验环境，使得难以确定这些行为效应是否可明确归因于激素作用。相比之下，动物研究能够实现完全受控的实验条件。

尽管恐惧消退的基本神经机制已在雄性个体中被识别并得到深入研究，但这些机制在雌性个体中是否相同，以及其在动情周期中如何变化，目前尚不清楚。恐惧条件化与消退是啮齿类动物和人类中广泛使用的行为范式，用于开展与焦虑障碍相关的研究。鉴于女性不仅焦虑障碍风险更高，且症状持续时间更长、严重程度更高^7-13，在这些研究中纳入雌性个体至关重要。雌性在该研究领域中的代表性不足，可能源于动情周期监测的困难，以及难以控制性激素对行为的影响。在此方面开展雌性研究的实验室常面临一些问题，但这些问题往往未被报告，或未在研究方法部分中加以描述。

在啮齿类动物中的新近证据表明，恐惧消退的性别差异受到性腺激素的调节^14-18。在恐惧条件反射实验中，动物被训练对特定刺激产生恐惧。经过多次无强化的刺激呈现后，动物学会不再对这一线索产生恐惧，该过程称为消退。动物学习并巩固这一任务记忆的能力，可在消退训练结束后的一段时间进行的消退回忆测试中加以观察。消退回忆过程中恐惧表达减少，表明消退记忆的巩固良好。我们实验室的最新研究发现，雌激素可调节恐惧消退记忆的巩固，并改善消退回忆表现。具体而言，在动情周期中循环雌激素水平达到高峰的动情前期进行消退训练的雌性大鼠，其消退记忆的保持能力增强。相比之下，在雌激素水平较低的动情间期进行消退训练的雌性大鼠，其消退回忆表现相对较差，但若在消退训练前或训练后立即给予外源性雌二醇，则可改善其表现^15,16。然而，雌性个体中消退记忆巩固的神经机制（包括性腺激素的作用）尚不明确。

在实验动物中，可通过侵入性外科手术（如阉割和卵巢切除术）来研究激素的作用。手术恢复后，通常在执行行为学任务期间对外源性性腺激素进行操控¹⁹。该方法已为性激素研究提供了关键信息，其优势在于能够对性腺激素进行精确控制（包括给药时机和剂量）^20-23。然而，这种方法无法评估动情周期中自然发生的激素波动的影响，也不能代表“正常”动物状态，从而限制了其向人类研究的转化潜力。已有充分证据表明，雌性性激素水平在动情周期的特定阶段会出现峰值和下降，且雌激素受体的表达在动情周期内以及卵巢切除术后均会发生变化²⁴。因此，有必要对性腺完整的雌性动物开展研究，并优化实验设计，以可靠地探究高雌激素状态与低雌激素状态在其整个生命周期中对雌性个体可能产生的影响。

本实验方案重点研究雌激素对参与恐惧消退的神经生物学系统的影响。方案详细说明了以下操作步骤：1）精确监测动情周期，2）制备用于全身给药的有效剂量的雌二醇，3）实施包含恐惧条件化、消退及回忆的行为学范式，适用于自然动情周期的雌性大鼠。本方案可结合其他药理学干预手段以及细胞和分子工具进行修改，以促进对条件性恐惧消退行为中所观察到的性别差异的深入研究。需注意的是，下文所述操作程序为本实验室所采用的方法，文献中尚存在多种技术变体。

方案

注意：本方案中的所有操作均已获得麻省总医院研究动物护理委员会（该委员会作为机构动物护理与使用委员会，即 IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1. 动物饲养与操作程序

1. 到达后，将约8-10周龄（体重200-225 g）的成年Sprague Dawley雌性大鼠每3-4只一组饲养在塑料箱中，垫以木屑。自由摄取饲料和水，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环。让大鼠在饲养环境和动物设施中至少适应1周时间。
   注意：本方案中的所有操作均在光照周期内进行。
2. 经过上述适应期后，连续2-3天每天对所有动物进行5分钟的抓取操作。每次正确抓取一只大鼠（用手托住躯干，不要抓尾巴），牢固握住并在此期间轻抚。对于表现出更高应激反应、易惊跳或焦虑的大鼠，应延长抓取时间。此举旨在尽量减少抓取应激，以免影响本方案后续步骤。
   注意：不同实验室在抓取动物的天数和时长上可能有所不同；但在同一实验室的不同实验之间应保持一致。

2. 动情周期监测：阴道拭子涂片与染色步骤

1. 制备0.9%生理盐水溶液（将氯化钠溶解于蒸馏水中）。将棉签浸入该溶液中，然后用纸巾轻压棉签尖端以吸去多余液体，避免过度饱和，否则可能导致样本采集不足或细胞丢失。将小鼠尾巴向上抬起并远离阴道口，轻轻将棉签插入阴道腔内，并沿阴道壁旋转，以收集脱落的阴道细胞。
2. 若动物在采样过程中将尿液排在棉签上，需更换新的棉签，因为尿液污染会干扰发情周期阶段的识别。操作过程中应格外小心，避免给动物造成应激，因为应激暴露会扰乱动情周期。采样时应迅速插入并退出，深度不宜过深，以尽量减少对宫颈的额外刺激，防止诱发假孕。
   注意：假孕表现为一种无周期性的动情周期，通常持续约12天，即连续数天处于动情间期²⁵。
3. 小心取出棉签头，并将其在预先标记好的显微镜载玻片上滚动涂抹。避免用力按压，以免载玻片上液体过多，干燥后影响阶段判读。
   注意：一张载玻片可记录同一动物连续多天的样本，具体方式可根据个人习惯调整。
4. 确保样本成功转移至载玻片上。建议在同一张载玻片上连续采集数天的样本，以便更准确地追踪和识别每日动情周期的变化。
   注意：如有可能，最好由相同人员对所有动物进行样本采集，以保持操作一致性。
5. 待载玻片完全干燥后，开始染色程序以识别动情周期阶段。使用染色试剂盒（见材料表），将载玻片分别浸入固定液（浅蓝色）10次、染色液（粉红色）10次、复染液（紫色）5次。随后用流动水轻轻冲洗载玻片，并使其完全自然干燥后再置于显微镜下观察。
   注意：典型的小鼠动情周期持续4-5天，依次为：动情期（E）、动情后期（M）、动情间期（D）和动情前期（P）²⁶。动情期的特征是大量蓝色角化细胞；动情后期可见白细胞以及角化细胞与有核细胞的混合；动情间期细胞类型与动情后期相似，但细胞数量极为稀疏；动情前期则以紫色染色的有核细胞聚集体为特征（图1）。除上述方法外，还有多种其他染色方法同样适用于阴道涂片细胞学分析。
6. 为准确监测实验前的动情周期阶段，应至少采集两个完整周期（约8-10天）的样本。采样时间应固定在每天的同一时段。在整个实验过程中需每日持续采集阴道涂片样本，直至实验结束。

3. 暴露前处理

1. 在实验开始之前，让动物预先暴露于条件化装置中，使其在进行任何行为测试前适应所处环境（条件化装置）。
   1. 在实验开始前的3天内，每天让雌性动物在开启室内灯光的条件下，进入位于隔音箱中的条件化装置内适应20-30分钟。将它们预先暴露的隔音箱指定为该研究中使用的实验装置。每次实验间隔及不同动物使用后，需彻底清洁装置（包括墙壁和托盘），以去除可能影响动物行为和动情周期的气味。

4. 第1天：适应/恐惧条件反射

1. 在确认动物处于动情周期的动情期后，开始为期3天实验的适应/条件化阶段。
   1. 在实验每一天首次呈现条件刺激（CS）声音之前，记录声音前的僵直行为基线值。具体方法为：在第一次单独呈现CS试验开始时、CS出现前的无刺激时间段内，记录动物静止不动的时间（秒），将其除以试验持续时间，再乘以100，计算出僵直百分比得分。
      注意：这些测量值可用于评估和比较动物在适应、条件化、消退及回忆阶段的基线僵直水平。
   2. 若需在动情后期进行消退训练，则应在动物动情期的最后一天对其进行条件化训练。在每次开始实验流程（条件化/消退/回忆）前，每日进行阴道涂片并鉴定动情周期阶段（步骤2）。由于动情期可能持续超过一天，应结合周期历史记录来预测各阶段持续时间，以确定动物何时适合开始训练。
2. 在条件化实验箱中，将足底电击网格地板连接至电刺激发生器。使用0.5–0.6 mA的电刺激作为非条件刺激（US），使用4 kHz、80 dB的声音作为条件刺激（CS）。
   注意：这些参数在不同实验室之间可能有所差异，可根据需要调整以实现最佳条件化效果。
   1. 如果僵直行为分析程序需要视觉提示（而非时间标记），则在播放声音的同时同步激活LED灯。将LED灯置于操作箱外部，并确保其位于视频画面内。在每次试验开始时开启LED灯，并保持点亮状态直至试验结束。
      注意：该灯光对动物不可见，仅作为记录视频文件中试验起始与结束的标记（用于后续测量僵直行为）。
3. 将动物放入条件化实验箱，进行5次仅呈现CS的适应性试验。适应阶段结束后，立即进行7次CS与US配对的恐惧条件化试验。确保每次CS声音持续30秒，并与持续0.5秒的US电击同时结束。所有实验阶段（适应、条件化、消退和回忆）中的试验均采用平均为3分钟的可变间歇间隔。
4. 条件化阶段结束后，将动物放回其饲养笼，并送回动物饲养设施，等待次日继续实验。

5. 第2天：雌二醇配制

1. 对所有接受本方案第1天操作的动物进行阴道涂片并确定其动情周期阶段。使用芝麻油或0.9%生理盐水作为溶剂，配制用于皮下注射的雌二醇（又称E2、17β-雌二醇或β-雌二醇）溶液，剂量为15 μg/kg。
2. 为计算注射所需雌二醇的用量，应使用动物在本方案第1天适应时测量并记录的体重数据。
3. 进行计算，使每只大鼠给予的雌二醇体积标准化（i.e. 0.2 ml）。由于雌二醇因不溶于水而难以溶解，且小剂量需要较大体积的溶剂，可通过加热将雌二醇溶于芝麻油中制备储备液。随后可将溶液经0.22 μm滤器过滤以去除污染物。例如，将适量计算好的3,000 μg雌二醇/1 ml芝麻油储备液加入所需总量的芝麻油中，以实现每只动物0.2 ml注射体积内含15 μg/kg剂量。
   注：也可选用其他可溶于水、更易溶解的雌激素形式。

6. 第2天：雌二醇给药/消退训练

1. 皮下注射雌二醇。轻轻捏起颈部肩胛骨之间的松弛皮肤，将注射器针头插入皮肤褶皱形成的三角区域。
2. 皮下注射雌二醇后30分钟，将动物再次放入条件化实验舱，并开始消退训练。在此消退阶段中，进行20次仅条件刺激（CS）的试验，每次试验包括一次持续30秒、频率4 kHz、强度80 dB的音调刺激，刺激之间的间隔为可变的间歇期，平均间隔时间为3分钟。
   注意：雌二醇对记忆提取的影响出现在消退训练前或消退后立即给予雌二醇时。若在消退后4小时才给药，则无法观察到该效应，因此建议在训练会话开始或结束前后尽快注射¹⁵。

7. 第3天：消退记忆提取

1. 在消退训练后的 24 小时，对完成本方案第 1 天和第 2 天的动物进行拭子采样。
2. 将动物放入其指定的条件化实验箱（与第 1 天和第 2 天相同）。通过呈现 3 次仅条件刺激（CS）的试验（即消退记忆回忆的三次试验），开始消退记忆回忆阶段，每次试验仅包含 3.80 dB 的单独 CS 刺激，其试次间间隔与第 6.2 步所述用于消退训练的 20 次试验相似。
3. 回忆阶段结束后，将动物放回其饲养笼中。

8. 数据分析

1. 通过视频采集行为学数据，并使用计算机软件进行分析。
   注：实验人员可在不了解药物处理分组的情况下，通过记录每次条件刺激（CS）呈现期间的僵直时间来手动计算僵直评分，结果以在声音刺激期间僵直时间所占的百分比表示。在30秒的CS-US实验中，僵直定义为除呼吸外完全无运动的状态。僵直百分比的计算方法为：将僵直（静止不动）的秒数除以30秒（试验持续时间），再乘以100。

结果

在此恐惧消退记忆提取实验方案中，以僵直百分比作为恐惧程度的指标。成功消退且保留消退训练记忆的动物，在消退记忆提取阶段行为测试的最后一天表现出较低的恐惧反应。雄性和雌性大鼠在条件化、消退及记忆提取阶段的条件性恐惧表达水平无显著差异（图2）。然而，当根据动情周期中雌激素水平高低将雌性动物分为高雌激素期和低雌激素期组进行单独分析时，性别差异变得明显。在动情周期低雌激素期（即动情间期）接受消退训练的雌性大鼠，其第3天消退记忆的提取效果明显差于在动情前期接受训练的雌性大鼠（图3）。这些处于动情间期的雌性大鼠在消退记忆提取过程中也表现出显著更高的恐惧恢复（即消退记忆较差），与雄性相比尤为明显。然而，若在动情间期雌性大鼠进行消退学习前，皮下注射15 μg/kg剂量的雌二醇，则恐惧消退记忆的巩固能力得到增强，表现为消退记忆提取期间僵直时间显著降低（图4）。因此，这些数据表明性腺激素可调节恐惧消退记忆的提取，并介导条件性恐惧消退行为中的性别差异。

讨论

恐惧消退在雄性大鼠中已被广泛研究，介导条件性恐惧消退的神经机制已在多种干预条件下被识别和评估。相比之下，针对雌性大鼠或性腺激素在恐惧消退中作用的研究相对较少。为了专门研究雌激素对恐惧消退的影响，采用自然动情周期的雌性大鼠进行为期三天的行为实验范式。该程序包括适应/条件化、消退和消退记忆三个阶段。利用此方案已证明，在低雌激素水平的动情间期接受消退训练的雌性大鼠，其冻结行为更高（即消退记忆受损），相较于在高雌激素水平的动情前期接受消退训练的雌性大鼠。¹⁵在间情期阶段的消退训练前给予雌二醇可调节消退记忆的巩固¹⁶这通过消退记忆期间冻结行为的减少得以证明。综上所述，这些结果强调了在雌性动物研究中关注卵巢激素及动情周期对行为影响的重要性。尽管本文未描述对照实验，但有必要纳入适当的对照组。 即 无消退组，以进一步评估雌激素对消退记忆巩固过程中相关机制的影响。

本实验方案的目的有两个：1）研究在完整动物动情周期的特定阶段，雌激素对条件性恐惧消退的影响；2）考察在雌性动物通常处于低雌激素状态时，急性补充雌二醇如何调节其行为。通过本文所述...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
恐惧条件反射实验箱	Coulbourn Instruments
图形化状态控制器	Coulbourn Instruments
隔音箱	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
雌二醇	Sigma-Aldrich	E1024	溶于芝麻油用于皮下注射
芝麻油	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
快速染色剂	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
棉签	Fisher Scientific	23-400-114	6英寸，无菌
0.9%生理盐水	LabChem, Inc.	LC23460-2	氯化钠质量体积比溶液
Selectfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	用水按1:256稀释
鲁尔锁式1ml注射器	Becton Dickinson	309628
一次性皮下注射针头	Exelint International, Co.	26402	26号规格