远程肢体缺血预适应：在啮齿动物的保护技术

Summary

远程缺血预处理（RIP）是调节组织反对破坏性压力的方法。我们已经建立了远程缺血的方法在后肢，由充气血压计袖带5-10分钟。 RIP的神经保护能力已经被证明在视网膜变性的啮齿类动物模型。

Abstract

亚致死缺血保护免受随后，更严重的缺血组织通过内源性机制在受影响的组织的上调。亚致死缺血也已表明上调保护机制在远程组织。缺血（5-10分钟）在哺乳动物后肢的简短期间诱导的脑，肺，心脏和视网膜自我保护反应。该效应被称为远程缺血预处理（RIP）。它是保护重要器官的治疗有希望的途径，并且已经根据对心脏和脑损伤的临床试验。该出版物表明使肢体的控制，微创方法 - 大鼠的具体后肢 - 缺血。在人类新生儿开发用于一种血压箍被连接到一个手动血压计和用于施加围绕后肢的上部160毫米汞柱的压力。设计成检测皮肤温度的探针被用来验证ischemi一，通过记录下降引起的腿动脉压引起的闭塞皮肤温度和温度升高随后的压脉袋的释放。 RIP的这种方法提供保护，以对抗明亮光损伤和退行性变大鼠视网膜。

Introduction

大多数存活，也许所有，在代谢应激的面组织可以通过现有调理用周期亚致死缺血^1,2的改进。缺血预处理（IP）在实际应用中是组织的暴露于亚致死缺血，组织经历更严重的压力，如随后的缺血性损伤之前。在动物模型中，IP提供给大脑，视网膜，心脏和肺^3-6醒目的保护。与此相对应，在中风患者观察表明先前短暂性缺血发作和更好的临床结果^7,8之间的链接。 IP也保护非缺血性损伤⁹视网膜感光。

知识产权在不同组织和伤害效果表明，它是活化细胞存活存在于所有组织的固有机制。心肌缺血预处理已建议有通过上调保护作用缺氧诱导因子（HIF），已知通过腺苷的释放或通过线粒体ATP钾通道^10,11的开口，以调节许多代谢途径。腺苷释放和ATP钾通道有牵连的脑缺血但，调查缺血调理迄今为止的神经保护机制已经被集中在修改反兴奋性毒性，抗凋亡和抗炎通路^12,13。总体上，缺血性调理用于保护神经元的分子过程的理解是有限的。

远程缺血预处理试图调节遥远极为重要器官（心脏，脑，肺）通过在较不关键组织产生缺血。使用后肢远程缺血预处理（RIP）已被证明是神经保护性中风^14-17的啮齿动物模型。由我们所描述的方法提供了一种简单，可靠和非侵入性PROTocol诱导RIP。

RIP的协议绝大多数涉及后肢，大概是因为股动脉位于上后肢可以很容易地识别和手术夹紧和止血带的应用程序访问。在大脑和皮肤保护的研究侵入性肢体缺血的研究，缺血是由分离腹股沟韧带的股动脉夹闭股动脉致^2,15,18。

从任一肢袖套或股动脉夹紧造成的缺血已证实在​​肢体变化，包括损失脉冲，降低氧合和皮肤温度下降。远程缺血可通过脉冲通过使用激光多普勒或超声多普勒^17-19损失来确认。皮肤温度可以用作替代多普勒尽管这种关系是非线性的^20,21。精确的温度记录是司空见惯的实验室和CAN很容易地纳入远程缺血性研究。

一种替代股骨夹紧手术是缺血使用止血带的诱导。止血带的应用程序产生媲美缺血到实现了与船舶夹紧; Kutchner 等 。相比侵入股动脉夹紧到一个非侵入止血带，发现两种方法停止在皮瓣缺血¹⁸整形外科模型血液流向肢体和减少皮肤损伤。掴或腿或臂和提高袖带压力到高于收缩期血压已发现可预防在猪和人类^17,19,22局部缺血损伤。

不同止血带接近诱发缺血性远程包括使用血压袖带或松紧带^17,22,23的。然而，使用弹性带以诱发局部缺血是一种不安全的方法，有可能引起的压力未调节量在肢，与压力上升到高于500毫米汞柱被记录在人类^24。另外，使用弹性带肢体缺血导致肌肉损伤后大鼠除去带²³的，如评估通过伊文思蓝染料， 在体内标记的肌纤维渗透率^25。与此相反，输送一个受控的压力向止血带可以使用连接到一个血压计^17,19,22,26血压袖带来实现。

在这项研究中，光感受器变性的光损伤模型，用于演示的远程缺血预处理的神经保护功效。远程缺血立即被诱导之前光损伤，并阻止随后的光感受器变性证实了视网膜功能测试。随行的视频将展示非侵入性的远程缺血的应用。

Protocol

伦理声明：本协议遵循悉尼大学的动物护理准则，AEC＃5657。麻醉是经动物伦理委员会（悉尼大学，AEC＃5657）。

1，设备的准备

1. 使用实时皮肤温度跟踪。打开电脑和数据采集硬件。
2. 打开温度记录软件，调整设定温度之间30-35℃和采样，以每100毫秒的频率。
3. 可选：插入直肠体温计，以保证核心温度保持稳定在37.5℃。

2.校准手册血压计

1. 新生儿连接手臂袖口sphygmomanometer.Use大小2袖口为250-550克的老鼠。适配器可能需要袖带管路连接到血压计。
2. 由任一松开空气释放阀或从适应断开袖带管袖带放气要么。确保无压力保持在管中及压力计针搁置在零的椭圆形/矩形内。
3. 检查油管，压力计和袖带之间的压力。充气的充气球的温柔泵袖口，直到它读取100毫米汞柱的压力表。确保压力保持不变。慢慢打开空气释放值袖带放气。

3.动物的制备

注意：动物是经过光损伤需要暗适应远程缺血前一天晚上。动物进行光损伤需要暗饲养（12小时光照：黑暗周期（5勒克斯））

1. 在任何醒着还是anesthetised啮齿类动物进行远程缺血。保证动物有一个健康的肌张力。按捏上后肢，以确认有足够的肌肉存在确保这一点。 RIP诱导保护，防止光损伤已在大鼠久坐经测试长达6个月的年龄。
2. 对于R Anesthetised准备IP
   1. 注入大鼠腹膜内注射60毫克/千克氯胺酮和5mg / kg的甲苯噻嗪。通过延伸腿和捏在脚的下侧的皮肤检查麻醉深度。动物有没有反射，如果它深深地anesthetised。应用人工泪液，以免角膜干燥，而在麻醉下。
   2. 放置大鼠在任一热垫或循环水加热器管保持37.5℃的恒定体温。定位大鼠与下肢'脚垫朝上俯卧位。右侧或左肢体可经历远程缺血。
3. 对于RIP清醒的准备
   注：清醒动物实验需要两个人。一个人抑制了动物和第二个人操作手动血压计。实验者必须有信心来执行的程序，约束会增加受伤的处理程序的风险。接受远程缺血大鼠必须牛逼空调o手动克制。取决于直觉准则手册约束应该从30秒进展到最多5分钟在数星期。胆小的动物，无法适应环境约束手动应排除清醒实验。最后，手动约束很可能引起应力（和潜在介绍的困惑的研究）对动物和假队列（袖带放置无炎症）必须被用来准确地解释的RIP的研究结果。
   1. 切一块毛巾到15厘米×30〜50厘米长，然后将短边垂直于老鼠的脊椎，覆盖头部后肢的顶部。
   2. 掖短边下老鼠的躯干紧紧地开始缠上毛巾的剩余长边的老鼠。固定臂下的包裹动物以仰卧姿势。如果老鼠是根据左臂举行，不受毛巾老鼠的右侧肢体。

4.应用Ø˚F皮肤温度探头

1. 延伸是经受缺血和放置在皮肤探头放在脚掌的大鼠的腿。定位皮肤探头最大化温度探头和皮肤之间的接触。牢固地将探头插入脚垫并加盖探头纸带。
2. 通过跟踪温度记录软件温度检查皮肤探针放置。确保皮肤温度是30-34之间℃，并保持稳定。跟踪皮肤温度1-2分钟。调整皮肤探头如果温度不稳定或低于30℃。

5.远程缺血

1. 袖带放气，并保证空气压力阀关闭。伸腿和松散包围在上后肢的袖口。用食指和拇指伸腿和低位保持松软的袖口位置。
2. 提高anesthetised动物的袖带压力为160毫米汞柱，而在清醒动物incre酶袖带压力180毫米汞柱。
   注：大鼠的anesthetised血压范围从120-140毫米汞柱，并上升到160毫米汞柱时意识。开始的计时器和脚的温度记录一次正确的压力为止。
   注：脚的温度应在5分钟的恒压后2℃下降。
3. 保持上述动物的“拐点”在整个缺血​​箍的位置。袖带压力将开始几分钟后丢弃，或者如果老鼠的肢体运动。
4. 反复泵送充气球在短脉冲以维持期望的袖带压的重复短脉冲抽
5. 远程缺血可连续进行5至15分钟，被传递。缺血再灌注协议包括2中间有一个5分钟再灌注期5分钟缺血。
6. 通过松开空气压力阀袖带放气压力。检查温度变化过缺血亲的过程母育。松开袖带。
7. 继续损伤的实验。在麻醉状态下的效果的动物将需要被放置在加热垫上。继续监测动物，直到门诊。动物不能退回住房，直到行走。

6.光损伤 - 视网膜变性模型

1. 暗适应动物过夜（12-15小时）。紧接着远程缺血空调或假远程缺血（动物约束）的地方动物有机玻璃外壳，食物和水。
2. 打开上方的有机玻璃外壳在上午9点24小时荧光灯（1000勒克斯）。曝光后，返回动物昏暗灯光循环7天。

7.后远程缺血程序

1. 视觉评估与电图（ERG）：
   注：ERG设置和闪光灯协议遵循布兰德利和石^26。
   1. 一夜之间暗适应动物（12-15小时）。下暗淡红色照明通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪（60毫克/公斤和5毫克/公斤，分别）麻醉动物。散瞳（硫酸阿托品1.0％），角膜麻醉剂（丙美卡因0.5％）。
   2. 应用角膜水化（卡波姆聚合物）的眼睛立即下降到角膜。适用于眼部凝胶，在20分钟的间隔，以维持角膜的​​水化。
   3. 周围画一个眼球捆绑松散线程，以帮助稳定ERG录音。用直肠探头监测温度，保持动物的体温在37-37.5℃。
   4. 放置一个Ganzfeld积分球内的头部。
      注：Ganzfeld是一个完全可编程的光刺激，可提供统一的白衣闪烁的LED从的眼睛。
   5. 记录使用定做4毫米铂正极轻轻触摸角膜和一个直径为2毫米的Ag / AgCl颗粒电极插入口的电图。参考两个电极的不锈钢针插入皮下臀部。
   6. 与0.3-1,000赫兹（-3分贝）带通设置记录的信号，以2 kHz的采集速率（公元仪器）。经过一个稳定的ERG记录建立主题的动物有10分钟的暗适应录音开始前。
   7. 按照先前由布兰德利和石²⁶中描述的闪光灯协议。
      1. 计划闪光的持续时间（我们使用闪烁1-2毫秒的持续时间），并设置其强度为-4.4至2.0日志苏格兰人cd.sm ^-2。使用明亮的闪烁（2.0日志苏格兰人cd.sm ^-2，1毫秒）来衡量视网膜功能。在这项研究中是控制，光损伤和光损伤RIP之间的比较。

8. TUNEL法

1. 通过腹膜内注射苯巴比妥过量（100毫克/千克）的动物实施安乐死。剜除眼睛和4％多聚甲醛固定。
2. cyroprotecting前PBS洗眼睛眼睛过夜蔗糖30％（重量/体积）。嵌入眼睛在OCT化合物中并切成使用低温恒温器20微米的矢状切面。
3. 以下Maslim 等人的协议来执行与DAPI染色的视网膜切片的TUNEL法^。27
4. 使用荧光显微镜的视网膜TUNEL计数。 TUNEL染色的细胞从外核层（ONL）记录;其中包含感光细胞核视网膜的最外层。在这项研究中，TUNEL计数一式三份作了为每只眼睛，用5眼对于每个处理组。
5. 使用单因素方差分析统计比较组是指控制，光损伤和光损伤+ RIP只。

Results

升高到高于160毫米汞柱的血压停止血流到后肢如在图1B中清楚地看到。组织氧合的缺乏导致了减少动物的脚温度为缺血再灌注协议（ 图2）。脚的温度（33℃）比核心温度低，可靠地减少在袖带压力升高（31℃）时，袖带放气（32℃）上升。单1000勒克斯的光损伤交付黯淡引发白鼠带或不带远程缺血性预处理。视网膜功能被记录并使用电图（ERG）进行评估。

ERG的是电响应从视网膜对光刺激的内和外的神经元起源的总和， 如图3的ERG波形具有从光转导引起一个早期负峰值（最低二极管灯后约10毫秒牛逼闪光）称为一个波和从内视网膜（最高大的正峰约光芒一闪后80毫秒）称为b波。从正常昏暗暗适应ERG提出大鼠表现出了较大的光感受器和视网膜内响应，明亮的2.0日志cd.sm ^-2闪光（ 图3A）。一个星期之后的光损伤的ERG记录了严重减少幅度相对于对照，反映了光感受器的损失; 见图3B。预处理的后肢使用的2×5分钟缺血再灌注...

Discussion

啮齿动物后肢缺血成功诱导带有手动血压计和袖口递送神经保护视网膜的光感受器。一发现与光损伤^9,28缺血诱导调节感光保护一致。

从本质上讲，远程缺血引起短暂的缺氧给组织。因此，远程缺血预处理有许多相似之处缺血空调或交替称为缺血耐受，缺氧预处理，并在一定程度上，无氧运动。细胞缺血挑战通过释放大量的各种蛋白质，核苷和转录因子直接提供神经保护或影响细胞变得耐受随后的代谢应激¹³的响应。

在文献中，远程缺血协议已包括一个范围的持续时间和频率。 我们的实验室测试了5，10，和正常的视网膜功能²⁶ 2×5分钟缺血协议。这些协议的2×5分钟产生正常大鼠的ERG最大振幅变化和被选择来测试的光损伤模型。短，反复5分钟缺血事件也被证明是预防人类中的重复中风和减少在实验性卒中猪^17,22梗塞大小。然而，缺血预处理的最适当的持续时间可能是取决于所使用的动物模型。例如，在对局灶性缺血梗塞尺寸的减小在长2×15分钟和3×15分钟的协议已...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
黄金系列 DuraShock 手动无液血压计	Welch Allyn	DS56	手动血压计
[尺寸 2] 1 管，10 包	Welch Allyn	5082-102-1	肢体血压袖带
鲁尔锁适配器	Welch Allyn	5082-178	新生儿袖带适配器
热敏电阻吊舱	AD Instruments	ML 309	皮肤温度装置
皮肤温度探头	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab，4通道采集硬件	AD Instruments	PL 35044
带柔性探头的恒温毯系统	Harvard Appartus	507222F
可选毛巾			：清醒远程缺血
Isoflo - 100% 异氟醚（250 毫升）	Abbot Animal Health	05260-05	可选：停止麻醉远期缺血
酮胺酮 - 氯胺酮 100 mg/ml （50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉剂远程缺血
木质 - 甲苯噻嗪 100 mg/ml （50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉剂远程缺血