远程缺血预处理：一种在啮齿类动物中的神经保护技术

摘要

远程缺血预处理（RIP）是一种使组织耐受损伤性应激的保护方法。我们已建立了一种通过充气血压计袖带5-10分钟对后肢实施远程缺血的方法。在啮齿类动物视网膜变性模型中，已证实RIP具有神经保护作用。

摘要

亚致死性缺血通过上调受损组织内的内源性机制，保护组织免受后续更严重缺血的损害。研究还表明，亚致死性缺血可以上调远端组织的保护机制。在哺乳动物的后肢施加短暂的缺血（5–10 分钟），可诱导大脑、肺、心脏和视网膜产生自我保护反应。这种现象被称为远程缺血预处理（RIP）。这是一种具有治疗前景的保护重要器官的方法，目前已经在心脏和脑损伤的临床试验中应用。本论文展示了一种可控且微创的方法，用于诱导肢体——特别是大鼠后肢——发生缺血。使用专为新生儿设计的血压袖带，连接手动血压计，对后肢上部施加 160 mmHg 的压力。通过使用皮肤温度检测探头记录因压力导致腿部动脉闭塞而引起的皮肤温度下降，以及袖带释放后温度的回升，来验证缺血效果。这种RIP方法可保护大鼠视网膜免受强光引起的损伤和退行性病变。

引言

大多数甚至可能是所有组织在面临代谢应激时，其存活能力可通过预先经历一段亚致死性缺血的条件处理而得到改善^1,2。缺血预处理（IP）在实际操作中是指在组织遭遇更严重的应激（如随后发生的缺血性损伤）之前，先使其暴露于亚致死性缺血状态。在动物模型中，IP对脑、视网膜、心脏和肺具有显著的保护作用^3-6。相应地，对脑卒中患者的研究观察发现，既往短暂性脑缺血发作与更好的临床预后之间存在关联^7,8。IP还能保护视网膜光感受器免受非缺血性损伤⁹。

IP在多种组织和损伤中的有效性表明，它激活了一种存在于所有组织中的细胞存活内在机制。心肌缺血预处理被认为可通过上调缺氧诱导因子（HIF）产生保护作用，HIF已知可通过腺苷释放或线粒体ATP敏感性钾通道的开放来调控多种代谢通路^10,11。腺苷释放和ATP敏感性钾通道也参与脑缺血过程，但迄今为止，针对缺血适应神经保护机制的研究主要集中在抗兴奋性毒性、抗凋亡和抗炎通路的调节上^12,13。总体而言，目前对缺血适应保护神经元的分子机制仍了解有限。

远程缺血预处理旨在通过在非关键组织中诱发缺血，来保护远端的重要器官（如心脏、脑、肺）。已有研究表明，在脑卒中动物模型中，利用后肢进行远程缺血预处理（RIP）具有神经保护作用^14-17。我们所描述的方法提供了一种简单、可靠且无创的RIP诱导方案。

绝大多数缺血再灌注（RIP）方案均涉及后肢，可能是因为位于后肢上部的股动脉易于识别和定位，便于进行手术夹闭和止血带应用。在研究脑和皮肤保护作用的侵入性肢体缺血实验中，缺血的诱导方法是将股动脉从腹股沟韧带处分离，随后夹闭股动脉^2,15,18。

通过肢体脉搏消失、氧合下降以及皮肤温度降低等变化，已证实由肢体袖带加压或股动脉夹闭引起的缺血。远程缺血可通过激光多普勒或超声多普勒检测脉搏消失来确认^17-19。尽管皮肤温度与缺血程度的关系呈非线性^20,21，但仍可作为多普勒技术的替代指标。准确的温度记录在实验室中十分常见，可轻松整合到远程缺血研究中。

一种替代股动脉夹闭手术的方法是使用止血带诱导缺血。止血带的应用可产生与血管夹闭相当的缺血效果；Kutchner 等 比较了侵入性股动脉夹闭与非侵入性止血带，发现这两种方法均可阻断肢体血流，并在皮瓣缺血的整形外科模型中减轻皮肤损伤¹⁸。在猪和人类中，对腿部或手臂使用袖带并将其压力升高至超过收缩压，已被证实可对缺血损伤起到保护作用^17,19,22。

诱导远程缺血的不同止血带方法包括使用血压袖带或弹性绷带^17,22,23然而，使用弹性绷带诱导缺血是一种不安全的方法，可能导致肢体压力不受控制，已有记录显示人体内的压力升高可超过500 mmHg²⁴此外，使用弹性绷带导致肢体缺血会在移除绷带后引起大鼠肌肉损伤²³通过伊文思蓝染料评估，一种 体内 肌纤维通透性标志物²⁵相比之下，可通过将血压袖带连接至血压计来向止血带输送可控压力^17,19,22,26.

本研究采用光损伤诱导的感光细胞退化轻度损伤模型，以验证远隔缺血预处理的神经保护作用。在光损伤前立即诱导远隔缺血，可有效防止后续的感光细胞退化，该结果已通过视网膜功能检测得到证实。随附视频将展示非侵入性远隔缺血处理的应用方法。

方案

伦理声明：本实验方案遵循悉尼大学动物护理指南（AEC #5657）。麻醉程序已获得动物伦理委员会批准（悉尼大学，AEC #5657）。

1. 仪器设备准备

1. 使用实时皮肤温度监测。打开计算机和数据采集硬件。
2. 启动温度记录软件，将温度设定范围调整为 30–35 °C，采样频率设为每 100 毫秒一次。
3. 可选：插入直肠温度计，以确保核心体温稳定在 37.5 °C。

2. 手动血压计的校准

1. 将新生儿臂套连接到血压计。对于体重为250-550 g的大鼠，使用2号袖带。可能需要适配器将袖带管路连接至血压计。
2. 通过松开排气阀或将袖带管路从适配器上断开，使袖带放气。确保管路中无残留压力，且压力计指针位于椭圆形/矩形区域内的零刻度位置。
3. 检查管路、压力计和袖带之间的压力连接。通过轻轻挤压充气球囊对袖带充气，直至压力计显示100 mmHg。确保压力保持稳定。通过缓慢打开排气阀使袖带放气。

3. 动物准备

注意：将要接受轻度损伤处理的动物需要在远端缺血前一晚进行暗适应。接受光损伤处理的动物需要暗环境饲养（12小时光照：12小时黑暗循环（5勒克斯））

1. 在清醒或麻醉状态下的啮齿类动物中进行远程缺血处理。确保动物具有健康的肌肉张力，可通过捏压后肢上部以确认存在足够的肌肉。远程缺血预处理（RIP）对轻度损伤的保护作用已在久坐不动的大鼠中测试至6月龄。
2. 远程缺血处理的麻醉准备
   1. 通过腹腔注射给予大鼠60 mg/kg的氯胺酮和5 mg/kg的赛拉嗪。通过伸展腿部并捏压足底皮肤来检查麻醉深度；若动物无反射，则表明已达到深度麻醉。在麻醉期间使用人工泪液以防止角膜干燥。
   2. 将大鼠置于加热垫或循环水浴加热管上，以维持恒定的体温37.5 °C。将大鼠置于俯卧位，使其后肢足垫朝上。可选择右侧或左侧肢体进行远程缺血处理。
3. 远程缺血处理的清醒准备
   注意：清醒动物实验需要两人配合操作。一人负责固定动物，另一人操作手动 血压计。操作者必须熟练掌握该操作流程，因为固定过程会增加操作人员受伤的风险。接受远程缺血处理的大鼠需预先适应手动固定。根据机构指南，手动固定时间应从最初30秒开始，在数周内逐步延长至最长5分钟 。对于未能适应手动固定的胆怯动物，应排除在清醒实验之外。最后需注意，手动固定可能引起动物应激反应（并可能对研究结果造成干扰），因此必须设置假处理对照组（仅佩戴袖带但不造成缺血），以准确解读远程缺血预处理（RIP）的研究结果。
   1. 将毛巾裁剪为15 cm × 30–50 cm的布片，将其短边垂直于大鼠脊柱方向放置，覆盖从头部至后肢上部区域。
   2. 将短边紧紧塞入大鼠躯干下方，并用剩余的长边包裹大鼠身体。将包裹好的动物以仰卧位夹于腋下固定；若使用左臂固定，则将大鼠右肢从毛巾中抽出。

4. 皮肤温度探头的应用

1. 伸展将要进行缺血处理的大鼠后肢，将皮肤探头放置于足垫上。调整皮肤探头位置，以最大化温度探头与皮肤之间的接触面积。用力将探头压入足垫，并用纸胶带固定探头。
2. 通过温度记录软件监测温度，检查皮肤探头的放置位置。确保皮肤温度维持在30–34 °C之间且保持稳定。持续监测皮肤温度1–2分钟。若温度不稳定或低于30 °C，需调整皮肤探头位置。

5. 远隔缺血

1. 放气袖带并确保气压阀已关闭。伸直动物后肢，将袖带松松地环绕在后肢上部。用食指和拇指伸展肢体，其余手指保持袖带处于松动位置。
2. 对麻醉状态下的动物，将袖带压力升至 160 mmHg；对清醒动物，则将袖带压力升至 180 mmHg。
   注意：大鼠在麻醉状态下的血压范围为 120–140 mmHg，清醒时可上升至 160 mmHg。当达到目标压力后，立即启动计时器并开始记录足部温度。
   注意：在压力恒定 5 分钟后，足部温度应下降 2 °C。
3. 在整个缺血过程中，保持袖带位于动物“膝”关节上方。数分钟后或当大鼠肢体活动时，袖带压力可能开始下降。
4. 以短促反复的方式按压充气球，以维持所需袖带压力。
5. 远隔缺血处理可持续进行 5 至 15 分钟。缺血-再灌注方案包括两个 5 分钟缺血期，中间间隔 5 分钟再灌注期。
6. 通过松开气压阀释放袖带压力。在整个缺血方案过程中监测温度变化。随后取下袖带。
7. 继续进行损伤相关实验。处于麻醉状态的动物需放置于加热垫上。持续监测动物直至其恢复自主活动能力。动物必须能够行走后方可返回饲养环境。

6. 轻度损伤——视网膜变性模型

1. 将动物暗适应过夜（12–15 小时）。在远端缺血预处理或假性远端缺血处理（动物束缚）后，立即将动物放入带有食物和水的有机玻璃饲养盒中。
2. 在上午9点开启位于有机玻璃饲养盒上方的荧光照明（1,000 lux），持续24小时。 光照暴露结束后，将动物转回弱光循环照明环境中饲养7天。

7. 远程缺血后处理程序

1. 采用视网膜电图（Electroretinogram, ERG）进行视觉功能评估：
   注意：ERG 设备设置和闪光刺激方案参照 Brandli 和 Stone²⁶ 的方法。
   1. 动物暗适应过夜（12–15 小时）。在微弱红光照明下，通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪进行麻醉（剂量分别为 60 mg/kg 和 5 mg/kg）。使用散瞳剂（硫酸阿托品 1.0%）和角膜麻醉剂（丙氧麻卡因 0.5%）。
   2. 立即在角膜上滴加角膜保湿剂（卡波姆聚合物）眼药水。每隔 20 分钟涂抹一次眼用凝胶，以维持角膜湿润。
   3. 在眼球周围缠绕一根松结的细线，以辅助获得稳定的 ERG 记录。使用直肠探头监测体温，并将动物体温维持在 37–37.5 °C。
   4. 将动物头部置于全视野积分球（Ganzfeld integrating sphere）内。
      注意：Ganzfeld 是一种完全可编程的光刺激系统，可通过 LED 向眼睛提供均匀的白色闪光。
   5. 使用自制的 4 mm 铂金正极电极轻触角膜，同时将一个直径为 2 mm 的 Ag/AgCl 环状电极插入动物口腔内记录视网膜电图。参考电极采用插入臀部皮下的不锈钢针电极。
   6. 信号记录时设置带通滤波为 0.3–1,000 Hz（-3 dB），采样频率为 2 kHz（AD Instruments）。在建立稳定的 ERG 记录后，先让动物进行 10 分钟的暗适应，再开始正式记录。
   7. 闪光刺激方案参照 Brandli 和 Stone²⁶ 之前描述的方法。
      1. 设定闪光持续时间（本研究使用 1–2 毫秒的闪光），并将闪光强度设置为 -4.4 至 2.0 log scot cd.s.m^-2。使用高强度闪光（2.0 log scot cd.s.m^-2，1 毫秒）来评估视网膜功能。本研究中重点比较对照组、光损伤组以及光损伤联合 RIP 处理组之间的差异。

8. TUNEL 检测

1. 通过腹腔注射过量苯巴比妥（100 mg/kg）处死动物。摘除眼球并用4%多聚甲醛固定。
2. 将眼球在PBS中清洗，随后在30%（w/v）蔗糖溶液中4°C过夜保护；将眼球包埋于OCT包埋剂中，使用冷冻切片机切成20 µm厚的矢状切片。
3. 按照Maslim 等²⁷的方案，对视网膜切片进行TUNEL染色，并辅以DAPI染色。
4. 使用荧光显微镜对视网膜的TUNEL阳性细胞进行计数。TUNEL阳性细胞计数区域为外核层（ONL），即视网膜最外层、含感光细胞核的区域。本研究中，每只眼球的计数重复三次，每组处理组包含5只眼球。
5. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对对照组、光损伤组及光损伤+RIP处理组的组间均值进行统计学比较。

结果

将血压袖带压力升高至160 mmHg以上可阻断后肢血流，如图1B所示。组织缺氧导致动物足部温度在缺血-再灌注实验中可靠地下降（图2）。足部温度（33 °C）低于核心体温，在袖带加压期间进一步降低（31 °C），当袖带放气后温度回升（32 °C）。对光照敏感的白化大鼠施加一次1,000 lux的光损伤，部分动物接受远隔缺血预处理，部分未接受。通过视网膜电图（ERG）记录并评估视网膜功能。

视网膜电图（ERG）是由视网膜内层和外层神经元对光刺激产生的电反应总和，如图3所示。ERG波形包含一个早期负向波峰，源于光转导过程（光闪后约10毫秒达到最低点），称为a波；以及一个来自内层视网膜的较大正向波峰（光闪后约80毫秒达到最高点），称为b波。在暗适应条件下，正常饲养的暗视大鼠对强度为2.0 log cd·s·m^-2的光闪刺激表现出显著的感光细胞和内层视网膜反应（图3A）。光损伤一周后，ERG记录显示其波幅相对于对照组显著降低，反映出感光...

讨论

使用手动血压计和袖带成功诱导了啮齿类动物后肢缺血，并对视网膜感光细胞提供了神经保护作用。该结果与缺血预处理可保护感光细胞免受光损伤的发现一致^9,28。

本质上，远程缺血会导致组织短暂缺氧。因此，远程缺血预处理与缺血预适应（也称为缺血耐受、低氧预处理）在许多方面具有相似性，某种程度上也类似于无氧运动。细胞在应对缺血刺激时，会释放大量蛋白质、核苷以及转录因子，这些物质可直接提供神经保护作用，或促使细胞对后续的代谢应激产生耐受性¹³。

文献中报道的远程缺血干预方案包含多种不同的持续时间与频率。 本实验室已在正常视网膜功能上测试了5分钟、10分钟以及2次×5分钟的缺血方案²⁶。在这些方案中，2次×5分钟的方案在正常大鼠中诱导出最大的ERG振幅变化，因此被选用于光损伤模型中的验证。在人类中，短暂且重复的5分钟缺血事件已被证明可预防复发性中风，在猪的实验性中风模型中也可减小梗死面积^17,22。然而，最适宜的缺血预处理持...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gold系列DuraShock手动汞柱式血压计	Welch Allyn	DS56	手动血压计
新生儿（2号尺寸）1管装，10个装	Welch Allyn	5082-102-1	肢体血压袖带
鲁尔锁接头	Welch Allyn	5082-178	新生儿袖带适配器
热敏电阻探头模块	AD Instruments	ML 309	皮肤温度测量单元
皮肤温度探头	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab四通道数据采集硬件	AD Instruments	PL 35044
带柔性探头的恒温毯系统	Harvard Apparatus	507222F
毛巾			可选：清醒状态下远程缺血处理
Isoflo - 100% 异氟烷（250 ml）	Abbot Animal Health	05260-05	可选：吸入麻醉下远程缺血处理
Ketamil - 氯胺酮 100 mg/ml（50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉下远程缺血处理
Xylium - 赛拉嗪 100 mg/ml（50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉下远程缺血处理